本发明属于生物，具体涉及一种单域抗体的高通量筛选方法。
背景技术：
1、羊驼属于驼科动物，天然具有缺失轻链的单重链抗体，重链缺失了ch1区域，重链可变区称之为单域抗体，分子量大小为15kda。因此，羊驼单域抗体具有分子量小、cdr3长度长、没有轻链的特点，被广泛的应用于双特异性治疗抗体、细胞治疗的car、核酸药物等多种类型的药物开发。目前，羊驼单域抗体的开发主要利用噬菌体展示技术，通过pcr技术扩增获得抗体序列，再将抗体序列构建到phagemid载体上与噬菌体表面的piii蛋白融合表达，最后展示到噬菌体表面上。建好的噬菌体库通过多轮的抗原筛选富集后，挑取单克隆的噬菌体，进一步通过elisa获得阳性噬菌体，再通过一代测序获得单域抗体序列。
2、传统的利用噬菌体筛选抗体的方法是展示到噬菌体的表面，在抗原筛选过程中由于噬菌体体积大，表面蛋白多不可避免的造成非特异结合的问题；同时在噬菌体筛选过程中需要挑取很多的单克隆，工作量大且获得的抗体序列数量少。随着富集的越多，挑取的阳性噬菌体通过一代测序后可能产生很多的重复序列，使筛选得到的序列数量较少。
3、综上可知，现有的羊驼单域抗体由于缺失轻链，可以直接用噬菌体展示平台或者酵母展示平台技术进行筛选，但是筛选通量和效率都不能满足单域抗体开发的需求，这就使得开发一种单域抗体的高通量筛选方法至关重要。
技术实现思路
1、针对上述难题，本发明提供了一种单域抗体的筛选方法，结合噬菌体建库和单细胞乳化技术，将噬菌体筛选和单细胞测序结合起来，解决了噬菌体筛选存在的非特异结合问题，同时提高了噬菌体筛选的效率。
2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
3、一种单域抗体的高通量筛选方法，包括抗原的制备与免疫、噬菌体文库的构建、单域抗体的淘选、抗体序列的表达验证；所述单域抗体的淘选通过单细胞乳化技术实现，在乳化的油滴中磁珠同时捕获单域抗体和单域抗体的核酸序列，反转录后的磁珠用流式分选获得阳性的磁珠，阳性磁珠通过靶向扩增获得单域抗体dna，抗体dna再通过ngs测序获得单域抗体序列；
4、所述单域抗体的淘选过程包括以下步骤：
5、s1、磁珠制备：将抗原蛋白与单域抗体的mrna序列互补的dna探针分别用生物素标记，进一步制成含抗原蛋白和dna探针的磁珠；
6、s2、磁珠的乳化：将大肠杆菌和步骤s1制得的磁珠混合乳化，获得乳化后的油滴；
7、s3、磁珠捕获抗体和核酸：将步骤s2获得的乳化后的油滴反复冻融，使其裂解出单域抗体和抗体mrna序列，然后利用磁珠上的抗原蛋白捕获单域抗体，同时磁珠上的dna探针能够捕获mrna序列，清洗后回收磁珠；
8、s4、mrna反转录：将步骤s3回收的磁珠进行反转录，获得反转录磁珠；
9、s5、流式分选阳性磁珠：将步骤s4获得的反转录磁珠进行流式分选，分选出荧光阳性磁珠；
10、s6、靶向抗体序列验证：将步骤s5分选出的荧光阳性磁珠进行pcr扩增、测序，然后进行序列拼接和分析，即可。
11、优选地，步骤s1所述的dna探针的序列如seq id no.1所示。
12、ggagggaaggtaaatattga（seq id no.1）。
13、优选地，步骤s2所述的微生物细菌为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌中的一种。
14、优选地，步骤s3所述的反复冻融过程为：将步骤s2获得的乳化后的油滴于-80~-70℃下冻20~25min，再于35~37℃融化3~6min，油滴反复冻融4~7次。在实际捕获过程中，需严格控制冻融条件，保证磁珠同时捕获单域抗体和mrna序列。
15、优选地，步骤s4的具体过程如下：收集步骤s3回收的磁珠后先反转录，将抗体mrna反转录成cdna，向其中加入荧光二抗标记磁珠。
16、优选地，所述荧光二抗标记为anti-flag apc、anti-flag pe、anti-flag af488中的一种。
17、优选地，步骤s6所述的序列拼接采用spades、unicycler、masurca软件中的一种。
18、本发明还提供了一种所述高通量筛选方法筛选出的单域抗体在制备抗原活性检测试剂中的应用。
19、将扩增的单域抗体序列，切胶回收目的片段后进行ngs测序。测序后经过序列拼接和分析获得单域抗体序列，然后挑选单域抗体序列，通过哺乳动物细胞表达系统进行表达，在纯化后用于体外功能检测实验。
20、与现有技术相比，本发明的技术优势如下：本发明通过结合噬菌体建库技术和单细胞技术，避免了用整个噬菌体进行蛋白抗原的富集，而是直接用单域抗体筛选，同时结合ngs测序可以获得所有的阳性单域抗体序列，成功的帮助单域抗体的高通量筛选，并显著提高了单域抗体的筛选效率。
1.一种单域抗体的高通量筛选方法，其特征在于，包括抗原的制备与免疫、噬菌体文库的构建、单域抗体的淘选、抗体序列的表达验证；所述单域抗体的淘选通过单细胞乳化技术实现，在乳化的油滴中磁珠同时捕获单域抗体和单域抗体的核酸序列，反转录后的磁珠用流式分选获得阳性的磁珠，阳性磁珠通过靶向扩增获得单域抗体dna，抗体dna再通过ngs测序获得单域抗体序列；
2. 如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤s1所述的dna探针的序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤s2所述的微生物菌株为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、双歧杆菌中的一种。
4.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤s3所述的反复冻融过程为：将步骤s2获得的乳化后的油滴于-80~-70℃下冻20~25min，再于35~37℃融化3~6min，油滴反复冻融4~7次。
5.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤s4的具体过程如下：收集步骤s3回收的磁珠后先反转录，将抗体mrna反转录成cdna，向其中加入荧光二抗标记磁珠。
6. 如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述荧光二抗标记为anti-flagapc、anti-flag pe、anti-flag af488中的一种。
7.如权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤s6所述的序列拼接方式采用spades、unicycler、masurca软件中的一种。
8. 根据权利要求1所述的高通量筛选方法获得的抗human pd-l1单域抗体，其特征在于，所述抗human pd-l1单域抗体的氨基酸序列为seq id no.4，seq id no.5，seq idno.6，seq id no.7，seq id no.8，seq id no.9，seq id no.10，seq id no.11，seq idno.12，seq id no.13中的一种或多种。
9.一种如权利要求1-7任一项所述高通量筛选方法筛选出的单域抗体在制备抗原活性检测试剂中的应用。