本公开提供了用于同种异体基因疗法的双顺反子构建体。
背景技术：
1、基因疗法(特别是使用表达嵌合抗原受体(car)的免疫细胞的适应性细胞免疫疗法)已经显示出前景，特别是用于治疗恶性肿瘤。过继性细胞疗法是指分离免疫细胞，随后进行离体操作并随后递送至患者作为治疗性干预。car将抗体的特异性与效应细胞的信号传导结构域和共刺激分子相结合。当通过非病毒或病毒转导在免疫细胞表面上进行组成型表达时，car使得效应细胞能够以抗原特异性方式识别靶标。然后，设计成靶向特定肿瘤相关抗原(taa)的car可用于抗癌疗法。
2、大多数临床评估的car产品来源于自体免疫细胞，即从将进行疗法的患者采集的细胞。自体(患者来源的)car t细胞范例具有几个重要优点，包括在供体与受者之间没有免疫学错配的情况下输注car工程细胞产品。然而，此策略具有显著的临床和经济限制，例如进行成功白细胞分离并从患者(例如，患有复发/难治性恶性疾病的患者)获得细胞的设施的可用性、细胞往返于处理中心的运输、细胞的质量(其可能已经受到先前的激进的癌症定向疗法的负面影响)，以及在临床使用前制造和测试细胞所需的时间。时间延迟可能是显著的，特别是在具有侵袭性复发/耐药性癌症的患者中，他们有临床恶化的风险，这可能排除继续进行car细胞疗法。此外，不能保证产生细胞产品，并且对于那些可以成功产生产品的患者，一部分产品具有有限的短期或长期功效。这可能部分是由于癌症患者的自体免疫细胞活力差，特别是在激进的癌症定向疗法之后。最后，自体细胞疗法是针对个体患者进行的，并且与高昂的成本相关，限制了这种疗法的更广泛应用。
3、使用同种异体细胞，即从不是最终将接受基因疗法的受试者的健康供体获得的细胞，具有克服这些限制中的许多限制的潜力。例如，同种异体细胞的使用使car工程化细胞产品的产生具有成本效益、容易获得并提供更高质量的产品。健康的供体细胞赋予均匀的起始材料，使产生的细胞产品的制造和性能更可预测。同种异体疗法具有提供“现成的”免疫治疗方案的潜力，使得单次制造运行可对几名患者进行给药并且/或者对个体患者进行多次给药。此外，通过增加生产规模和创建来自健康供体的制造的car免疫细胞库，每位患者的成本将降低，同时产品的可及性将增加。然而，同种异体car细胞产品可能潜在地诱导移植物抗宿主病或使宿主遭受免疫介导的排斥的风险，从而限制治疗效果。
技术实现思路
1、本公开提供了一种双顺反子多核苷酸，该双顺反子多核苷酸编码(i)治疗剂和(ii)免疫监视掩蔽分子(ismm)，其中ismm包含β-2-微球蛋白(b2m)非功能性多肽和人白细胞抗原(hla)。在一些方面，治疗剂是嵌合抗原受体(car)，该嵌合抗原受体(car)包含特异性结合靶细胞上的肿瘤抗原上的表位的抗原结合结构域。在一些方面，抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合部分。在一些方面，肿瘤抗原是二唾液酸神经节苷脂gd2。在一些方面，抗体是达妥昔单抗或其抗原结合部分。参见www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2015/125516s000lbl.pdf，其通过引用整体并入本文。
2、在一些方面，抗体是包含达妥昔单抗的重链(vh)的可变区和轻链(vl)的可变区的单链可变片段(scfv)。在一些方面，达妥昔单抗scfv包含seq id no:22所示的蛋白质序列。在一些方面，抗原结合结构域与达妥昔单抗交叉竞争。在一些方面，抗原结合结构域与达妥昔单抗结合相同的表位。在一些方面，抗原结合结构域包含达妥昔单抗的vh cdr3。在一些方面，抗原结合结构域还包含vh cdr1和vh cdr2。在一些方面，vh cdr1包含达妥昔单抗的vh cdr1并且/或者vh cdr2包含达妥昔单抗的vh cdr2。在一些方面，抗原结合结构域还包含vl cdr1、vl cdr2和/或vl cdr3。在一些方面，vl cdr1包含达妥昔单抗的vl cdr1，vlcdr2包含达妥昔单抗的vl cdr2，并且/或者vl cdr3包含达妥昔单抗的vl cdr3。