本发明属于生物,具体涉及一种椰子u6启动子及其应用。
背景技术:
1、椰子(学名: cocos nucifera l.)是重要的热带经济棕榈作物,目前我国椰子新品种的选育仍然是以传统的杂交育种为主,存在效率低、周期长的问题,严重地阻碍了椰子高产、优质育种的进程。随着生物技术的发展,以基因编辑技术为代表的分子育种技术在多种作物中的应用加快了新品种的培育,但椰子的相关研究尚待开展。
2、基因组编辑技术是一种研究基因功能的重要工具,它能精确修饰受体细胞染色体特定位点的基因,可以高效产生特定基因的功能失活突变体,能为生物功能基因组研究提供优质的遗传材料。sgrna和cas9是该技术系统的两个必要元件,其中sgrna在crispr/cas9基因组编辑过程中起到靶向结合目的基因位点的功能。研究显示,在crispr/cas9基因编辑体系中,受体细胞中sgrna的含量水平是影响编辑效率的重要因素之一,因此,可精确启动sgrna体内转录的聚合酶iii型启动子得到了广泛的关注。u6rna是一种参与mrna前体剪接的非编码rna,其对应的u6启动子是一类rna聚合酶iii型启动子,并已经在许多物种的crispr/cas9系统中得到了大量的应用。
3、虽然crispr/cas9基因组编辑技术目前已在多个物种中得到广泛地应用,但是针对椰子的基因编辑技术尚且未见报道。这主要是由于虽然在许多物种中u6启动子已有大量的报道,但外源的u6启动子通常并不适用。可见,缺少适用的u6启动子已成为目前椰子crispr/cas9基因编辑体系的限制因子。因此,筛选出在椰子中有功能活性的u6启动子对于椰子的基因育种技术发展具有积极的意义。
技术实现思路
1、为此,本发明所要解决的技术问题在于提供一种椰子u6启动子及应用。
2、为解决上述技术问题,本发明提供的一种椰子u6基因启动子cnu6,包括如seq idno.1所示的dna核苷酸序列。上述椰子u6基因启动子cnu6属于椰子u6snrna基因的rna聚合酶iii型启动子,来源于椰子( cocos nucifera l.)。
3、本发明还公开了一种椰子瞬时转化载体,即含有所述的椰子u6基因启动子cnu6。
4、具体的,所述瞬时转化载体为重组质粒pcnu6-mneongreen。
5、本发明还公开了一种克隆所述的椰子u6基因启动子cnu6的方法,包括如下步骤:
6、(1)以椰子海南高种叶片基因组dna为模板,设计如下含有可用于无缝克隆片段(下划线)cnu6序列的特异引物:
7、cnu6-f:
8、gtaaaacgacggccagtgccaagctctttttttttttttttttttttggt;
9、cnu6-r:
10、ccttgctcaccatcaaaccccatcctttagctttc;
11、(2)使用kod酶在20μl反应体系中进行pcr扩增;
12、(3)将扩增产物经琼脂糖电泳后根据目标条带大小切胶回收,即得含有301bp椰子u6基因启动子dna片段cnu6。
13、具体的,所述步骤(2)中,所述pcr扩增步骤的反应程序为:95℃预变性6min,95℃变性15s,57℃退火15s,72℃延伸5s,35个循环,72℃终延伸7min。
14、本发明还公开了一种构建所述的椰子原生质体瞬时转化载体的方法,包括如下步骤:
15、(a)用步骤[0011]至[0016]方法准备cnu6片段。
16、(b)设计如下含有可用于无缝克隆片段(下划线)mneongreen荧光蛋白序列的特异引物:
17、cnu6-neon f:
18、aggatggggtttgatggtgagcaagggcgagga;
19、cnu6-neon r:
20、aattcgagctcggtacccggggatcttacttgtacagctcgtccatgcc;
21、使用kod酶在20μl反应体系中进行pcr扩增mneongreen片段;
22、将扩增产物经琼脂糖电泳后根据目标条带大小切胶回收,即得含有711bp的mneongreen基因片段。
23、具体的,所述步骤[0025]中,pcr扩增步骤的反应程序为:95℃预变性6min,95℃变性15s,57℃退火15s,72℃延伸10s,35个循环,72℃终延伸7min。
24、(c)用hindⅲ和bamhi双酶切pun1301载体,回收12088bp载体骨架片段。
25、(d)采用无缝克隆方法将步骤(a)(b)(c)中片段cnu6、mneongreen、pun1301连接获得含有椰子cnu6启动子驱动荧光蛋白的表达载体pcnu6-mneongreen。
26、将上述载体转化至大肠杆菌dh5α中扩繁获得高浓度质粒用于椰子原生质体转化。
27、本发明首次在椰子中克隆获得椰子rna聚合酶iii型启动子即椰子内源u6启动子cnu6。
28、本发明首次将克隆的椰子内源rna聚合酶iii型启动子连接驱动mneongreen荧光蛋白,通过瞬时转化椰子叶片原生质体验证了该启动子的驱动荧光蛋白表达的可行性,为后续筛选、验证其它椰子内源u6启动子提供一种快速有效的方法。
1.一种椰子u6启动子cnu6,其特征在于,该启动子的核酸序列如seq id no.1所示。
2.权利要求1所述的椰子u6启动子cnu6在驱动mneongreen绿色荧光蛋白基因在椰子原生质体表达中的应用。
3.一种椰子瞬时转化载体,含有权利要求1所述的椰子u6启动子cnu6。
4.含有权利要求1所述的椰子u6启动子cnu6的重组载体、表达盒或重组菌。
5.权利要求4所述的重组载体、表达盒、重组菌在驱动mneongreen绿色荧光蛋白基因在椰子原生质体转化中的应用。
6.一种mneongreen绿色荧光蛋白表达载体,其特征在于,该表达载体是通过将权利要求1所述椰子u6启动子cnu6与mneongreen基因连接后,克隆至植物表达载体中制备得到。
7.根据权利要求6所述的mneongreen绿色荧光蛋白表达载体,其特征在于,所述植物表达载体为pun1301。
8.权利要求6或7所述的mneongreen绿色荧光蛋白表达载体在驱动mneongreen基因在基于椰子原生质体瞬时转化筛选u6启动子中的应用。
9.一种克隆权利要求1所述的椰子u6启动子cnu6的方法,包括如下步骤:
10.一种构建椰子原生质体瞬时转化载体的方法,包括如下步骤: