本发明总体上涉及诊断和样品测试领域。更具体地说，本发明涉及一种通过杂交剂和核酸之间的杂交来分析样品中细胞和/或病毒靶核酸的存在和/或数量的方法。
背景技术：
1、核酸杂交是物理化学过程，有助于理解分子生物学。基于探针的测定使用杂交和杂交剂进行核酸的检测、定量和分析。
2、基于核酸的方法靶向微生物的rna或dna含量。在细菌的情况下，这些方法可以检测在细胞内或呈游离形式的核酸。许多细菌检测方法靶向16s核糖体rna（rrna），因为它被普遍表达为细菌核糖体的结构组分，它具有高且恒定的表达水平，比信使rna更稳定，具有在所有细菌物种中相同的保守区，但也具有可以用于在菌株水平下特异性检测细菌的高变区。
3、在杂交技术中，使用具有与靶标互补的核苷酸序列的短核苷酸（被称为杂交剂或探针）来检测靶标。最初探针由rna或dna制成，但很快发现这些探针具有几种局限性（对核酸酶降解的敏感性、缓慢的杂交动力学等）。这些约束刺激了替代性探针比如锁核酸（lna）和肽核酸（pna）的开发。
4、肽核酸（pna）是人工合成的高亲和力多核苷酸探针，近年来已经用于分子生物学程序、诊断测定和反义疗法。由于pna的高结合强度，寡核苷酸探针典型地具有低至10-20个核碱基的长度，采用共同的核碱基（a、c、g、t和u）。根据沃森-克里克碱基配对规则，pna可以与具有序列特异性的互补核酸杂交。pna不易于被核酸酶或蛋白酶识别，使得它们对酶降解具有抗性。pna在宽ph范围内也是稳定的。然而，尽管pna比一些其他寡核苷酸更适合渗透到细胞中，但pna典型地不能容易地穿过细胞膜进入胞质溶胶，因此细胞渗透剂将与pna一起使用以改善胞质递送。与dna或rna不同，pna的主链由通过肽键连接的重复n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。各种嘌呤和嘧啶碱基通过亚甲基桥（-ch2-）和羰基（-(c=o)-）连接至主链。pna携带净中性电荷，允许pna与天然存在的核酸极其快速且稳定地形成杂交体，并且典型地需要最少的样品制剂来进行直接核酸检测。
5、此主链使pna探针优于dna探针：pna探针对核酸酶和蛋白酶具有抗性，在有限程度上它是细胞可渗透的，并且最重要的是，显示出快速和盐非依赖性杂交。靶向16s核糖体rna的高变区的pna探针已成功地应用于从血液、环境样品、甚至乳中检测细菌。已发表的方案检测细胞内的靶标，与固定和透化细胞一起工作，使用长杂交时间，并应用基于离心的洗涤步骤。将探针用荧光团标记并用荧光显微镜或流式细胞术检测。没有检测的一般总测定时间为大约2.5小时。
6、近年来，由于pna的稳定性和与天然存在的核酸快速杂交的能力，使用pna进行核酸检测引起了广泛关注。
7、荧光原位杂交（fish）是一种分子细胞遗传学技术，其使用仅与核酸序列的具有高度序列互补性的特定部分结合的荧光标记探针。
8、perry-o’keefe等人（journal of microbiological methods [微生物学方法杂志], 47 (2001) 281-292）报告了使用fish和荧光标记的pna探针来鉴定微生物（比如大肠杆菌（escherichia coli）、铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）和沙门氏菌（salmonella））以及使用探针靶向真细菌和真核生物域（eucarya）的方法。所报告的pna fish方法允许使用标准化pna-fish方法同时鉴定多个物种。
9、rathnayaka等人（int. journal of molecular biology [国际分子生物学杂志], 第3卷, 第3期(2018), 第143-149页）报告了fish在使用pna或lna探针检测食品病原体中的用途。披露了标准化pna fish方法的基本步骤，即 (i) 样本的固定和透化，(ii) 探针与靶核苷酸的杂交，(iii) 洗涤以去除未结合的探针，以及 (iv) 结果的可视化和计数。作者指出，在食品微生物学中，可能需要进一步的样品制备步骤，比如均质化、预富集程序或细菌分离。
10、rocha等人（plos one [公共科学图书馆·综合] 13(5): e0196522. doi.org/10.1371/journal.pone.0196522）报告了固定/透化步骤对用于检测细菌的pna荧光原位杂交（pna-fish）的影响。多聚甲醛和乙醇的组合为标准化pna-fish方法的固定和透化步骤提供了优异的性能。
