本发明属于植物基因工程，具体涉及中国菰zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达在提高水稻种子类黄酮含量中的应用。
背景技术：
1、类黄酮化合物是植物主要的次生代谢产物，具有很强的抗氧化活性和保健作用。类黄酮包括7个主要亚类：黄酮醇、黄酮、异黄酮、花青素、黄烷酮、黄烷醇和查尔酮。随着生活水平的提高和对营养健康认识的不断深入，人们对稻米品质、营养成分及保健作用也越来越重视，有色稻米因其在抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗糖尿病、抗癌和抗衰老等方面对人体健康的有益作用而备受消费者以及营养学家的广泛关注。有色稻米的种皮因富含不同类型的类黄酮化合物而呈现出不同的颜色，如棕色、红色、紫色和黑色等。其中，紫色、黑色种皮一般是由花青素的积累形成，而棕色、红色种皮是由于原花青素的积累形成。虽然有色稻米中富含原花青素或花青素等类黄酮化合物，但是其主要在种皮中富集，其胚乳中基本不含类黄酮。
2、中国菰(zizania latifolia)属于禾本科(gramineae)稻族(oryzeae)菰属(zizania)，具有悠久的食用历史和文化意义。中国菰米除了包含碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质外，还含有类黄酮等生物活性物质，是一种对健康有益的全谷物。可以将中国菰米加入到人们的日常饮食中用于预防慢性疾病和代谢性疾病等，例如糖尿病、肥胖和心血管疾病等。前期的研究发现，中国菰米类黄酮含量和抗氧化活性高于普通籼米、粳米和红米，是一种天然抗氧化剂来源。申请人团队从中国菰中鉴定出34种酚酸和黄酮类化合物，而且类黄酮(主要为原花青素和黄酮糖苷)对其抗氧化活性的贡献要大于酚酸。与稻米相比，中国菰米中有72种类黄酮上调、6种类黄酮下调。因此，中国菰米富含类黄酮化合物，尤其是富含稻米中所缺乏的类黄酮化合物。
3、植物类黄酮的生物合成受转录因子的调控，主要包括myb、basic helix-loop-helix(bhlh)、wd40及其组成的mbw(myb-bhlh-wd40)蛋白复合体。在类黄酮生物合成途径中，早期生物合成基因参与共同前体合成，晚期生物合成基因是类黄酮生物合成途径的下游基因。mbw转录因子及其蛋白复合物可以结合到类黄酮合成结构基因的启动子上来激活(或抑制)其表达进而对类黄酮合成过程进行调控。在水稻中，rc属于调控类黄酮合成的bhlh转录因子；中国菰zlrc与水稻rc是同源基因，zlrc基因过表达使水稻种子由无色变为棕色，增加水稻种子的酚类化合物含量、抗氧化活性以及类黄酮生物合成相关酶的基因表达量和酶活性。在“紫香糯1”水稻中敲除osmyb3基因能够使其种皮由黑色变为棕色，种子花青素含量显著降低，且降低到检测限以下。中国菰zlmyb1基因与水稻中的osmyb3基因为同源基因，zlmyb1在osmyb3基因敲除的“紫香糯”水稻中的过表达能够使水稻种子由棕色变为黑色，并显著提高了水稻种子的花青素含量、抗氧化活性以及花青素生物合成关键基因的表达量及其酶活性显著升高。
4、稻米是我国65％以上人口的主食，消费量占全部粮食消费量的40％左右。应用现代生物技术培育具有保健作用的功能性水稻种质，对改善我国以稻米为主食人群的营养与健康状况、促进我国农业产业结构转变、提高农民种粮效益及助推乡村振兴具有重要意义。虽然有色稻米中富含原花青素或花青素等类黄酮化合物，但是其主要在种皮中富集，其胚乳中基本不含类黄酮。值得关注的是，中国菰米富含类黄酮化合物，尤其是富含稻米中所缺乏的类黄酮化合物；zlrc为调控类黄酮合成的关键bhlh转录因子，zlmyb1调控花青素合成的关键myb转录因子。因此，从已经完成基因功能鉴定的中国菰zlrc和zlmyb1基因入手，对其进行基因聚合和胚乳特异性表达，创制出胚乳富含类黄酮的水稻新种质，对改善居民膳食结构和降低造成慢性疾病的膳食风险因素都具有重要的现实意义和应用前景。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提高水稻种子类黄酮含量，提出了中国菰zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达在提高水稻种子类黄酮含量中的应用。本发明对中国菰zlrc和zlmyb1基因进行基因聚合和胚乳特异性表达后，水稻种子的类黄酮含量显著增加。
2、本发明的技术方案是：
3、中国菰zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达在提高水稻种子类黄酮含量中的应用，所述zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达载体如图1所示。
4、进一步的，将构建的zlrc和zlmyb1基因水稻胚乳特异性表达载体转入水稻中，得到能够过表达zlrc和zlmyb1的转基因水稻。
5、进一步的，将所述过表达载体通过化学转化方式转化到农杆菌中，通过农杆菌浸染愈伤组织的方式，获得独立转化体，通过植株再生，获得种子类黄酮含量显著提高的转基因水稻。
6、本发明的有益效果：
7、(1)本发明采用pcr技术，从中国菰cdna文库中扩增得到zlrc和zlmyb1的序列片段，依次将其构建到水稻胚乳特异性表达载体上，利用该载体转化水稻，通过提高水稻种子胚乳中zlrc和zlmyb1基因表达量而获得种子类黄酮含量显著提高的转基因水稻。
8、(2)本发明提供了中国菰zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达在提高水稻种子类黄酮含量中的应用。在与对照水稻植株生长环境一致的情况下，zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达的水稻所收获的种子与对照相比，具有更高的总酚、总黄酮和总原花青素含量以及更高的dpph自由基清除能力和abts·+自由基吸收能力。这说明zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达对水稻胚乳类黄酮化合物的合成途径具有有效调控作用，提高了转基因水稻种子中的类黄酮含量。
9、(3)本发明获得的zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达水稻与对照水稻种皮均为无色。因此，与对照相比，zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达水稻种子中增加的类黄酮主要在胚乳中富集，并未引起种皮颜色变化。
1.中国菰zlrc和zlmyb1基因胚乳特异性表达在提高水稻种子类黄酮含量中的应用，其特征在于，构建zlrc和zlmyb1基因水稻胚乳特异性表达载体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将构建的zlrc和zlmyb1基因水稻胚乳特异性表达载体转入水稻中，得到能够过表达zlrc和zlmyb1的转基因水稻。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将zlrc和zlmyb1基因序列构建到水稻胚乳特异性表达载体上，将所述过表达载体转入水稻中，通过提高水稻种子胚乳中zlrc和zlmyb1基因表达量而获得种子类黄酮含量显著提高的转基因水稻。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述过表达载体通过化学转化方式转化到农杆菌中，通过农杆菌浸染愈伤组织的方式，获得独立转化体，通过植株再生，得到所述转基因水稻。