本发明涉及细胞培养液的配制，尤其涉及一种树突状细胞的无血清培养液及其培养方法。
背景技术：
1、树突状细胞(dendritic cells,dcs)是重要的免疫细胞，负责捕获、处理和呈递抗原，从而激活t细胞和b细胞，参与机体的免疫应答。由于其在免疫调节和抗肿瘤免疫中的关键作用，树突状细胞在免疫治疗和疫苗开发中受到了广泛关注。
2、目前，常规的体外dc细胞制备方法是用细胞因子从外周血或脐带血中的dc细胞前体细胞定向诱导、分化、扩增获得。这种树突状细胞的培养和分离，多依赖于血清添加，如胎牛血清(fbs)，这虽然能促进细胞生长和分化，但也带来了批次差异、免疫原性和高昂成本等问题；且这种常规制备的dc细胞，含有很大部分未成熟dc细胞；这种细胞的抗原摄取和加工能力较强，但是抗原递呈能力较弱，且激活t细胞能力差，同时还抑制t细胞的增殖。
技术实现思路
1、基于上述问题，本发明所要解决的问题在于提供一种能提升树突状细胞分化成熟度高、生长扩增效果好，且应用安全可靠的无血清培养液，以及使用该培养液进行树突状细胞培养的培养方法。
2、本发明的技术方案一如下：
3、一种树突状细胞无血清培养液，包括a液和b液：其中：
4、所述a液包括无血清基础培养基，在该无血清培养基中含有终浓度10～500ng/ml的gm-csf、终浓度1～500ng/ml的il-4、终浓度50～1000μg/ml的维生素c、终浓度5～50μm姜黄素、终浓度0.1～10μg/ml的石杉碱甲和终浓度0.1～5μm的迷迭香酸；
5、所述b液包括无血清基础培养基，在该无血清培养基中含有终浓度0.1～20ng/ml的tgf-β、终浓度1～200μg/ml的pge2、终浓度0.1～10μg/ml的脂多糖和终浓度1～20μm的芦丁。
6、一实施例，所述树突状细胞无血清培养液中：
7、a液的无血清基础培养基中含有终浓度100ng/ml的gm-csf、终浓度200ng/ml的il-4、终浓度500μg/ml的维生素c、终浓度10μm姜黄素、终浓度5μg/ml的石杉碱甲和终浓度1μm的迷迭香酸；
8、b液的无血清基础培养基中含有终浓度10ng/ml的tgf-β、终浓度50μg/ml的pge2、终浓度5μg/ml的脂多糖和终浓度8μm的芦丁。
9、一实施例，所述树突状细胞无血清培养液中，无血清基础培养基为imdm、rpmi-1640、581或dmem。
10、本发明还提供使用上述无血清培养基进行树突状细胞的培养方法，包括如下步骤：
11、第0天，将单个核细胞加入培养瓶中，该培养瓶盛有上述树突状细胞无血清培养液的a液，于37℃、5％co2的培养箱中培养6h；吸弃细胞培养废液及悬浮细胞，等量补充添上述树突状细胞无血清培养液的a液，于37℃、5％co2的培养箱中继续静置培养；
12、第3天，根据培养瓶中培养液的体积量，往培养瓶中等量补充上述树突状细胞无血清培养液的a液，于37℃、5％co2的培养箱中静置培养；
13、第5天，将培养瓶中的细胞转移至培养袋中，并根据培养瓶中培养液的体积量，按照1:2的体积比，往培养袋中补充添加上述树突状细胞无血清培养液的b液，于37℃、5％co2的培养箱中静置培养；
14、第7天，并根据培养瓶中培养液的体积量，按照1:2的体积比，往培养袋中补充添加上述树突状细胞无血清培养液的b液，于37℃、5％co2的培养箱中静置培养；
15、第9天，收集细胞并500g离心8min；去上清，用pbs反复洗涤2～3次细胞沉淀，获得树突状细胞。
16、一实施例，树突状细胞的培养方法中，第0天，单个核细胞数量为1.0～5.0×106个。
17、一实施例，树突状细胞的培养方法中，第0天，培养瓶中盛有的a液体积数为100ml；6h后，补充添加的所述a液为000ml。
18、一实施例，树突状细胞的培养方法中，第3天，补充加入所述a液体积数为200ml。
19、一实施例，树突状细胞的培养方法中，第5天，补充加入所述b液体积数为800ml。
20、一实施例，树突状细胞的培养方法中，第7天，补充加入所述b液体积数为1600ml。
21、与现有技术相比，本发明具有如下优点：
22、1、树突状细胞无血清培养液的a液，可以诱导单个核细胞快速分化为树突状细胞，如，石杉碱甲可以增强细胞活性、促进单个核细胞诱导分化dc细胞；迷迭香酸具有抗氧化能力，能在树突状细胞分过程中保护细胞免受损伤，增强细胞的免疫活性；姜黄素能促进树突状细胞抗原呈递能力，可以提高细胞生物活性、促进树突状细胞分化；
23、2、树突状细胞无血清培养液的b液，可以促进树突状细胞生长及使未成熟树突状细胞向成熟树突状细胞转化，如，芦丁与tgf-β结合，能促进未成熟树突状细胞向成熟突转细胞转化；
24、3、树突状细胞培养液中，以无血清培养基为基础培养基，避免了血清中潜在的病原体和免疫反应引发的风险，提高了树突状细胞的安全性和临床应用的可行性；
25、4、树突状细胞培养过程中，前3天，添加a液，用以促进单个核细胞诱导、分化树突状细胞，并可提高树突状细胞的活性；第5天后，补充b液，用以促进未成熟树突状细胞向成熟树突状细胞分化，并进一步提升树突状细胞快速扩增生长。
1.一种树突状细胞无血清培养液，其特征在于，包括a液和b液：其中：
2.根据权利要求1所述的树突状细胞无血清培养液，其特征在于，所述a液的无血清基础培养基中含有终浓度100ng/ml的gm-csf、终浓度200ng/ml的il-4、终浓度500μg/ml的维生素c、终浓度10μm姜黄素、终浓度5μg/ml的石杉碱甲和终浓度1μm的迷迭香酸；所述b液的无血清基础培养基中含有终浓度10ng/ml的tgf-β、终浓度50μg/ml的pge2、终浓度5μg/ml的脂多糖和终浓度8μm的芦丁。
3.根据权利要求1所述的树突状细胞无血清培养液，其特征在于，所述无血清基础培养基为imdm、rpmi-1640、581或dmem。
4.一种树突状细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，第0天，所述单个核细胞数量为1.0～5.0×106个。
6.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，第0天，所述培养瓶中盛有的a液体积数为100ml；6h后，补充添加的所述a液为100ml。
7.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，第3天，补充加入所述a液体积数为200ml。
8.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，第5天，补充加入所述b液体积数为800ml。
9.根据权利要求4所述的树突状细胞的培养方法，其特征在于，第7天，补充加入所述b液体积数为1600ml。