本发明部分地提供了含有醚基且为式(i)的新型可电离脂质或其药学上可接受的盐。本文描述的化合物可用于开发脂质纳米颗粒制剂以及有效且安全地递送寡核苷酸用于包括但不限于mrna疫苗、mrna疗法、sirna疗法、基因疗法等应用。发明背景基于核酸的疗法可以对人类健康有巨大的影响，最近的例子是covid-19 mrna疫苗和它在抗击全球大流行中所扮演的关键角色。虽然基于核酸的疗法有许多种不同的模式，例如mrna、sirna、aso和dna，但关键的挑战仍然同样是物质的有效的且安全的递送。（safety and efficacy of the bnt162b2 mrna covid-19 vaccine, n engl jmed 2020; 383: 2603-2615, doi: 10.1056/nejmoa2034577）在mrna相关疗法的背景下，有效且安全地将mrna递送至感兴趣的靶点对于例如预防性疫苗、治疗性疫苗、mrna疗法和基因组编辑等应用至关重要。因此，开发了一种被称为脂质纳米颗粒（lnp）的强大的递送载体以1）保护mrna免于rnase降解，2）细胞内递送mrna，以便其可被翻译成会具有下游治疗效果的对应的蛋白质。（lipid nanoparticles for mrna delivery, hou, x., zaks, t., langer, r.et al. nat rev mater 6, 1078-1094 (2021).https://doi.org/10.1038/s41578-021-00358-0）虽然lnp通常由4或5种不同的脂质组分制成，但最重要的脂质是可电离脂质，因为它使lnp能够1）有效封装和保护mrna以及2）将mrna有效递送至发生翻译的细胞的胞质的溶胶。仍然迫切需要用于寡核苷酸递送的改进的可电离脂质和lnp制剂。具体而言，具有较高稳定性、可扩展性、结构多样性和较高治疗指数的可电离脂质/lnp，会进一步释放基于核酸的疗法的潜力。（lipids and lipid derivatives for rna delivery, chem. rev. 2021, 121,20, 12181–12277; han, x., zhang, h., butowska, k. et al. an ionizable lipidtoolbox for rna delivery. nat commun 12, 7233 (2021).https://doi.org/10.1038/s41467-021-27493-0）
背景技术：
技术实现思路
1、简而言之，本发明提供了可电离脂质化合物的合成和应用，包括其药学上可接受的盐，其与其它脂质组分例如辅助脂质、带电荷脂质、类固醇、peg脂质或相关类似物组合使用，形成lnp以及递送寡核苷酸治疗剂。这些脂质和相关的lnp的治疗应用包括sirna疗法、预防性mrna疫苗、治疗性mrna疫苗、mrna疗法、基因组编辑。
2、在一种实施方案中，提供具有以下结构的化合物：
3、(i)
4、或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中y、q、r、r1、r2、m、n和o如本文所定义。
5、在本发明中，所有可电离脂质均以5-6个相对简单的步骤合成，并且相比于行业金标准例如sm102，许多都在体内展现出了更优异的功效，这证明本文所呈现的所述脂质的高递送功效。
6、此外，由这些可电离脂质制成的lnp在临床前动物模型中具有良好的耐受性，同时提供了足够的治疗指数。因此，据信使用来自本发明的这些lnp以mrna的有效剂量治疗患者不应与不可接受的毒性和/或副作用相关联。本发明提供了本领域中其它技术可能无法提供的这些和相关的优点。
7、本发明意在保护本文所列的可电离脂质的化学结构，以及结构相似的脂质。本发明还旨在保护在lnp制剂的背景下本文的可电离脂质的用途，以及寡核苷酸疗法应用，例如sirna疗法、基因疗法、mrna疗法、mrna疫苗。
8、基于当前发明，可以合成额外的可电离脂质以拓展和进一步优化本文提供的可电离脂质库。此外，可以对本文呈现的可电离脂质进行进一步的lnp制剂优化，以进一步改善lnp的各个方面，例如功效、稳定性、毒性等。
9、附图简述
10、在附图中，相同的参考编号标识类似的要素。图中要素的尺寸和相对位置不一定是按比例绘制的，并且这些要素中的一些被任意地放大和放置以改进图的易读性。而且，所绘制要素的特定形状并非旨在表达有关特定要素的实际形状的信息，并且仅选择以便易于图中的识别。
11、图1示出了vzv ge变体mrna/候选阳离子脂质疫苗诱导的vzv ge-特异性血清总igg。
12、图2示出了储存期间不同时间点lnp的尺寸和封装效率(ee%)。
13、图3示出了lnp的血清总人促红细胞生成素(hepo)水平。
14、发明详述
15、在以下描述中，阐述了某些具体细节以提供对本发明各种实施方案的透彻理解。然而，本领域技术人员会理解，无需这些细节也可以实施本发明。
16、定义
17、如本文所使用的，除非另外限定，以下术语具有它们被赋予的含义。
