本公开涉及单细胞分析的方法和系统。
背景技术：
1、即使是生物体内最小的细胞群体之间也存在差异。因此，对样本中整个细胞群的分析只能提供样本的平均值，而该平均值可能无法代表任何一个细胞。例如，癌细胞通常会随着时间的推移而彼此产生差异，变得越来越异质。这可导致罕见变异的出现，以及细胞对干预措施反应的差异。未能捕捉到这些差异可导致诊断和治疗措施不当。
2、单细胞分析旨在对单个细胞进行分析。然而，为了在单细胞水平上捕获整个细胞群体，可能需要单独处理数百万个细胞，并对细胞内的分子进行标记，以便进行后续分析。随着产生的数据量增加，数据分析成为一项重大挑战，分析样本所需的费用和时间也随之增加。
3、发明概述
4、本发明提供允许单一来源(例如单个细胞)的分子物理配对在一起的方法、引物和修饰的基底。这样就可以同时对连接的分子进行测序，而无需将每个分子标记为源自该单一来源。这大大减少了样品制备过程中产生的后续分析数据量，从而降低了单细胞分析所需的费用和时间。
5、本发明的一些方面提供了制备分子库的方法。该方法包括通过将至少两个来自单一来源(如单个细胞)的核酸分子分离在一起来制备第一混合物。然后将第一混合物与多个连接的接头接触，每个连接的接头包括物理连接的第一引物和第二引物。具体地，来自单一来源的第一核酸分子与连接的接头的第一引物缔合，来自单一来源的第二核酸分子与同一连接的接头的第二引物缔合。然后，在不破坏连接的接头的物理连接的情况下，从第一核酸分子和第二核酸分子各自生成互补链。本发明的方面还可以包括在缔合步骤之后和/或在分别对第一和第二核酸分子生成互补链的步骤之后，扩增第一和第二核酸分子的步骤。
6、有利的是，任何用于分离样品中分子的方法都可以与本发明一起使用。例如，制备第一种混合物的步骤可以包括将第一种混合物分隔开来，例如通过使用液滴乳化或微流控技术。因此，将第一混合物分隔开的步骤可以包括将单个细胞从混合物中分隔开来，从而将该单个细胞从混合物中分离出来(例如，从混合物中的其他单个细胞中分离出来)，从而将该单个细胞中的核酸分子从混合物中分离出来。
7、本发明的连接的接头也可以通过任何方法进行物理连接，包括共价交联和非共价连接。例如，连接的接头的引物可以通过连接反应、点击化学、蛋白质连接子、聚合物连接子、扩增反应或寡核苷酸化学合成进行物理连接。
8、此外，有利地是，由于来自单一来源的核酸分子通过连接的接头而连接在一起，因此他们在测序时不需要保持分离状态。因此，本发明的某些方面可以包括将制备步骤中形成的隔室打破成一个单一容器，从而汇集隔室的内容物(例如微流控液滴)到一个容器的步骤。打破隔室的步骤可能先于生成序列读段的步骤。
9、可以通过本发明方法分析任何核酸分子。例如，至少两个核酸分子可以包含编码细胞受体蛋白的核酸分子。所述核酸分子可编码b细胞受体或t细胞受体(tcr)。有利地是，本发明的连接的引物可用于连接编码相关分子(如蛋白质的亚基)的第一和第二核酸分子。例如，与连接的接头的第一引物配对的第一核酸分子可编码tcrα，与连接的接头的第二引物配对的第二核酸分子可编码tcr的tcrβ，从而将编码tcr异二聚体的每个蛋白质链的核酸分子连接起来。同样的原理也可用于连接编码任何相关分子的核酸分子。
10、核酸分子也可以通过任何方法与连接的接头的引物缔合。例如，将第一和第二核酸分子与连接的接头的第一和第二引物缔合，可以包括将核酸分子退火到引物。例如，缔合步骤可以包括将第一和第二核酸分子退火到第一和第二引物。
11、有利地是，本发明方法大大降低了细胞分析的复杂性和成本，可以同时对连接的分子进行测序，而无需将单个分子标记为来自单一来源。因此，本发明的方法可以在完成这些步骤时无需用细胞特异性条形码标记核酸分子的前体下完成。或者，也可以用细胞特异性条形码标记至少两个核酸分子。
12、分析核酸分子的方法可包括对核酸分子进行测序。因此，本发明的一些方面还包括生成第一核酸分子和第二核酸分子的序列读段的步骤。
13、为每个核酸分子合成互补链的步骤可以包括在流动池的同一簇上接种第一个核酸分子和第二个核酸分子，而不破坏连接的接头的物理连接。例如，连接的核酸分子可以以单个簇的形式接种在流动池中，得到两个连接的核酸分子一起接种的簇。这与传统的流动池测序方法形成对比，后者需要仅包含单个核酸序列的“纯”簇。
14、生成序列读段可以通过任何已知的方法完成，包括使用下一代测序和长读段测序。例如，可以将接头与靶标dna分子配对，以便在一个连续长读段中多次对dna分子的每一条链进行测序。可以将几个dna片段串联起来，产生更长的dna扩增子用于测序，然后将其连接到接头上。例如，可以扩增单个基因，并将扩增子串联成单个片段进行测序。长读段测序方法描述于例如kanwar et al. (2021) scientific reports 11:18065，其全部内容通过引用并入本文。
