本公开属于生物医药领域，具体涉及靶向调控lpa基因表达的sirna双链体及其在预防和治疗心脑血管相关疾病中的用途。
背景技术：
1、核酸药物尤其是寡核苷酸药物，由于其合成简单、活性较高而得到广泛应用。寡核苷酸药物通常包括反义寡核苷酸（aso）、小干扰rna（sirna）、微小rna（mirna）和核酸适配体等。
2、寡核苷酸是一类短的dna或rna分子、寡聚体，寡核苷酸能够以序列特异性的方式与各自的互补寡核苷酸、dna或rna结合，形成双链体，或者，尽管较不常见，但有些情况下形成更高阶的杂合体。寡核苷酸能够序列特异性地与互补的rna链结合，杂交后能够诱导rnase h裂解靶rna。天然的寡核苷酸中，核苷酸之间由磷酸二酯键连接，在生理条件下，寡核苷酸对核酸酶特别敏感，因此在制备寡核苷酸药物时，天然的、未经改造的或未经修饰的寡核苷酸在体内容易被快速降解，因此能够发挥的活性非常有限，因而成药性差。对寡核苷酸进行修饰是提高其活性的有效方式，可以提高其对核酸酶的稳定性、与rna的亲和性，并能更好地促进细胞内吞和组织靶向，从而有效调控靶基因的表达。
3、核苷酸的基本结构通常可划分为碱基、核糖、磷酸骨架和末端四个部分，这四个部分的修饰可以举例如下：
4、1）碱基的修饰：主要分为嘌呤修饰、嘧啶修饰以及碱基替换三种形式。嘌呤修饰包括n6-甲基腺苷、n1-甲基腺苷、7-甲基鸟苷酸修饰；嘧啶修饰包括3-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基尿嘧啶核苷、5-甲基胞嘧啶核苷、n4 -乙酰胞苷、假尿苷、硫尿核苷、丙炔尿嘧啶核苷以及二氢尿嘧啶核苷等修饰。
5、2）核糖的修饰：主要分为核糖环特定位置处的基团的修饰和替换等。核糖的修饰包括但不限于2’-位修饰、4’-位修饰、5’-位修饰、异构修饰等。核糖2’-位修饰中最为常见的是2’-ome（2’-甲氧基）修饰及2’-f（2’-氟代）修饰。相比天然的寡核苷酸，同时采用2’-ome及2’-f修饰后的寡核苷酸具有更高的tm值、更强的血清稳定性和更好的活性。
6、3）磷酸骨架的修饰：主要的修饰方式包括但不限于硫代磷酸酯的修饰；经甲基磷酸酯、硒代磷酸酯、甲硼基磷酸酯、双硫代磷酸酯，以及用硫原子取代磷酸二酯键连接区的桥氧原子修饰；将核苷之间的磷酸酯基整个替换为不含磷原子的基团，如将p原子替换为c原子、s原子以及n原子等，从而形成胍基、s-甲基硫脲或硝酸酯等。
7、4）末端修饰：包括但不限于在正义链的5’末端和/或3’末端以共价键连接特定基团、反义链5’末端磷酸化修饰等。
8、脂蛋白(a)(lipoprotein(a)，lp(a))是利用免疫方法发现的一种特殊类型的脂蛋白颗粒，其在心血管疾病发生发展过程中发挥作用，是心血管疾病的重要危险因素。lp(a)由包含胆固醇、氧化磷脂（oxpl）等脂质成分的ldl样(ldl-like)颗粒与载脂蛋白a (apo(a))以及载体蛋白b-100等组成，其中载脂蛋白b-100通过共价键与apo(a)结合。apo(a)是一种高度多态性的糖蛋白，其由lpa基因编码。
9、目前认为lp(a)通过多种方式促进动脉粥样硬化斑块的形成。流行病学和遗传学研究表明，lp(a)水平升高是引发心血管疾病的独立危险因素，即使ldl-c水平被控制在当前指南规定的最佳范围内，与lp(a)相关的心血管风险仍然存在。因此，抑制lpa基因的表达水平，能够降低动脉粥样硬化及其相关心血管事件的发生风险。能够用于患有脂蛋白(a)相关疾病的患者的替代疗法和组合疗法是临床上需要的。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中缺乏一种更为有效的靶向调控lpa基因表达的sirna双链体的技术问题，本公开提供了靶向调控lpa基因表达的sirna双链体及其在预防和治疗心脑血管相关疾病中的用途。本公开通过对sirna基础序列进行修饰，筛选出了多个对lpa基因表达具有显著抑制作用的sirna修饰物，并且提供了相应的sirna缀合物。
2、本公开的技术方案包括但不限于：
3、一方面，本公开提供了一种sirna双链体，其包含由正义链和反义链配对组成的寡核苷酸双链体。