18、除非上下文另外需要，在本说明书和权利要求书中，词语“包含（comprise）”及其变形，例如“包括”和“含有”是以开放且包括的含义解释的，即，为“包括，但不限于”。
19、在本说明书中，提及“一种实施方案”或“实施方案”意指结合所述实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在本说明书中各处出现的短语“在一种实施方案中”或“在实施方案中”不一定是全部指同一种实施方案。此外，所述特定特征、结构或特性可以以任何适合的方式在一种或多种实施方案中相结合。
20、除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。如本说明书和权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指定，单数形式“一种/一个（a）”、“一种/一个（an）”和“所述”包括复数指代物。
21、活性剂或治疗剂（例如治疗性核酸）的“有效量”或“治疗有效量”是足以产生期望效果的量，所述期望效果例如，相比不存在核酸时检测的靶序列的正常表达水平，对靶序列表达的增加或抑制。当在不存在核酸下不存在表达产物的情况下检测到任何可测量水平时，实现了靶序列表达的增加。在与核酸接触前，表达产物以一定水平存在的情况下，相对于对照，当使用例如mrna的核酸得到的值的提高倍数为约1.05、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.75、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100、250、500、750、1000、5000、10000或更大时，实现了表达增加。相对于对照，当使用例如反义寡核苷酸的核酸得到的值为约95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或0%时，实现了靶基因或靶序列表达的抑制。测量靶基因或靶序列表达的适合的测定包括，例如，使用本领域技术人员已知的技术进行的蛋白质或rna水平的检验，所述技术例如本领域技术人员已知的斑点印迹、northern印迹、原位杂交、elisa、免疫沉淀、酶功能、适合的报告蛋白的荧光或发光以及表型测定。
22、如本文所使用的，术语“核酸”指含有单链或双链形式的至少两个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物，并且包括dna、rna及其杂合体。dna可以是以下形式：反义寡核苷酸、质粒dna、cdna、pcr产物或载体。rna可以是以下形式：小发夹rna(shrna)、信使rna(mrna)、反义rna、mirna、micrna、多价rna、dicer底物rna或病毒rna(vrna)，及其组合。核酸包括含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或连接的核酸，其是合成的、天然发生的和非天然发生的，并且具有与参考核酸类似的结合性质。这类类似物的实例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2’-o-甲基核糖核苷酸以及肽-核酸（pna）。除非特别限定，该术语涵盖含有具有与参考核酸类似的结合性质的已知天然核苷酸的类似物的核酸。除非另外表明，特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体（例如，简并密码子取代）、等位基因、直系同源物、单核苷酸多态性、和互补序列以及明确表明的序列。特别地，可以通过生成一个或多个所选（或全部）密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（batzer等人, nucleic acid res., 19:5081 (1991); ohtsuka等人, j. biol. chem., 260: 2605-2608 (1985); rossolini等人, mol. cell. probes, 8: 91-98 (1994)）。“核苷酸”含有糖（脱氧核糖（dna）或核糖（rna））、碱基和磷酸基团。核苷酸通过磷酸基团连接在一起。“碱基”包括嘌呤和嘧啶，其进一步包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于配置新反应基团的修饰，所述新反应基团例如，但不限于，胺、醇、硫醇、羧化物和烷基卤化物。
23、术语“基因”指包含产生多肽或前体多肽所必须的部分长度或全长的编码序列的核酸（例如，dna或rna）序列。
24、如本文所使用的，“基因产物”指例如rna转录物或多肽的基因产物。