11、mach等人（analyst. [分析员] 2019年2月25日; 144(5): 1565-1574. doi:10.1039/c8an02194e）报告了使用批量液体测定直接检测革兰氏阴性细菌病原体以提供传染病的准确及时诊断。对于病原体检测，将探针在2x杂交缓冲液中稀释至所需浓度，并且将探针与等体积的培养基或解冻培养物（冷冻并储存在-80°c下，直至测试）混合以获得最终探针浓度。将混合物加热至95°c以热裂解细菌，随后在60°c下温育30 min，以允许使用pna分子信标的双链pna探针进行探针杂交。
12、young等人（2020. a technical review and guide to rna fluorescence insitu hybridization. [rna荧光原位杂交的技术综述和指南].peerj 8:e8806 doi10.7717/peerj.8806）综述了rna-fish杂交技术，并报告了fish方法的核心加工步骤：组织制备（杂交前）、杂交和洗涤（杂交后），作者报告这对于fish方案是必不可少的。
13、us 2005/0032091披露了一种用于分析样品中的靶序列的方法，该方法包括使样品与至少一对探针（探针a和探针b）接触，其中探针a和探针b是pna探针，并且其中探针a包含荧光团并且探针b包含淬灭剂，用于检测、鉴定或定量探针a与靶序列的杂交。在此，进行淬灭以试图避免进行严格洗涤。用于分析的方法是使用标准化pna-fish方法的荧光原位杂交。
14、zand等人（foods [食品] 2021, 10, 3112. doi.org/10.3390/foods10123112）报告了用于食品工业中的快速微生物检测和表征的流式细胞术方法和fish。作者指出，在观察杂交细胞之前，需要洗涤步骤来去除未结合的和过量的探针，以使假阳性检测最小化，并且天然样品中的背景“噪声”通常被认为是挑战。然而，zand等人示出了以下各项的微生物检测的相关实例：碎牛肉、猪肉糜、乳、莴苣和熟虾中的单核细胞增生李斯特菌（l.monocytogenes）；鸡蛋、乳、蛋黄酱中的肠炎沙门氏菌（s. enteritidis）；碎牛肉和未巴氏灭菌的乳中的大肠杆菌o157；粉状婴儿配方奶粉中的沙门氏菌属物种（salmonella spp.）；乳中的乳杆菌属物种（lactobacillus spp.）；葡萄酒中的布鲁塞尔德克酵母（dekkerabruxellensis）；玻璃、聚丙烯聚乙烯、聚氯乙烯、铜、硅橡胶、ns不锈钢上的肠道沙门氏菌（s. enterica）/单核细胞增生李斯特菌/大肠杆菌生物膜；以及聚氯乙烯试样上饮用水中的幽门螺杆菌（h. pylori）。
15、然而，仍然需要改进标准化杂交以便简化和/或改进核酸的检测。
16、因此，本发明的目的是提供一种用于检测核酸的改进方法，该方法降低了与检测相关的复杂性、成本和时间，同时保留了核酸的高特异性和快速检测。
技术实现思路
1、发明人已经发现，可以在杂交组分的单步简便、易于自动化的稀释步骤中成功地进行结合的杂交剂的严格胁迫，从而避免传统严格洗涤的多个方案步骤。这种新颖的严格稀释步骤可以在与杂交步骤相同的温度下进行，而不需要通过例如离心或过滤去除液体。简单地说，本发明在于直接向杂交细胞中添加一定体积（进行稀释），优选使用专用缓冲液，由此使读出将结合的杂交剂与未结合的杂交剂清楚地分开。
2、本发明人还惊奇地发现，传统的预处理和杂交步骤可以组合成单个步骤，从而减少了在分析样品之前去除酶和/或杂交剂的需要。
3、最后，发明人已经认识到，本发明的简化的严格缓冲液应用可以与预处理和杂交步骤的这种有利组合相结合。
4、因此，在第一方面，本发明涉及一种用于分析样品中是否存在一种或多种靶核酸的方法，该方法包括
5、i) 使样品与一种或多种杂交剂例如包含多核苷酸或其类似物或由其组成的试剂接触，该杂交剂能够与所述一种或多种靶核酸杂交，以获得试剂和样品的混合物；
6、ii) 用稀释剂稀释步骤i) 中获得的该混合物，该稀释剂可以是严格缓冲液的形式，在该稀释剂存在下，该一种或多种杂交剂与其各自的靶核酸之间的特异性杂交优于非特异性杂交事件，以获得稀释的混合物；以及
7、iii) 在该稀释的混合物中定性或定量检测与靶核酸杂交的杂交剂。
8、应注意，当在本文中以单数提及杂交剂或探针时，这并不排除存在具有不同靶序列的几种杂交剂或探针。应理解，本文传授的技术适用于单探针/杂交剂测定以及利用多种探针/杂交剂的测定两者。