本发明涉及制备寡核苷酸的液相方法。更特别地，本发明涉及用于制备寡核苷酸的膜过滤辅助的液相方法。
背景技术：
1、寡核苷酸（oligos）是核苷酸（也称为核苷磷酸）的短的序列确定的聚合物。寡核苷酸的结构通常由核糖磷酸骨架组成，该核糖磷酸骨架通常通过磷酸二酯单元连接核糖的3’-和5’-氧取代基，并且每个核糖环具有与核糖的1’-c相连的芳香核碱基。核糖和核碱基的组合称为核苷，在天然序列和药物序列中，核碱基随着单体单元的不同而不同。核碱基序列赋予寡核苷酸靶特异性。
2、基于寡核苷酸的药物现在已被提出作为在蛋白质表达水平方面起作用的新一代的治疗剂，并且最近已被验证为用于治疗多种严重或危及生命的适应症的新的药物形式。寡核苷酸药物与天然寡核苷酸在化学结构上的不同之处在于，它们在多个位点上进行了化学修饰，主要是为了增加体内的稳定性以及改善靶向性。然而，类似于天然寡核苷酸，核碱基侧链的精确序列决定了寡核苷酸的药物功能。
3、在药物寡核苷酸中，修饰通常包括：用硫取代磷酸骨架上的氧；将取代基（例如meo、f、甲氧基乙氧基（moe））放置在核糖的2’-c上；用额外的原子环限制核糖的构型；使核碱基甲基化或氟化；以及用另一个杂环（例如吗啉）取代核糖。即便如此，含有这样的修饰的药物仍可被认为是寡核苷酸。
4、多年来，使用固相寡核苷酸合成（spos）制备寡核苷酸，其中生长的寡核苷酸（growing oligonucleotide）被束缚在不溶性固体支持物上，并通过使反应性核苷亚磷酰胺构建块（4）流过不溶性固体支持物而生长，如图1所示。尽管这种方法几十年来已经成为行业标准，但是spos有许多缺点。特别地，为了驱动反应完成，通常需要过量的亚磷酰胺（4）。在小规模中，过量几十个当量是很常见的，从而大大增加了spos的成本。此外，spos反应的规模扩大被限制为每批仅生产~15 kg寡核苷酸。这对于它们用作药物形式是特别不希望的，其中对于主要的医学适应症（例如心血管疾病），每年将需要数公吨寡核苷酸。
5、旨在解决这些规模扩大和经济挑战的一个spos替代策略是液相寡核苷酸合成（lpos）。事实上，液相反应和液相材料处理是可以在数公吨规模进行的成熟技术，这使得lpos成为大规模寡核苷酸制备的有力候选。lpos的典型方法是进行顺序偶联反应，以逐步的方式将单体或多单体寡聚物（片段）加入到溶液中生长的寡核苷酸中，然后使用合适的分离技术，如膜过滤，从生长的寡核苷酸中分离未反应的单体或片段（us8,664,357；us9,127,123；us10,239,996；ep3347402；gaffney等人；kim等人；so等人；yeo等人；dong等人；wo2016/188835 a1）。
6、在将单体或片段偶联到生长的寡核苷酸上的步骤之后，可以使用膜过滤从生长的寡核苷酸中分离未反应的单体/片段和任何反应碎片（gaffney等人；kim等人）。因此，膜过滤的使用非常适合lpos，其中在每个偶联步骤之后，彻底的纯化步骤是至关重要的。
7、然而，当与典型的小分子药物相比时，无论是传统的spos还是lpos的开发领域，寡核苷酸的生产都非常昂贵。通过spos生产寡核苷酸的成本的最大部分来自核苷亚磷酰胺（4）、所需溶剂的量、固体支持物以及粗寡核苷酸的最终纯化（andrews等人；scozzari等人）。在其他条件相同的情况下，显著降低这些因素中任何一个的成本都会显著改善寡核苷酸生产的经济性。
8、尽管膜辅助lpos可以被视为spos的更可扩展（scalable）的替代方案，但是它们仍然受限于对大量昂贵的核苷亚磷酰胺（4）的需求。
9、在spos寡核苷酸药物生产中使用的dmtr-核苷亚磷酰胺（4）都是由相应的5’-dmtr-3’-羟基核苷（1）制备的，5’-dmtr-3’-羟基核苷（1）已连接有合成所需的全部关键特征（除了磷部分），其包括：（i）关键的临时5’-o-(4,4’-二甲氧基三苯基甲基)（dmtr）保护性基团，其在每个链延伸循环结束时在弱酸性条件下被去除；（ii）仅在最终的整体去保护过程中被去除的永久保护性基团；（iii）核糖或其他相关的类糖物质；和（iv）核碱基。