25、术语“脂质”指一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸的酯，并且特征通常为在水中有着差的溶解性，但在很多种有机溶剂中可溶。它们通常被分为至少三类：（1）“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；（2）“化合物脂质”，其包括磷脂和糖脂；以及（3）“衍生脂质”，例如类固醇。
26、“类固醇”为包含以下碳骨架的化合物：
27、
28、类固醇的非限定性实例包括胆固醇等。
29、“可电离脂质”指具有至少一个可质子化或可去质子化基团的脂质，使得该脂质在处于或低于生理ph的ph下带正电荷，并且在第二ph、优选处于或高于生理ph时为中性。本领域技术人员会理解，作为ph的函数的质子的添加或除去是平衡过程，并且提及带电荷或中性脂质是指主要物种的性质并且不需要所有脂质均以带电荷或中性形式存在。
30、术语“聚合物缀合脂质”指包含脂质部分和聚合物部分两者的分子。聚合物缀合脂质的实例是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”指包含脂质部分和聚乙二醇部分两者的分子。聚乙二醇化脂质为本领域已知的，并且包括1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油（peg-dmg）等。
31、术语“中性脂质”指在选定的ph下以无电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质物种中的任一种。在生理ph下，此类脂质包括但不限于磷脂酰胆碱，例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（dspc）、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（dppc）、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（dmpc）、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（popc）、1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱（dopc），磷脂酰乙醇胺如1,2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺（dope），鞘磷脂（sm），神经酰胺，类固醇如甾醇及其衍生物。中性脂质可以是合成的或天然衍生的。
32、术语“带电荷脂质”指以带正电荷或带负电荷的形式存在的许多脂质物种中的任一种，不依赖于在有用的生理学范围内的ph，例如ph~3至ph~9。带电荷脂质可以是合成的或天然衍生的。带电荷脂质的实例包括磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、甾醇半琥珀酸酯、二烷基三甲铵-丙烷（例如dotap、dotma）、二烷基二甲基氨基丙烷、乙基磷酸胆碱、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基甾醇（例如dc-chol）。
33、术语“脂质纳米颗粒”指具有至少一个维度在纳米量级上（例如，1至1,000 nm）的颗粒，其包括一种或多种结构(i)的化合物或其它特定阳离子脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒被包含在可用于将例如核酸（例如，mrna）的活性剂或治疗剂递送至感兴趣的靶位点（例如，细胞、组织、器官、肿瘤等）的制剂中。在一些实施方案中，本发明的脂质纳米颗粒包含核酸。这类脂质纳米颗粒通常包含结构(i)的化合物以及一种或多种选自中性脂质、带电荷脂质、胆固醇和聚合物缀合脂质的赋形剂。在一些实施方案中，例如核酸的活性剂或治疗剂可以封装于脂质纳米颗粒的脂质部分中或封装于由脂质纳米颗粒的一些或全部脂质部分包裹的水性空间中，从而保护其避免酶促降解或避免由宿主生物体或细胞的机制诱导的其它不期望的作用，例如不良的免疫应答。
34、在各种实施方案中，所述脂质纳米颗粒具有以下的平均直径：约30 nm至约150nm、约40 nm至约150 nm、约50 nm至约150 nm、约60 nm至约130 nm、约70 nm至约110 nm、约70 nm至约100 nm、约80 nm至约100 nm、约90 nm至约100 nm、约70至约90 nm、约80 nm至约90 nm、约70 nm至约80 nm、或约30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm、55 nm、60 nm、65 nm、70nm、75 nm、80 nm、85 nm、90 nm、95 nm、100 nm、105 nm、110 nm、115 nm、120 nm、125 nm、130 nm、135 nm、140 nm、145 nm或150 nm，并且是基本无毒的。在某些实施方案中，核酸，当存在于脂质纳米颗粒时，其在水溶液中抵抗被核酸酶降解。再例如，美国专利公开号2004/0142025、2007/0042031和pct公开第wo 2013/016058号和第wo 2013/086373号中公开了包含核酸的脂质纳米颗粒及其制备方法，其全部公开内容为了所有目的通过引用整体并入本文。