在一些方面，抗原结合结构域包含(i)seq id no:59的vh cdr1；seq id no:63的vh cdr2；和seq idno:67的vh cdr3；和/或seq id no:71的vl cdr1；seq id no:75的vl cdr2；和seq id no:79的vl cdr3；或(ii)seq id no:60的vh cdr1；seq id no:64的vh cdr2；和seq id no:68的vh cdr3；和/或seq id no:72的vl cdr1；seq id no:76的vl cdr2；和seq id no:80的vlcdr3；或(iii)seq id no:61的vh cdr1；seq id no:65的vh cdr2；和seq id no:69的vhcdr3；和/或seq id no:73的vl cdr1；seq id no:77的vl cdr2；和seq id no:81的vlcdr3；或(iv)seq id no:62的vh cdr1；seq id no:66的vh cdr2；和seq id no:70的vhcdr3；和/或seq id no:74的vl cdr1；seq id no:78的vl cdr2；和seq id no:82的vlcdr3；或(v)seq id no:53的vh cdr1；seq id no:54的vh cdr2；和seq id no:55的vhcdr3；和/或seq id no:56的vl cdr1；seq id no:57的vl cdr2；和seq id no:58的vlcdr3。
3、在一些方面，抗原结合结构域包含vh和vl，并且其中vh包含seq id no:44所示的蛋白质序列或者vl包含seq id no:46所示的蛋白质序列。在一些方面，抗原结合结构域包含vh和vl，vh包含seq id no:44所示的蛋白质序列，vl包含seq id no:46所示的蛋白质序列。在一些方面，vh和vl经由接头连接。在一些方面，vh和vl以vh-接头-vl或vl-接头-vh构象连接。在一些方面，接头是gly4-ser接头。在一些方面，gly4-ser接头包含seq id no:84所示的序列。在一些方面，car构建体被设计为标准car、拆分型car、关闭开关型car、开启开关型car、第一代car、第二代car、第三代car或第四代car。
4、在一些方面，抗原结合结构域是lg nar、fab、fab'、f(ab)'2、f(ab)'3、fv、单链可变片段(scfv)、双scfv、(scfv)2、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、胞内抗体、二硫键稳定的fv蛋白(dsfv)、单抗体、纳米抗体、亲和体、darpin、单体抗体、adnectin、α体或设计的结合剂。在一些方面，car构建体还包含跨膜结构域、胞内结构域和位于抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔区。在一些方面，car构建体的胞内结构域是来源于cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd66d或cd28的信号传导结构域。在一些方面，car构建体的胞内结构域来源于cd28。在一些方面，car构建体的跨膜结构域来源于cd28。在一些方面，跨膜结构域通过接头与胞内结构域连接。在一些方面，car构建体的胞内结构域和跨膜结构域来源于相同分子。在一些方面，跨膜和胞内结构域来源于cd28。在一些方面，car构建体的间隔区是cd8α铰链区。在一些方面，car构建体还包含共刺激结构域或其组合。在一些方面，共刺激结构域来源于2b4、hvem、icos、lag3、dap10、dap12、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40(cd134)、cd30、cd40、icos(cd278)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、cd3ζ及其组合。在一些方面，共刺激结构域包含4-1bb激活结构域。在一些方面，共刺激结构域包含cd3ζ激活结构域。在一些方面，共刺激结构域包含4-1bb激活结构域和cd3ζ激活结构域。在一些方面，car构建体包含seq id no:19所示的核酸序列。在一些方面，car构建体编码seq id no:20所示的蛋白质。
