本发明属于细胞培养，具体涉及一种3d混合细胞微球的制备方法及其应用。
背景技术：
1、呼吸道是人体直接对外界开放的器官之一，鼻腔气道上皮细胞作为呼吸道的门户是人体一道重要的生理防御屏障，在抵御病原微生物入侵及清除有毒物质等方面起着重要的作用。气道和呼吸肺泡源自原始内胚层的不同原基，即气管原基和肺原基，两个原基中含有不同的干细胞，分别称为近端和远端干细胞。近端干细胞即气道基底干细胞，远端干细胞包括细支气管基底干细胞、呼吸性细支气管与肺泡导管连接处的干细胞以及肺泡ⅱ型细胞。已有研究证明了远端的鼻腔黏膜基底层有上皮干细胞，表达p63、krt5和ngfr等干性表面marker,可以分离并在体外扩增培养。当在气液界面条件下诱导，鼻腔黏膜基底层上皮干细胞可以分化成由纤毛细胞、杯状细胞和基底层细胞构成的气道假复层上皮组织，但目前其培养方式受限，出现体外增殖不佳和易凋亡等难题。
2、间充质干细胞是一种具有旁分泌、免疫调节和多向分化潜能的成体干细胞，与胚胎干细胞相比有免疫应答低、成瘤风险低、无伦理问题等优势。目前有部分研究将间充质干细胞与造血干细胞、内皮细胞和足细胞等其他类型细胞进行联合3d培养，发现可增强其对疾病模型的治疗功效。然而，目前治疗呼吸系统的干细胞的制备方法多采用细胞悬液，其具有易流动、细胞结构单一的特点，导致其不容易定植于病灶部位发挥效果。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种3d混合细胞微球的制备方法及其应用，所述3d混合细胞微球有利于嗅黏膜基底干细胞和嗅黏膜间充质干细胞的相互支持，提高其增殖和抗凋亡能力，更易于定植于病灶部位，提高所述3d混合细胞微球的抗凋亡能力。
2、本发明提供了一种3d混合细胞微球的制备方法，包括如下步骤：将嗅黏膜基底干细胞和嗅黏膜间充质干细胞混合接种于低吸附培养板中进行混合培养，得到所述3d混合细胞微球。
3、优选的，所述低吸附培养板包括低吸附六孔板。
4、优选的，所述嗅黏膜基底干细胞和嗅黏膜间充质干细胞的接种密度比例为1:1。
5、优选的，所述混合培养的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％，湿度为80～99％。
6、优选的，所述混合培养的培养基包括含有5～20％v/v fbs的dmem/f12完全培养基。
7、优选的，所述嗅黏膜基底干细胞和嗅黏膜间充质干细胞的接种量分别为(4～5)×107个/孔。
8、优选的，所述嗅黏膜基底干细胞的制备方法包括：将鼻黏膜组织块接种于嗅黏膜基底干细胞培养基中进行细胞培养，每2～5天更换一次新的培养基直至细胞密度达到90％以上时，得到所述嗅黏膜基底干细胞。
9、优选的，所述嗅黏膜基底干细胞培养基包括含有10％v/v fbs的dmem高糖完全培养基。
10、优选的，所述鼻黏膜组织块的体积为0.5～1.5mm3；所述细胞培养的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％，湿度为80～99％。
11、本发明还提供了上述技术方案所述的制备方法制备得到的3d混合细胞微球在提高嗅黏膜间充质干细胞和/或嗅黏膜基底干细胞的抗凋亡能力中的应用。
12、有益效果：
13、本发明提供了一种3d混合细胞微球的制备方法，本发明将嗅黏膜基底干细胞和嗅黏膜间充质干细胞混合接种于低吸附培养板中进行混合培养，得到3d混合细胞微球；两种细胞在3d混合培养体系中对所述嗅黏膜基底干细胞和嗅黏膜间充质干细胞的状态具有一定的支持作用，两种细胞相互支撑，进一步提高其生物学特性，更易于定植于病灶部位，进而提高3d混合细胞微球的抗凋亡能力；此种制备方法制备得到的3d混合细胞微球为干细胞治疗呼吸系统疾病提供了良好的应用前景，为将嗅黏膜来源的干细胞用于再生医学领域提供了基础。
1.一种3d混合细胞微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将嗅黏膜基底干细胞和嗅黏膜间充质干细胞混合接种于低吸附培养板中进行混合培养，得到所述3d混合细胞微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述低吸附培养板包括低吸附六孔板。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述嗅黏膜基底干细胞和嗅黏膜间充质干细胞的接种密度比例为1:1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合培养的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％，湿度为80～99％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述混合培养的培养基包括含有5～20％v/v fbs的dmem/f12完全培养基。
6.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述嗅黏膜基底干细胞和嗅黏膜间充质干细胞的接种量分别为(4～5)×107个/孔。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述嗅黏膜基底干细胞的制备方法包括：将鼻黏膜组织块接种于嗅黏膜基底干细胞培养基中进行细胞培养，每2～5天更换一次新的培养基直至细胞密度达到90％以上时，得到所述嗅黏膜基底干细胞。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述嗅黏膜基底干细胞培养基包括含有10％v/v fbs的dmem高糖完全培养基。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述鼻黏膜组织块的体积为0.5～1.5mm3；所述细胞培养的温度为37℃，二氧化碳的浓度为5％，湿度为80～99％。
10.权利要求1～9任一项所述的制备方法制备得到的3d混合细胞微球在提高嗅黏膜间充质干细胞和/或嗅黏膜基底干细胞的抗凋亡能力中的应用。