15、在流动池的同一簇上接种第一核酸分子和第二核酸分子可以包括：将第一核酸分子和第二核酸分子各自通过结合引物与流动池的基底偶联，这些结合引物物理地结合到基底上，并通过未通过连接的接头的物理连接来连接的末端与每个第一核酸分子和第二核酸分子的末端偶联。结合引物通常与流动池的基底上，例如基底表面上或基底上的孔内的某一点的序列互补。添加到每个核酸分子的结合引物还可以包含用于测序和下游处理的结合位点和接头。或者，在流动池的同一簇上接种第一核酸分子和第二核酸分子可以包括：将第一核酸分子和第二核酸分子各自通过结合引物与流动池的基底偶联，该结合引物物理结合到所述基底并与通过连接的接头的物理连接所连接的每个核酸分子的末端偶联。
16、本发明的一些方面还提供了一种修饰的基底，该基底包含多个离散位置，每个位置包含两个核酸分子。所述两个核酸分子中的每个在一端通过物理结合于所述基底的引物与该基底偶联，并且所述两个核酸分子中的每个在它们的另一端则通过物理连接相互偶联。这两个核酸分子可能彼此不同。
17、如前所述，本发明的连接的接头可以通过任何方法进行物理连接，包括共价交联和非共价连接。例如，连接的接头的引物可以通过连接反应、点击化学、扩增反应或寡核苷酸化学合成进行物理连接。
18、有利的是，不同的核酸分子不需要也不使用细胞特异性条形码进行标记。虽然在某些实施方案中，它们也可以用条形码标记，如细胞特异性条形码或唯一分子标识符(umi)。
19、修饰的基底可以作为流动池的一部分。例如，每个离散位置都是在流动池上的一个簇。流动池可以配置成允许合成与每个核酸互补的链，而不会在离散位置破坏核酸之间的物理连接。
技术实现思路
1.一种制备分子库的方法，该方法包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中制备所述第一混合物的步骤包括将所述第一混合物分隔到多个隔室。
3.如权利要求2所述的方法，其中将所述第一混合物分隔的步骤包括将单个细胞或单个珠子从所述第一混合物中分隔开。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述多个连接的接头的第一引物和第二引物通过共价键物理连接。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述多个连接的接头的第一引物和第二引物通过非共价键物理连接。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述多个连接的接头的第一引物和第二引物通过连接反应、点击化学、扩增反应或寡核苷酸化学合成来物理连接。
7.如权利要求2所述的方法，其还包括将制备步骤中形成的隔室打破并合并到一个容器的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其还包括在所述缔合步骤之后扩增所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的步骤。
9.如权利要求1所述的方法，其中至少两个核酸分子编码细胞受体蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述核酸分子编码b细胞受体或t细胞受体。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述缔合步骤包括将所述第一核酸分子和所述第二核酸分子分别退火至所述第一引物和所述第二引物。
12.如权利要求1所述的方法，其中至少两个核酸分子各自标记有相同的细胞特异性条形码。
13.如权利要求1所述的方法，其还包括生成所述第一核酸分子和所述第二核酸分子的序列读段的步骤。
14.如权利要求1所述的方法，其中合成互补链的步骤包括将所述第一核酸分子和所述第二核酸分子接种到流动池的同一簇上，而不破坏每个连接的接头的物理连接。
15.如权利要求14所述的方法，其中在所述流动池的同一簇上接种所述第一核酸分子和所述第二核酸分子包括：
16.一种修饰的基底，其包含多个离散位置，每个位置包含两个核酸分子，所述两个核酸分子中的每个在一端通过物理结合于所述修饰的基底的引物与该修饰的基底偶联，并且其中所述两个核酸分子在另一端通过物理连接相互偶联，其中所述修饰的基底是流动池的一部分，并且其中所述流动池配置成允许合成与每个核酸分子互补的链，而不破坏所述核酸分子之间的物理连接。
17.如权利要求16所述的修饰的基底，其中所述两个核酸分子通过共价交联物理连接。
18.如权利要求16所述的修饰的基底，其中所述两个核酸分子通过非共价键物理连接。
19.如权利要求16所述的修饰的基底，其中所述两个核酸分子通过连接反应、点击化学、扩增反应或寡核苷酸化学合成来物理连接。
20.如权利要求16所述的修饰的基底，其中所述两个核酸分子各自标记有相同的细胞特异性条形码。