5、在一些方面，治疗剂包括抗体或其抗原结合部分、酶、受体、细胞因子、凝血因子或激素。在一些方面，b2m非功能性多肽是b2m非功能性片段。在一些方面，b2m非功能性多肽是b2m非功能性变体。在一些方面，hla是hla-e或hla-g。在一些方面，b2m多肽和hla通过接头连接。在一些方面，接头是gly4-ser接头。在一些方面，gly4-ser接头包含seq id no:84所示的序列。在本公开的双顺反子多核苷酸的一些方面，(i)编码治疗剂的核酸序列和编码ismm的核酸序列通过2a(例如p2a)元件连接；或者，(ii)编码治疗剂的核酸序列和编码ismm的核酸序列通过内部核糖体进入位点(ires)连接。
6、在一些方面，编码治疗剂的核酸序列包含seq id no:5所示的序列。在一些方面，编码ismm的核酸序列包含seq id no:6所示的序列。在一些方面，编码治疗剂的核酸序列包含seq id no:5所示的序列，编码ismm的核酸序列包含seq id no:6所示的序列。在一些方面，双顺反子多核苷酸选自由以下组成的组：双顺反子构建体1、双顺反子构建体2、双顺反子构建体3、双顺反子构建体4、双顺反子构建体5、双顺反子构建体6、双顺反子构建体7或双顺反子构建体8。在一些方面，双顺反子多核苷酸还包含与插入位点上游的b2m基因序列互补的5'序列和与插入位点下游的b2m基因序列互补的3'序列。在一些方面，5'序列和3'序列具有相同的长度。在一些方面，5'序列和3'序列的长度为至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约600个核苷酸、至少约700个核苷酸、至少约800个核苷酸、至少约900个核苷酸、至少约1000个核苷酸。在一些方面，双顺反子多核苷酸选自由以下组成的组：完全供体1、完全供体2、完全供体3、完全供体4、完全供体5、完全供体6、完全供体7或完全供体8。
7、在一些方面，双顺反子多核苷酸插入b2m基因中，并且b2m基因中的插入使基因失活。在一些方面，b2m基因中的插入由核酸酶介导。在一些方面，b2m基因中的插入由crispr/cas核酸酶介导。在一些方面，核酸酶是crispr/cas9。
8、在一些方面，b2m基因中的插入位点在内含子位置处。在一些方面，b2m基因中的插入位点在内含子-外显子连接位置处。在一些方面，b2m基因中的插入位点在外显子位置处。在一些方面，外显子位置在外显子1处。在一些方面，插入位点是位点1(actctctctttctggcctgg；seq id no:1)。在一些方面，外显子位置在外显子2处。在一些方面，插入位点是位点2(agtcacatggttcacacggc；seq id no:2)或位点3(cacagcccaagatagttaag；seq id no:3)。在一些方面，外显子位置在外显子3处。在一些方面，插入位点是位点4(gagacatgtaagcagcatca；seq id no:4)。在一些方面，多核苷酸是dna分子或rna分子。在一些方面，car是诱导型car。
9、本公开还提供了一种载体，该载体包含本文公开的双顺反子多核苷酸，该双顺反子多核苷酸与调控元件可操作地连接。在一些方面，载体是病毒载体、哺乳动物载体或细菌载体。在一些方面，载体是逆转录病毒载体。在一些方面，病毒载体选自由以下组成的组：腺病毒载体、慢病毒、仙台病毒载体、杆状病毒载体、爱泼斯坦-巴尔病毒载体、乳多空病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杂合载体和腺相关病毒(aav)载体。
10、本公开还提供了一种组合物，该组合物包含本文公开的双顺反子多核苷酸或包含本文公开的双顺反子多核苷酸的载体。还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含(i)本文公开的双顺反子多核苷酸，(ii)载体，该载体包含本文公开的双顺反子多核苷酸，或(iii)组合物，该组合物包含本文公开的双顺反子多核苷酸或包含本文公开的双顺反子多核苷酸的载体。
