本发明涉及猪体外胚胎培养，具体涉及添加小分子物质x1的早期胚胎培养液和提高猪体细胞核移植胚胎质量的早期胚胎培养方法。
背景技术：
1、体细胞核移植（scnt）技术可使高度分化的体细胞通过重编程获得全能性，从而发育成新的动物个体。但长期以来scnt技术的克隆效率极低，主要表现在胚胎早期发育的高损率、克隆动物在孕期或围产期死亡、克隆动物出生后的发育异常等方面，这严重阻碍着该技术的推广应用。当前广泛认为，组蛋白修饰异常、供体细胞未能被充分重编程和合子基因组激活障碍是导致scnt技术克隆效率低下的主要原因。
2、x染色体失活（x-chromosome inactivation，xci）是指雌性哺乳动物会通过失活一条ｘ染色体来达到与雄性哺乳动物性染色体基因剂量表达基本一致。xci主要是由 xist（x-inactive specific transcript）表达调控的， xist高表达导致全ｘ染色体范围内的ｘ连锁基因表达下调，从而导致组蛋白修饰异常和xci异常，例如scnt雌性胚胎一些卵裂球两个 xist等位点都高表达，并且失活两条ｘ染色体，雄性克隆胚胎中一些卵裂球唯一的一条ｘ染色体也高表达 xist，并且发生失活。
3、实际过程中很多克隆动物由于重编程错误导致 xist表达异常和xci异常。克隆牛和克隆猪的死胎当中都检测到了ｘ连锁基因表达异常。但xci异常并非导致胚胎发育异常、囊胚数减少，从而影响克隆胚胎质量和效率的唯一原因，例如在猪克隆胚胎（猪卵母孤雌胚胎）早期胚胎培养中存在x染色体失活延迟导致的囊胚质量较差的问题（参见：cn118813526a）。
4、有研究指出（参见：targeting xist with compounds that disrupt rnastructure and x inactivation），小分子物质x1可以在体外和体内特异性结合xist的repa结构域。而小分子物质x1的结合减少了repa的构象空间，取代了同源相互作用的蛋白质因子（prc2和spen），抑制组蛋白h3k27me3，并抑制了x染色体失活的启动。但该研究中小分子物质x1的处理对象为胚胎干细胞，且处理后发现会影响雌性胚胎干细胞的胚状体生长，同时仅关注到了x染色体失活本身，而与囊胚率（及早期胚胎发育质量）无关联。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种提高猪体细胞核移植胚胎质量的胚胎培养方法及胚胎培养液，通过在体外早期胚胎培养液中加入小分子物质x1，提高猪体细胞核移植（scnt）胚胎发育质量。
2、为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
3、一方面，提供一种胚胎培养方法，包括以下步骤：
4、构建猪scnt胚胎，将该猪scnt胚胎移入猪早期胚胎培养液中并添加4～15 μmol·l-1的小分子物质x1，然后培养所述猪scnt胚胎至囊胚时期，所述猪早期胚胎培养液含有1～2 mmol·l-1（即1～2 mm）谷氨酰胺和5～8 mmol·l-1（即5～8 mm）亚牛磺酸。
5、优选的，所述小分子物质x1在猪早期胚胎培养液中添加至终浓度为5～10 μmol·l-1。小分子物质x1抑制了猪scnt胚胎组蛋白h3k27me3，并减少了猪scnt胚胎x染色体失活异常的发生，提高猪scnt胚胎发育质量。
6、优选的，所述小分子物质x1在猪早期胚胎培养液中添加至终浓度为5～8 μmol·l-1。加入小分子物质x1可以提高囊胚细胞数和囊胚率。
7、优选的，所述猪早期胚胎培养液为添加有1～2 mmol·l-1谷氨酰胺和5～8 mmol·l-1亚牛磺酸的pzm-3。
8、优选的，所述猪scnt胚胎的培养条件还包括：38.0～38.5°c、4.8%～5.2% co2、94.8%～95.2% n2，及饱和湿度；或者，38.0～38.5°c、4.5%～5.5% co2、94.5%～95.5% n2，及饱和湿度。
9、优选的，所述构建猪scnt胚胎具体包括以下步骤：将猪卵母细胞在体外成熟培养液中培养44～46h，然后与猪体细胞通过核移植形成重构胚，将重构胚进行融合处理，得到待培养的猪scnt胚胎（例如重构胚经过电融合处理并恢复后即可移入猪早期胚胎培养液中）。