35、如本文所使用的，“脂质封装的”指为例如核酸（例如，mrna）的活性剂或治疗剂提供完全封装、部分封装或二者的脂质纳米颗粒。在一种实施方案中，所述核酸（例如，mrna）被完全封装于脂质纳米颗粒中。
36、如本文所使用的，术语“水溶液”指包含水的组合物。
37、就核酸-脂质纳米颗粒而言，“血清稳定的”意指核苷酸在暴露于血清后或在暴露于会显著降解游离dna或rna的核酸酶测定后，不会显著降解。适合的测定包括，例如，标准的血清测定、dna酶测定或rna酶测定。
38、如本文所使用的，“全身性递送”指可以导致活性剂在生物体内广泛暴露的治疗性产物的递送。
39、一些施用技术可以导致某些试剂的全身性递送，但不会全身性递送其它试剂。全身性递送意味着有用量的，优选治疗量的试剂暴露于身体的多数部位。脂质纳米颗粒的全身性递送可以通过本领域已知的任何方式进行，包括，例如，静脉内、动脉内、皮下和腹膜内递送。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的全身性递送通过静脉内递送。
40、如本文所使用的，“局部递送”指将活性剂直接递送至生物体内的靶位点。例如，可以通过直接注入例如肿瘤的疾病位点，例如炎症位点的其它靶位点，或例如肝、心脏、胰腺、肾等靶器官中来局部递送试剂。局部递送也可以包括局部应用或局部注射技术，例如肌内、皮下或皮内注射。局部递送不妨碍全身性的药理学作用。
41、如本文所使用的，术语“烷烃”指饱和烃化合物。例如，c1-20烷烃指具有1至20个碳原子的烷基。烷烃可以任选地被杂原子（例如，1、2或3个杂原子）替代，所述杂原子是除碳以外的元素，包括但不限于氮、氧和硫。例如，被两个o原子替代的c4烷烃指具有两个碳原子和两个氧原子的烷基。可以使用其它标识符来指示烷烃中特定基团的存在（例如，卤代烷烃指示存在一个或多个替代烷烃中等量数量氢原子的卤原子）。术语“烷基”在本文中根据iupac规定的定义使用：通过从烷烃中除去一个氢原子形成的单价基团。类似地，“亚烷基基团”指通过从烷烃中除去两个氢原子（一个碳原子上的两个氢原子或两个不同碳原子上的两个氢原子）形成的基团。“烷烃基团”是一个通用术语，其指通过从烷烃中除去一个或多个氢原子（对于特定基团来说根据需要）形成的基团。“烷烃基团”可以是直链或支链的。伯烷基、仲烷基和叔烷基分别通过从烷烃的伯碳原子、仲碳原子、叔碳原子上除去氢原子衍生得到。基团rch2(r≠h)、r2ch(r≠h)和r3c(r≠h)分别是伯烷基、仲烷基和叔烷基。正烷基可通过从直链烷烃的末端碳原子上除去氢原子而衍生得到。
42、如本文所使用的，术语“烯烃”指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃类烯烃。例如，c2-20烯烃指具有2至20个碳原子的烯基。烯烃可以任选地被杂原子（例如，1、2或3个杂原子）替代，所述杂原子是除碳以外的元素，包括但不限于氮、氧和硫。例如，被两个o原子替代的c4烯烃指具有两个碳原子和两个氧原子的烯基。只有一个，只有两个，只有三个等多重键的烯烃，这类多重键可以通过在名称中使用术语“单”、“双”、“三”等来标识。
43、“烯基基团”是通过从烯烃的任意碳原子上除去氢原子而衍生自烯烃的单价基团。因此，“烯基基团”包括其中氢原子在形式上从sp2杂化（烯属）碳原子上除去的基团和其中氢原子在形式上从任何其它碳原子上除去的基团。例如且除非另外限定，1-丙烯基(-ch=chch3)、2-丙烯基[(ch3)c=ch2]和3-丙烯基(-ch2ch=ch2)均被术语“烯基”所涵盖。类似地，“亚烯基基团”指通过在形式上从烯烃除去两个氢原子（从一个碳原子上除去两个氢原子或从两个不同碳原子上除去两个氢原子）形成的基团。“烯烃基团”指通过从烯烃中除去一个或多个氢原子（对于特定基团来说根据需要）形成的概括性基团。
44、如本文所使用的，术语“炔烃”指具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链烃。例如，c2-20炔烃指具有2至20个碳原子的炔基。炔烃可以任选地被杂原子（例如，1、2或3个杂原子）替代，杂原子是除碳以外的元素，包括但不限于氮、氧和硫。例如，被两个o原子替代的c4炔烃指具有两个碳原子和两个氧原子的炔基。只有一个，只有两个，只有三个等多重键的炔烃，这类多重键可以通过在名称中使用术语“单”、“双”、“三”等来标识。
45、“炔基基团”是通过从炔烃的任意碳原子上除去氢原子而衍生自炔烃的单价基团。因此，“炔基”包括其中氢原子在形式上从sp杂化（炔属）碳原子上除去的基团和其中氢原子在形式上从任何其它碳原子上除去的基团。例如，且除非另外限定，1-丙炔基(-c≡cch3)和3-丙炔基(hc≡cch2-)均被术语“炔基”所涵盖。类似地，“亚炔基基团”指通过在形式上从炔烃除去两个氢原子（如果可能的话从一个碳原子上除去两个氢原子或从两个不同碳原子上除去两个氢原子）形成的基团。“炔烃基团”指通过从炔烃中除去一个或多个氢原子（对于特定基团来说根据需要）形成的概括性基团。