11、还提供了一种经遗传修饰以表达治疗剂和ismm的细胞，该细胞包含(i)本文公开的双顺反子多核苷酸，(ii)载体，该载体包含本文公开的双顺反子多核苷酸，或(iii)组合物，该组合物包含本文公开的双顺反子多核苷酸或包含本文公开的双顺反子多核苷酸的载体。在一些方面，细胞是t细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、ilc细胞、巨噬细胞或抗原呈递细胞。在一些方面，细胞是同种异体的。在一些方面，经遗传修饰的细胞是试剂盒或制品的一部分。
12、本公开还提供了一种组合物，该组合物包含(i)本文公开的双顺反子多核苷酸，(ii)载体，该载体包含本文公开的双顺反子多核苷酸，(iii)组合物，该组合物包含本文公开的双顺反子多核苷酸或包含本文公开的双顺反子多核苷酸的载体，或细胞，该细胞包含(i)、(ii)或(iii)。在一些方面，这种组合物用于治疗需要疗法的受试者。在一些方面，疗法是car疗法。在一些方面，组合物是试剂盒或制品的一部分。
13、本公开还提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症的药物组合物，其中该药物组合物包含经遗传修饰以表达治疗剂和ismm的细胞，该细胞包含(i)本文公开的双顺反子多核苷酸，(ii)载体，该载体包含本文公开的双顺反子多核苷酸，或(iii)组合物，该组合物包含本文公开的双顺反子多核苷酸或包含本文公开的双顺反子多核苷酸的载体。在一些方面，药物组合物是试剂盒或制品的一部分。
14、本公开还提供了一种用于治疗有需要的受试者的癌症的药物组合物，其中该药物组合物包含
15、(i)本文公开的双顺反子多核苷酸；
16、(ii)包含本文公开的双顺反子多核苷酸的载体；
17、(iii)组合物，该组合物包含本文公开的双顺反子多核苷酸或包含本文公开的双顺反子多核苷酸的载体；或
18、(iv)细胞，该细胞包含(i)、(ii)或(iii)中的任一项。
19、还提供了以下项作为药物的用途：
20、(i)本文公开的双顺反子多核苷酸；
21、(ii)载体，该载体包含(i)的双顺反子多核苷酸；
22、(iii)组合物，该组合物包含(i)或(ii)；
23、(iv)试剂盒，该试剂盒包含(i)、(ii)或(iii)；
24、(v)细胞，该细胞包含(i)、(ii)或(iii)中的任一项；
25、(vi)组合物，该组合物包含(v)；
26、(vii)药物组合物，该药物组合物包含(i)、(ii)、(iii)、(v)或(vi)；或
27、(viii)试剂盒，该试剂盒包含(v)、(vi)或(vii)。
28、还提供了以下项作为用于治疗有需要的受试者的癌症或炎症性疾病或病况的药物的用途：
29、(i)本文公开的双顺反子多核苷酸；
30、(ii)载体，该载体包含(i)的双顺反子多核苷酸；
31、(iii)组合物，该组合物包含(i)或(ii)；
32、(iv)试剂盒，该试剂盒包含(i)、(ii)或(iii)；
33、(v)细胞，该细胞包含(i)、(ii)或(iii)中的任一项；
34、(vi)组合物，该组合物包含(v)；
35、(vii)药物组合物，该药物组合物包含(i)、(ii)、(iii)、(v)或(vi)；或
36、(viii)试剂盒，该试剂盒包含(v)、(vi)或(vii)。
37、还提供了以下项用于制造用于治疗有需要的受试者的癌症或炎症性疾病或病况的药物的用途：
38、(i)本文公开的双顺反子多核苷酸；
39、(ii)载体，该载体包含(i)的双顺反子多核苷酸；
40、(iii)组合物，该组合物包含(i)或(ii)；
41、(iv)试剂盒，该试剂盒包含(i)、(ii)或(iii)；
42、(v)细胞，该细胞包含(i)、(ii)或(iii)中的任一项；
43、(vi)组合物，该组合物包含(v)；
44、(vii)药物组合物，该药物组合物包含(i)、(ii)、(iii)、(v)或(vi)；或