10、优选的，所述猪体细胞选自提前饥饿的猪成纤维细胞（通常是将猪成纤维细胞的培养液在体细胞核移植前22～24h换成不含血清的细胞培养液，从而进行饥饿处理）。
11、另一方面，提供一种猪scnt胚胎培养液，该胚胎培养液包括基础培养基和添加至该基础培养基中的终浓度为4～15 μmol·l-1的小分子物质x1。
12、优选的，所述胚胎培养液包括基础培养基和添加至该基础培养基中的终浓度为5～10 μmol·l-1的小分子物质x1。
13、优选的，所述胚胎培养液包括基础培养基和添加至该基础培养基中的终浓度为5～8 μmol·l-1的小分子物质x1。
14、优选的，所述基础培养基包括以下成分：107～109 mmol·l-1nacl、9～11 mmol·l-1kcl、0.33～0.36 mmol·l-1kh2po4、0.35～0.45 mmol·l-1mgso4、25～26 mmol·l-1nahco3、0.18～0.22 mmol·l-1丙酮酸钠、1.8～2.2 mmol·l-1五水合乳酸钙、1.8%～2.1%（v/v）必需氨基酸溶液bme、0.9%～1.1%（v/v）非必需氨基酸溶液mem、2.8～3.2 g·l-1bsa和9.5～10.5 μg·ml-1庆大霉素。
15、优选的，所述基础培养基选自以下猪早期胚胎培养液：pzm-3、或改良的pzm-3。
16、优选的，所述改良的pzm-3为添加有1～2 mmol·l-1谷氨酰胺和5～8 mmol·l-1亚牛磺酸的pzm-3。
17、本发明的有益效果体现在：
18、本发明以添加到猪早期胚胎培养液中一定浓度范围的小分子物质x1（该小分子物质x1已知具有特异性结合xist的repa结构域的活性），有效的阻止猪scnt胚胎x染色体失活异常，并提高猪scnt胚胎发育质量。
1.一种胚胎培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
2. 根据权利要求1所述一种胚胎培养方法，其特征在于：所述小分子物质x1在猪早期胚胎培养液中添加至终浓度为5～10 μmol·l-1。
3. 根据权利要求1所述一种胚胎培养方法，其特征在于：所述小分子物质x1在猪早期胚胎培养液中添加至终浓度为5～8 μmol·l-1。
4. 根据权利要求1所述一种胚胎培养方法，其特征在于：所述猪早期胚胎培养液为添加有1～2 mmol·l-1谷氨酰胺和5～8 mmol·l-1亚牛磺酸的pzm-3。
5.根据权利要求1所述一种胚胎培养方法，其特征在于：所述猪scnt胚胎的构建具体包括以下步骤：将猪卵母细胞在体外成熟培养液中培养44～46h，然后与猪体细胞通过核移植形成重构胚，将重构胚进行融合处理，得到待培养的猪scnt胚胎。
6. 一种猪scnt胚胎培养液，其特征在于：该胚胎培养液包括基础培养基和添加至该基础培养基中的终浓度为4～15 μmol·l-1的小分子物质x1。
7. 根据权利要求6所述一种猪scnt胚胎培养液，其特征在于：所述胚胎培养液包括基础培养基和添加至该基础培养基中的终浓度为5～10 μmol·l-1的小分子物质x1。
8. 根据权利要求6所述一种猪scnt胚胎培养液，其特征在于：所述胚胎培养液包括基础培养基和添加至该基础培养基中的终浓度为5～8 μmol·l-1的小分子物质x1。
9. 根据权利要求6所述一种猪scnt胚胎培养液，其特征在于：所述基础培养基包括以下成分：107～109 mmol·l-1的nacl、9～11 mmol·l-1的kcl、0.33～0.36 mmol·l-1的kh2po4、0.35～0.45 mmol·l-1的mgso4、25～26 mmol·l-1的nahco3、0.18～0.22 mmol·l-1的丙酮酸钠、1.8～2.2 mmol·l-1的五水合乳酸钙、1.8%～2.1%的必需氨基酸溶液bme、0.9%～1.1%的非必需氨基酸溶液mem、2.8～3.2 g·l-1的bsa和9.5～10.5 μg·ml-1的庆大霉素。
10. 根据权利要求6所述一种猪scnt胚胎培养液，其特征在于：所述基础培养基选自pzm-3或改良的pzm-3，所述改良的pzm-3为添加有1～2 mmol·l-1谷氨酰胺和5～8 mmol·l-1亚牛磺酸的pzm-3。