46、含氮杂环基是指含有氮原子作为构成环的杂原子的杂环基，优选3-10元杂环基。在某些实施方案中，所述含氮杂环基为饱和的。在其它实施方案中，所述含氮杂环基为不饱和的。在其它实施方案中，所述含氮杂环基可为取代或未取代的。实例包括氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、哌啶基、四氢吡啶基、吡啶基、高哌啶基、八氢吖辛基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哌嗪基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、高哌嗪基、三唑基、四唑基、吲哚啉基、吲哚基、异吲哚啉基、异吲哚基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、吡唑并吡啶基、喹啉基、四氢喹啉基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、喹嗪基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基，二氢喹喔啉基、喹喔啉基、萘啶基、嘌呤基、蝶啶基和奎宁环基基团。
47、“任选的”或“任选地”（例如，任选地被取代）意味着随后描述的情况事件可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的事例和不发生的事例。例如，“任选地取代的烷基”指烷基可以被取代或可以不被取代并且该描述既包括取代的烷基也包括不具有取代的烷基。
48、“前药”意在表明在生理条件下或通过溶剂解可以转化为本发明的生物活性化合物的化合物。因此，术语“前药”指药学上可接受的本发明化合物的代谢前体。当向有需要的受试者施用时，前药可以是无活性的，但在体内被转化为本发明的活性化合物。前药通常在体内快速转变生成本发明的母体化合物，例如，通过在血液中水解。所述前药化合物通常提供在哺乳动物生物体内的溶解性、组织相容性或延迟释放的优点（参见bundgard, h.,design of prodrugs (1985),第7-9、21-24页（爱思唯尔，阿姆斯特丹））。在higuchi, t.等人,a.c.s. symposium series,第14卷，以及在bioreversible carriers in drugdesign, edward b. roche编著，美国制药协会和佩加蒙出版社，1987中提供了对前药的论述。术语“前药”还意在包括任何共价键合的载体，当这类前药对受试哺乳动物施用时，所述载体在体内释放本发明的活性化合物。本发明化合物的前药可以通过修饰本发明化合物中存在的官能团来制备，通过这种方式，所述修饰通过常规操作裂解或在体内裂解成为本发明的母体化合物。前药包括以下本发明化合物：其中羟基、氨基或巯基与以下的任何基团键合，当本发明化合物的前药对受试哺乳动物施用时，所述基团裂解分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。前药的实例包括但不限于，本发明化合物中胺官能团的醇或酰胺衍生物的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物等。
49、本文公开的本发明还意在涵盖所有通过使一个或多个原子被具有不同原子量或质量数的原子取代而被同位素标记的结构(i)化合物的药学上可接受的化合物。可并入所公开化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，分别例如2h、3h、11c、13c、14c、13n、15n、15o、17o、18o、31p、32p、35s、18f、36cl、123i和125i。这些放射性标记的化合物可以有用于：通过表征，例如，作用的位点或模式，或与药理学重要的作用位点的结合亲和力来帮助确定或测量化合物的效果。某些同位素标记的结构(i)的化合物，例如，那些并入放射性同位素的结构(i)的化合物，在药物和/或底物组织分布研究中是有用的。放射性同位素氚（即，3h）和碳-14（即，14c），由于它们易于并入并且有现有的检测手段，对于这一目的是特别有用的。
50、用例如氘（即，2h）的较重的同位素取代，可以提供由较强的代谢稳定性所导致的某些治疗优点，例如，增长的体内半衰期或减少的剂量需要，并且因此在一些情况下可以是优选的。用正电子发射同位素（例如11c、18f、15o和13n）取代，在用于检验底物受体占有率的正电子发射断层扫描（pet）研究中可以是有用的。通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与下文阐述的制备与实施例中所描述的类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替先前采用的未标记的试剂来制备同位素标记的结构(i)的化合物。
