本发明涉及生物，特别是涉及一种表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术：
1、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，sod）是一类重要的抗氧化酶，能够催化超氧阴离子自由基（o2-）歧化为过氧化氢（h2o2）和氧气（o2），从而保护细胞免受活性氧（reactive oxygen species，ros）的损伤。sod在生物体内具有广泛的分布，并且根据金属辅因子的不同分为cu/zn超氧化物歧化酶、锰超氧化物歧化酶和铁超氧化物歧化酶。其中，人源cu/zn超氧化物歧化酶因其高效、稳定以及与人体相容性好等特点，在医药、化妆品等领域有着广泛的应用前景。
2、目前，工业上生产人源cu/zn超氧化物歧化酶的方法主要包括从动物组织中提取、基因工程菌表达等途径。然而，这些方法存在以下问题：
3、提取法：由于人源cu/zn超氧化物歧化酶主要存在于红细胞中，含量极低，导致提取成本高昂，产量有限，难以满足市场需求。
4、大肠杆菌表达系统：虽然可以实现较高水平的表达，但大肠杆菌缺乏真核生物特有的翻译后修饰机制，影响了蛋白质的空间结构及生物学功能，使得产物的质量和活性不稳定。
5、哺乳动物细胞表达系统：尽管能够进行正确的翻译后修饰，但培养条件苛刻，周期长，成本高，不适合大规模工业化生产。
6、本发明拟开发一种高效表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的新方法——利用毕赤酵母（pichia pastoris）作为宿主构建工程菌，以实现人源cu/zn超氧化物歧化酶的高效表达和工业化生产。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题。该工程菌株能够高效表达人源cu/zn超氧化物歧化酶，其表达量可达3g/l以上。
2、毕赤酵母作为一种甲醇营养型酵母，具备以下优势：具有强大的蛋白分泌能力，能够将重组蛋白高效地分泌到发酵液中，便于后续纯化操作；具有完善的翻译后修饰系统，能够确保人源cu/zn超氧化物歧化酶获得与天然状态下相同的糖基化修饰，保证其结构完整性和生物学活性；易于放大生产和降低成本，相较于哺乳动物细胞表达系统，毕赤酵母的生长速度快，培养基简单廉价，适合大规模工业化生产。因此，本发明利用毕赤酵母作为宿主构建了能够高效表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌。
3、基于此，本发明提供了如下方案：
4、本发明提供一种表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株的构建方法，包括以下步骤：
5、将人源cu/zn超氧化物歧化酶的编码基因克隆到表达载体中，构建得到重组质粒；
6、将所述重组质粒转化毕赤酵母感受态细胞，构建得到所述工程菌株；
7、所述编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8、进一步地，所述表达载体为ppiczαa载体。
9、进一步地，将所述编码基因克隆到所述表达载体的ecor i和not i酶切位点之间。
10、进一步地，所述毕赤酵母感受态细胞为毕赤酵母gs115感受态细胞。
11、进一步地，采用电转化方法将所述重组质粒转化至所述毕赤酵母感受态细胞中。
12、本发明还提供一种根据上述的构建方法构建得到的表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株。
13、本发明还提供上述的表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株在发酵生产人源cu/zn超氧化物歧化酶中的应用。
14、本发明还提供一种发酵生产人源cu/zn超氧化物歧化酶的方法，包括对上述的工程菌进行发酵培养，制备得到所述人源cu/zn超氧化物歧化酶的步骤。
15、进一步地，通过在发酵培养基中添加甲醇，实现对人源cu/zn超氧化物歧化酶的诱导表达。
16、进一步地，在所述发酵培养基中，所述甲醇的体积分数为1%。
17、本发明公开了以下技术效果：
18、本发明利用毕赤酵母作为宿主，构建得到了一种能够高效表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌，其表达量可达3g/l以上，远高于传统方法的产量。
19、本发明采用毕赤酵母表达体系替代传统的动物组织提取或哺乳动物细胞表达方式，大大降低了原材料采购、工艺流程控制等方面的费用支出，同时提高了产品的市场竞争力。
20、本发明为开发经济可行、环境友好且产品质量优良的人源cu/zn超氧化物歧化酶生产工艺提供了有力的技术支持，具有广阔的应用前景。
1.一种表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述表达载体为ppiczαa载体。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，将所述编码基因克隆到所述表达载体的ecor i和not i酶切位点之间。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述毕赤酵母感受态细胞为毕赤酵母gs115感受态细胞。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用电转化方法将所述重组质粒转化至所述毕赤酵母感受态细胞中。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的构建方法构建得到的表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株。
7.一种如权利要求6所述的表达人源cu/zn超氧化物歧化酶的工程菌株在发酵生产人源cu/zn超氧化物歧化酶中的应用。
8.一种发酵生产人源cu/zn超氧化物歧化酶的方法，其特征在于，包括对如权利要求6所述的工程菌进行发酵培养，制备得到所述人源cu/zn超氧化物歧化酶的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，通过在发酵培养基中添加甲醇，实现对人源cu/zn超氧化物歧化酶的诱导表达。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养基中，所述甲醇的体积分数为1%。