10、由一系列较简单的前体制备5’-dmtr-核苷存在多种途径。在任何可能的情况下，通过结晶或沉淀来对合成途径中的中间体进行分离（假设确实需要纯化），以最小化成本并最大化可扩展性（scalability）。通常，首先构建基础核苷（其包括核糖和核碱基的所需永久修饰），然后保护核碱基，最后连接dmtr基团（ep0813539 b1；ep1612213 b1；legorburu等人；liu等人）。
11、仍然参照图1，5’-dmtr-核苷可以通过与氯膦[(pgo)pcl(nr2)]（3）或双亚磷酰胺（bis-amidite）[(pgo)p(nr2)2]（2）反应而转化为3’-亚磷酰胺（nielsen等人；pedersen等人；sanghvi等人；xie等人）、核苷-op(opg)(nr2)，其中pg（例如图1中的cne）是磷酸三酯的永久保护性基团，其将在整个寡核苷酸合成中被携带。所得的亚磷酰胺构建块（4）中的磷处于p(iii)氧化态，对氧化（包括空气中的氧气）失活敏感。如果亚磷酰胺暴露于任何酸中，它对水解变得极其敏感，并丢失5’-o-dmtr基团。由于这些敏感性，商业亚磷酰胺通常被冷藏保存并通过冷链运输。
12、在亚磷酰胺用于寡核苷酸合成之前，它必须首先被纯化。主要目的是去除任何可能参与链延伸循环并降低最终寡核苷酸纯度的杂质，即关键杂质。来自亚磷酰胺合成的最可能的关键杂质是过量的磷酰胺化试剂（phosphoramidating reagent）（例如，（2）或（3）），如果亚磷酰胺（4）中存在该试剂，其将永久地封闭生长的寡核苷酸序列。
13、与dmtr-核苷（1）及其前体不同，亚磷酰胺构建块（4）通常不能通过结晶或沉淀来纯化。虽然它有时会形成固体，而不是胶质，但这些方法往往不可重复地倾向于两种亚磷酰胺非对映异构体中的一种，并且不能保证去除关键杂质。然后，当富含一种非对映异构体的亚磷酰胺构建块随后用于寡核苷酸链延伸时，这可以使所得键的非对映异构体比率发生偏差；如果亚磷酸三酯中间体随后被转化为硫代磷酸酯类似物，这是特别重要的。
14、因此，dmtr-核苷亚磷酰胺构建块（4）几乎总是通过正相硅胶柱进行色谱纯化，其通常使用含有少量有机碱的无水溶剂（例如乙酸乙酯和庚烷）梯度，以确保水解稳定性。色谱法不是一种受欢迎的工艺规模纯化技术，因为：(i)其很难扩大规模；(ii)其需要大量易燃溶剂；(iii)其耗时且需要仔细监控；(iv)必须筛选和选择大的馏分体积，合并并蒸发至干燥；以及(v)它产生许多固体废物（硅胶柱）。曾有人试图在不用色谱法的情况下简化核苷亚磷酰胺的纯化（us7,960,542 b2），但他们没有取代这项技术。因此，色谱纯化方法的复杂性大大增加了核苷亚磷酰胺的最终成本。事实上，据估计色谱纯化方法使得亚磷酰胺（4）比它们直接的核苷前体（1）贵3至10倍。
15、本发明是考虑到前述内容而设计的。
技术实现思路
1、根据本发明的第一方面，提供了形成寡核苷酸的液相方法，该方法包括以下步骤：
2、a）提供式i化合物：
3、
4、i
5、其中a是核苷或寡核苷酸，ta是核苷或寡核苷酸的反应性末端，z是核苷或寡核苷酸所连接的可溶性合成支持物；
6、b）修饰式i化合物以形成式ii化合物：
7、
8、ii
9、其中a和z如关于式i所定义，x是叔氨基，pg是保护性基团；
10、c）通过膜过滤分离式ii化合物；
11、d）提供式iii化合物：
12、
13、iii
14、其中b是核苷或寡核苷酸，tb1是核苷或寡核苷酸的反应性末端，tpg是核苷或寡核苷酸的受保护末端；
15、e）使式ii化合物与式iii化合物反应，以形成式iv化合物：
16、
17、iv
18、其中a和z如关于式i所定义，pg如关于式ii所定义，b和tpg如关于式iii所定义。