4、另一方面，本公开提供了一种用于降低lpa的表达的缀合物，其包括上述sirna双链体，及与其连接的缀合基团。
5、另一方面，本公开提供了一种核酸蛋白复合物，其包含上述sirna双链体的双链区或双链区的反义链，以及核酸酶。
6、另一方面，本公开提供了一种重组载体，包含编码上述sirna双链体的核酸分子。
7、一些实施方案中，所述重组载体的载体骨架选自重组类病毒衍生的环状rna载体、trna、rrna支架和嵌合trna/pre-mi rna载体。
8、另一方面，本公开提供了一种重组细胞，其合成并分泌上述sirna双链体。
9、一些实施方案中，所述重组细胞选自嗜硫红假单胞菌和核糖核酸酶iii缺陷的谷氨酸棒状杆菌。
10、另一方面，本公开提供了一种制备sirna双链体的方法，包括培养上述重组细胞，或化学合成。
11、另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括上述sirna双链体、上述缀合物，或者上述核酸蛋白复合物，以及药学上可接受的载体。
12、另一方面，本公开提供了一种抑制lpa基因表达的方法，包括将上述sirna双链体、上述缀合物、上述核酸蛋白复合物、或上述药物组合物与靶细胞接触。
13、一些实施方案中，所述方法为非诊断或非治疗目的的。
14、一些实施方案中，所述方法为体内的或体外的。
15、另一方面，本公开提供了一种上述sirna双链体、上述缀合物、上述核酸蛋白复合物、或上述药物组合物在制备治疗与lpa基因表达相关疾病的药物中的应用。
16、所述lpa基因表达相关疾病选自apo(a)蛋白过表达、lpa基因致病突变、apo(a)蛋白代谢异常、lpa或apo(a)与另一物质的异常相互作用导致的疾病。
17、一些实施方案中，所述lpa基因表达相关疾病选自伯格氏病(berger’s disease)、外周动脉疾病、冠状动脉疾病、代谢综合征、急性冠脉综合征、主动脉瓣狭窄、主动脉瓣反流、主动脉夹层、视网膜动脉阻塞、脑血管疾病、肠系膜缺血、肠系膜上动脉阻塞、肾动脉狭窄、稳定型/不稳定型心绞痛、急性冠脉综合征、杂合子或纯合子家族性高胆固醇血症、高载脂蛋白β脂蛋白血症、脑血管动脉粥样硬化、脑血管疾病和静脉血栓形成、中风、动脉粥样硬化、血栓形成、冠心病或主动脉瓣狭窄和/或与lp(a)颗粒的水平升高相关的任何其他疾病以及其他尚未鉴定的相关病症、病理或综合征。
18、另一方面，本公开提供了一种上述sirna双链体、上述缀合物、上述核酸蛋白复合物、或上述药物组合物用于治疗与lpa基因表达相关疾病。
19、另一方面，本公开提供了一种用于治疗与lpa基因表达相关疾病的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的上述sirna双链体、上述缀合物、上述核酸蛋白复合物、或上述药物组合物。
20、另一方面，本公开提供了一种上述sirna双链体、上述缀合物、上述核酸蛋白复合物、或上述药物组合物在制备预防或治疗动脉粥样硬化和心脑血管疾病药物中的应用。
21、另一方面，本公开提供了一种上述sirna双链体、上述缀合物、上述核酸蛋白复合物、或上述药物组合物用于预防或治疗动脉粥样硬化和心脑血管疾病。
22、另一方面，本公开提供了一种用于预防或治疗动脉粥样硬化和心脑血管疾病的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的上述sirna双链体、上述缀合物、上述核酸蛋白复合物、或上述药物组合物。
23、本公开所取得的有益效果至少如下：
24、（1）sirna基础序列，例如sirna b01001、b01023、b01042、b01047、b02417、b06001、b01801、b01012，对lpa基因均具有显著抑制作用，抑制率最高可超过50%。
25、（2）本公开的sirna修饰物对于lpa基因的抑制率最高可达70%以上。并且，修饰物与galnac缀合基团连接后形成相应的sirna缀合物，可以高效递送至动物肝脏，并显著抑制lpa基因，显著降低血清lp(a)蛋白水平。
26、（3）本公开采用交替修饰和本公开修饰模板修饰的各序列，同现有技术公开的序列差异很小的sirna相比，对lpa抑制活性均显著提升，最多可提高36.0%。