51、本文公开的本发明还意在涵盖所公开化合物的体内代谢产物。这类产物可以得自，例如，所施用化合物的，主要由于酶促过程的氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等。因此，本发明包括由以下方法所产生的化合物，所述方法包含将本发明的化合物对哺乳动物施用足以生成其代谢产物的一段时间。这类产物通常通过以下方式来标识：将放射性标记的本发明化合物以可检测的剂量对例如大鼠、小鼠、豚鼠、猴这些动物施用，或者对人施用，持续足够的时间以允许代谢发生，并将其转化产物从尿、血液或其它生物样品中分离。
52、“稳定的化合物”和“稳定的结构”意在表明足够稳定以在从反应混合物分离至有用纯度以及在配制成为有效治疗剂的过程中得以存留的化合物。
53、“哺乳动物”包括人，和家养动物，例如实验动物和家庭宠物（例如，猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔），以及非家养动物例如野生动物等。
54、“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于：经美国食品药品管理局批准，用于人或家养动物的可接受的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染色/着色剂、增味剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。“药学上可接受的盐”包括酸加合盐和碱加合盐两者。
55、“药学上可接受的酸加合盐”指保留游离碱的生物效果和性质，不是生物上或其它方面不期望的，并且与以下无机酸和有机酸形成的那些盐，所述无机酸例如，但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，而所述有机酸例如，但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
56、“药学上可接受的碱加合盐”指保留游离酸的生物效果和性质，不是生物上或其它方面不期望的那些盐。这些盐通过无机碱或有机碱与游离酸的加合来制备。衍生自无机碱的盐包括，但不限于，钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。优选的无机盐为铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括，但不限于，下列伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺（包括天然发生的取代的胺）、环状胺和碱性离子交换树脂的盐：例如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明（hydrabamine）、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺（benethamine）、苄星青霉素（benzathine）、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基哌啶、聚胺树脂等。特别优选的有机碱为异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己基胺、胆碱和咖啡因。
57、结晶通常产生本发明化合物的溶剂化物。如本文所使用的，术语“溶剂化物”指包含一个或多个本发明化合物分子与一个或多个溶剂分子的聚集物。所述溶剂可以是水，在这种情况下所述溶剂化物可以是水合物。或者，所述溶剂可以是有机溶剂。因此，本发明的化合物可以以水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及以相应的溶剂化形式存在。本发明的化合物可以是真正的溶剂化物，而在其它情况下，本发明的化合物可以仅保留偶生的（adventitious）水，或者是水加上一些偶生溶剂的混合物。
58、“药物组合物”指本发明化合物与本领域通常接受的用于向哺乳动物（例如，人）递送生物活性化合物的介质的制剂。因此这类介质包括所有药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
59、“有效量”或“治疗有效量”指当对哺乳动物（优选为人）施用时，足以在哺乳动物（优选为人）中实现治疗的本发明化合物的量。构成“治疗有效量”的本发明脂质纳米颗粒的量会依赖化合物、病况及其严重性、施用方式以及待治疗哺乳动物的年龄而变化，但可以由本领域技术人员依据其自身的知识和本公开内容来常规确定。如本文使用的“治疗（treating）”或“治疗（treatment）”覆盖针对患有相关疾病或病况的哺乳动物（优选为人）的所述相关疾病或病况的治疗，并且包括：