45、(viii)试剂盒，该试剂盒包含(v)、(vi)或(vii)。
46、本公开还提供了一种刺激受试者对靶细胞群体或组织的t细胞介导的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含本文公开的双顺反子多核苷酸的细胞。还提供了一种在有需要的受试者中提供抗肿瘤免疫的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含本文公开的双顺反子多核苷酸的细胞。本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含本文公开的双顺反子多核苷酸的细胞。
47、本公开提供了一种制备用于疗法的细胞群体的方法，该方法包括用本文公开的双顺反子多核苷酸、载体或组合物转导从受试者分离的细胞群体。在一些方面，转导包括在合适的条件下培养细胞。在一些方面，疗法是同种异体细胞疗法。
48、本公开提供了一种在被诊断患有癌症或炎症性疾病的受试者中产生持久的基因工程化细胞群体的方法，该方法包括向受试者施用经基因工程化以表达本文公开的双顺反子多核苷酸的细胞。还提供了一种扩增被诊断患有癌症或炎症性疾病的受试者中的基因工程化细胞群体的方法，该方法包括向受试者施用经基因工程化以表达本文公开的双顺反子多核苷酸的细胞。在一些方面，细胞是t细胞。在一些方面，t细胞是同种异体t细胞。在一些方面，受试者是人类受试者。
49、本公开还提供了一种用以产生用于基因疗法的同种异体细胞的方法，该方法包括将包含编码治疗剂的核酸和编码ismm的核酸的双顺反子构建体插入b2m基因中，其中双顺反子构建体的插入使b2m基因失活。在一些方面，编码ismm的核酸包含编码选自hla-e或hla-g或其功能性变体的hla的核酸。在一些方面，基因疗法是car-t疗法。在一些方面，b2m基因中的插入位点选自位点1(actctctctttctggcctgg；seq id no:1)；位点2(agtcacatggttcacacggc；seq id no:2)；位点3(cacagcccaagatagttaag；seq id no:3)；或位点4(gagacatgtaagcagcatca；seq id no:4)。在一些方面，插入位点包含位于位点1、位点2、位点3或位点3的5'端或3'端上游或下游约10个核苷酸、约20个核苷酸、约30个核苷酸、约40个核苷酸、约50个核苷酸、约60个核苷酸、约70个核苷酸、约80个核苷酸、约90个核苷酸或约100个核苷酸的序列。在一些方面，插入位点是与位点1、位点2、位点3或位点4重叠的插入位点。在一些方面，插入位点位于反平行链上的对应位置。
50、本公开提供了一种同种异体car-t细胞，该同种异体car-t细胞包含选自双顺反子构建体bc1、bc2、bc3、bc4、bc5、bc6、bc7或bc8的特异性双顺反子构建体，其中编码hla-e的核酸序列已被编码hla-g的核酸序列替换。在一些方面，本公开提供了一种同种异体car-t细胞，该同种异体car-t细胞包含选自双顺反子构建体bc1、bc2、bc3、bc4、bc5、bc6、bc7或bc8的特定双顺反子构建体，其中编码b2m片段的核酸序列已被编码trac片段的核酸序列替换，并且其中双顺反子构建体插入trac基因中。在一些方面，本公开提供了一种同种异体car-t细胞，该同种异体car-t细胞包含选自双顺反子构建体bc1、bc2、bc3、bc4、bc5、bc6、bc7或bc8的特异性双顺反子构建体，其中编码b2m片段的核酸序列已被编码cd52片段的核酸序列替换，并且其中双顺反子构建体插入cd52基因中。
51、本公开提供了一种试剂盒，该试剂盒包含用于crispr/cas9介导的插入b2m中的grna，其中grna选自位点1grna(actctctctttctggcctgg；seq id no:1)；位点2grna(agtcacatggttcacacggc；seq id no:2)；位点3grna(cacagcccaagatagttaag；seq id no:3)；和位点4grna(gagacatgtaagcagcatca；seq id no:4)。