本发明涉及一种血小板源性生长因子bb(pdgf bb)的制备方法，属于生物。
背景技术：
1、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，pdgf)是一种可刺激结缔组织增生的常见肽类调节因子，由骨髓巨噬细胞合成，贮存于血小板q颗粒中。pdgf是碱性糖蛋白，分子量为28～35kd，是由两亚基(a链和b链)通过二硫键结合而成的两条多肽链的二聚体。pdgf是一种重要的促细胞分裂剂，能刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞等多种细胞的分裂和增殖，对个体发育、细胞分化具有调节作用，在创伤愈合中作用突出。pdgf最初是从血小板分离的，内皮细胞、血管平滑肌细胞、激活的单核细胞和巨噬细胞等均能产生pdgf，由两条不同的多肽链组成，由二硫键连接成二聚体，二聚体不同的组合形成三个异构体即pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab。pdgf有两种不同的受体称为α和β，是跨膜的糖蛋白，在细胞外受体结合区共有5个免疫球蛋白样的区域，在细胞质区域有酪氨酸蛋白激酶。受体α识别pdgf-aa和pdgf-bb，所以可以高亲和力地结合3种pdgf异构体。受体β识别pdgf-bb，只能高亲和力地结合pdgf-bb，低亲和力地结合pdgf-ab，不结合pdgf-aa。受体结合pdgf后形成二聚体形式，会出几种不同的情形，两种受体介导的细胞效应也不同，所以结合后的效应由受体的类型决定。作为pdgf/vegf生长因子家族的关键成员，表明其在细胞信号传导和组织发育中发挥着至关重要的作用。
2、作为该生长因子家族的一部分，pdgf-bb可能与相关蛋白质具有保守的结构和功能特征，有助于细胞生长、血管生成和血管发育。它属于pdgf/vegf生长因子家族，突显了其在协调组织稳态所需的基本生理过程中的重要性。pdgf-bb的研究深入了解了其在生长因子家族背景下的特定功能，提供了在治疗干预中的潜在应用，并更深入地了解了其对涉及血管发育和维护的细胞过程的更广泛影响。对pdgf-bb作用的进一步探索有望增强我们对其对正常生理和病理状况的贡献的理解。目前pdgf-bb的生产方法为大肠杆菌表达后用反向纯化分离单体和二体。反向纯化柱的价格昂贵，且在此纯化过程中需使用有机溶剂，成本高且属于危险化学品，在开发过程中易造成环境污染及实验事故，存在安全隐患。本发明提供的生产工艺安全，简单，特异性高，更利于大规模生产且降低成本。
技术实现思路
1、本发明的目的是：针对现有技术的不足，本发明旨在一种血小板源性生长因子bb的制备方法。
2、为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：
3、本发明提供一种血小板源性生长因子bb的制备方法，包括下列步骤：
4、步骤1)血小板源性生长因子bb的编码基因克隆植入原核表达载pet 28a(+)，构建成重组原核表达载体；
5、步骤2)将步骤1构建的重组原核表达载体转入原核宿主细胞大肠杆菌bl21-codonplus-ripl；
6、步骤3)培养步骤2的原核宿主细胞，使其表达出非可溶性含血小板源性生长因子bb的融合蛋白；
7、步骤4)亲和层析纯化分离出含血小板源性生长因子bb的融合蛋白，在复性之后，通过离子交换的方法分离二体活性蛋白。
8、优选地，所述步骤1)中血小板源性生长因子bb的编码基因如seq id no：1所示。
9、优选地，所述步骤4)具体包括以下步骤：
10、步骤4.1)离心分离发酵液中的菌体，破菌，离心，取包涵体沉淀进行溶解；
11、步骤4.2)溶解后的上清蛋白采用亲和层析法初步分离血小板源性生长因子bb融合蛋白；
12、步骤4.3)复性已分离的血小板源性生长因子bb融合蛋白；
13、步骤4.4)离子交换的方法分离血小板源性生长因子单体和二体，并收获二体蛋白；
14、步骤4.5)缓冲体系置换获得有活性的二体蛋白。
15、优选地，所述步骤4.2)中亲和层析法采用的填料为ni-ted，洗脱液为咪唑溶液。
16、优选地，所述步骤4.4)为：将步骤4.3)收集的蛋白浓缩后进行透析换液，之后过离子交换柱进行梯度洗脱。
17、优选地，所述洗脱梯度达到60倍柱体积。
18、优选地，所述离子交换柱为sp sepharose f.f.离子交换柱。
19、优选地，所述步骤4.5)中的缓冲体系为4mm hcl水溶液。
20、本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
21、本发明采用亲和层析和离子交换的方法进行纯化，该纯化方法纯化后的目的蛋白纯度可达98％以上，较之前的反向纯化方法既减少了纯化的步骤，避免了实验繁琐，又在此过程中增加了蛋白的回收率，因反向纯化柱的价格昂贵，此方法在开发过程中减少了成本支出，固此方法既满足纯化步骤简洁又节约开发成本的优势。
1.一种血小板源性生长因子bb的制备方法，其特征在于，包括下列步骤
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中血小板源性生长因子bb的编码基因如seq id no：1所示。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)具体包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4.2)中亲和层析法采用的填料为ni-ted，洗脱液为咪唑溶液。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中，所述步骤4.4)为：将步骤4.3)收集的蛋白浓缩后进行透析换液，之后过离子交换柱进行梯度洗脱。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述离子交换柱为sp sepharose f.f.离子交换柱。