60、（i）预防疾病或病况在哺乳动物中发生，特别是，当这类哺乳动物倾向患有所述病况，但尚未被诊断为患有所述病况时；
61、（ii）抑制所述疾病或病况，即，阻止其发展；
62、（iii）减轻所述疾病或病况，即，使所述疾病或病况消退；或者
63、（iv）减轻由所述疾病或病况导致的症状，即，在不解决根本疾病或病况的情况下减轻疼痛。如本文所使用的，术语“疾病”和“病况”可以交换使用，或者可以是不同的，因为特定的病症或病况可能没有已知的病原体（因此尚未找出病因），并且因此尚未被认可为疾病，而仅作为不期望的病况或综合征，其中临床医生已经标识了或多或少的特定组的症状。
64、本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以含有一个或多个不对称中心，并且因此可以产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式，对于氨基酸，其可以根据绝对立体化学被定义为(r)-或(s)-，或者定义为(d)-或(l)-。本发明意在包括所有这类可能的异构体，以及其外消旋和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(r)-和(s)-、或(d)-和(l)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂来制备，或者使用常规技术，例如色谱法和分级结晶来拆分。用于制备/分离单一对映异构体的常规技术包括由适合的光学纯前体手性合成，或者使用，例如，手性高压液相色谱（hplc）的外消旋体（或盐或衍生物的外消旋体）的拆分。当本文所述的化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心时，除非另外限定，其旨在指该化合物包括e型和z型几何异构体。同样地，也旨在包括所有的互变异构形式。
65、“立体异构体”指由相同的键键合的相同原子组成，但具有不同三维结构的化合物，其是不可互变的。本发明涵盖各种立体异构体及其混合物，并且包括“对映异构体”，所述对映异构体指其分子互为不可重叠的（nonsuperimposeable）镜像的两个立体异构体。
66、“互变异构体”指质子从分子的一个原子转移至同一分子的另一个原子。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。
67、化合物
68、一方面，本发明提供新型离子型脂质化合物，其能够与其它脂质组分（例如中性脂质、带电荷脂质、类固醇和/或聚合物缀合脂质）结合以形成具有寡核苷酸的脂质纳米颗粒。不希望受理论束缚，认为这些脂质纳米颗粒防护寡核苷酸不在血清中降解，并且在体外和体内提供对细胞的寡核苷酸的有效递送。
69、在一种实施方案中，所述化合物具有以下结构(i)：
70、(i)
71、或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
72、y为-oco-、-coo-、-nhco-、-conh-、-o-、-s-、-so2-或-so-中的一个或多个；
73、q为直链c1-10烷基基团，其中所述烷基基团中的碳原子任选地被-coo-基团替代；
74、r为h或c1-4烷基；
75、r1和r2各自相同或不同，并且独立地选自氢、c1-6烷基、c2-6烯基和c2-6炔基，其中所述c1-6烷基、c2-6烯基或c2-6炔基中的碳原子任选地被一至三个独立地选自n、o和s的杂原子替代；或任选地r1和r2与其相邻的n原子连接在一起以形成饱和或不饱和的、取代或未取代的3-10元含氮杂环基团，
76、m为2至14的整数，以及
77、n和o相同或不同，并且各自独立地为2至14的整数。
78、在一种实施方案中，所述化合物具有以下结构(i)：
79、(i)
80、或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
81、y为-oco-、-coo-、-nhco-、-conh-、-o-、-s-、-so2-或-so-；
82、q为直链c1-10亚烷基基团，其中所述亚烷基基团中的ch2任选地被-coo-基团替代；
83、r为h或c1-4烷基；
84、r1和r2各自相同或不同，并且独立地选自氢、c1-6烷基、c2-6烯基和c2-6炔基，其中所述c1-6烷基、c2-6烯基或c2-6炔基中的ch2任选地被一至三个独立地选自nh、o和s的杂原子替代；或任选地r1和r2与其相邻的n原子连接在一起以形成饱和或不饱和的、取代或未取代的3-10元含氮杂环基团，
85、m为2至14的整数，以及
86、n和o相同或不同，并且各自独立地为2至14的整数。
87、y、q、r、r1、r2、m、n和o的优选实施方案如下所示。式(i)表示的化合物的实施方案是如下所示的具体实施方案的所有组合的示例。
88、在一些实施方案中，式(i)中的y为-oco-、-coo-、-nhco-、-conh-、-o-、-s-、-so2-或-so-（下文称为y-1）。
89、在一些实施方案中，式(i)中的y为-oco-、-coo-、-nhco-或-conh-（下文称为y-2）。
90、在一些实施方案中，式(i)中的y为-coo-、-nhco-或-conh-（下文称为y-3）。
91、在一些实施方案中，式(i)中的q为直链c1-10烷基基团，其中所述烷基基团中的碳原子任选地被-coo-基团替代（下文称为q-1）。
92、在一些实施方案中，式(i)中的q为直链c2-8烷基基团，其中所述烷基基团中的碳原子任选地被-coo-基团替代（下文称为q-2）。
93、在一些实施方案中，式(i)中的q选自乙基、正丙基、正丁基和（下文称为q-3）。
94、在一些实施方案中，式(i)中的q为直链c2-8亚烷基基团，其中所述烷基基团中的ch2任选地被-coo-基团替代（下文称为q-4）。
95、在一些实施方案中，式(i)中的q选自亚乙基、亚正丙烯、亚正丁烯和（下文称为q-5）。
96、在一些实施方案中，式(i)中的r为h或c1-4烷基（下文称为r-1）。
97、在一些实施方案中，式(i)中的r为h、甲基或乙基（下文称为r-2）。
98、在一些实施方案中，式(i)中的r为h或甲基（下文称为r-3）。
99、在一些实施方案中，式(i)中的r1和r2各自相同或不同，并且独立地选自氢、c1-6烷基、c2-6烯基和c2-6炔基，其中所述c1-6烷基、c2-6烯基或c2-6炔基中的碳原子任选地被一至三个独立地选自n、o和s的杂原子替代；或任选地r1和r2与其相邻的n原子连接在一起以形成饱和或不饱和的、取代或未取代的3-10元含氮杂环基团（下文称为r12-1）。
100、在一些实施方案中，式(i)中的r1和r2各自相同或不同，并且独立地选自氢和c1-6烷基，其中所述c1-6烷基中的碳原子任选地被一至三个独立地选自n、o和s的杂原子替代；或任选地r1和r2与其相邻的n原子连接在一起以形成饱和或不饱和的、取代或未取代的3-10元含氮杂环基团（下文称为r12-2）。
101、在一些实施方案中，式(i)中的r1和r2各自相同或不同，并且独立地选自氢和c1-3烷基，其中所述c1-3烷基中的碳原子任选地被一至三个独立地选自n、o和s的杂原子替代；或任选地r1和r2与其相邻的n原子连接在一起以形成饱和或不饱和的、取代或未取代的4-6元含氮杂环基团（下文称为r12-3）。
102、在一些实施方案中，式(i)中的r1和r2独立地选自甲基、乙基、正丙基和正丁基（下文称为r12-4）。
103、在一些实施方案中，式(i)中由r1和r2与其相邻的n原子连接在一起形成的所述杂环基团为或（下文称为r12-5）。
104、在一些实施方案中，式(i)中的r1和r2各自相同或不同，并且独立地选自氢和c1-3烷基，其中所述c1-3烷基中的ch2任选地被一至三个独立地选自nh、o和s的杂原子替代；或任选地r1和r2与其相邻的n原子连接在一起以形成饱和或不饱和的、取代或未取代的4-6元含氮杂环基团（下文称为r12-6）。
105、在一些实施方案中，式(i)中的m为2至14的整数（下文称为m-1）。
106、在一些实施方案中，式(i)中的m为2至10的整数（下文称为m-2）。
107、在一些实施方案中，式(i)中的m为2至8的整数（下文称为m-3）。
108、在一些实施方案中，式(i)中的m为2至6的整数（下文称为m-4）。
109、在一些实施方案中，式(i)中的m为4（下文称为m-5）。
110、在一些实施方案中，式(i)中的n为2至14的整数（下文称为n-1）。
111、在一些实施方案中，式(i)中的n为2至10的整数（下文称为n-2）。
112、在一些实施方案中，式(i)中的n为2至8的整数（下文称为n-3）。
113、在一些实施方案中，式(i)中的n为4至6的整数（下文称为n-4）。
114、在一些实施方案中，式(i)中的n为6（下文称为n-5）。
115、在一些实施方案中，式(i)中的o为2至14的整数（下文称为o-1）。
116、在一些实施方案中，式(i)中的o为2至10的整数（下文称为o-2）。
117、在一些实施方案中，式(i)中的o为2至8的整数（下文称为o-3）。
118、在一些实施方案中，式(i)中的o为4至6的整数（下文称为o-4）。
119、在一些实施方案中，式(i)中的o为6（下文称为o-5）。
120、在一些实施方案中，式(i)表示的所述化合物为y-1、q-2、r-3、r12-4、m-2、n-2和o-2的组合。
121、在一些实施方案中，式(i)表示的所述化合物为y-2、q-3、r-2、r12-4、m-5、n-5和o-5的组合。
122、在一些实施方案中，式(i)表示的所述化合物为y-3、q-3、r-3、r12-2、m-3、n-3和o-3的组合。
123、在一些实施方案中，式(i)表示的所述化合物为y-3、q-3、r-2、r12-1、m-2、n-4和o-3的组合。
124、在各种不同的实施方案中，所述化合物具有下表1中列出的结构之一。
125、表1代表性化合物
126、
127、
128、
129、
130、应当理解，如上所述的结构(i)的化合物的任何实施方案，以及如上所述的结构(i)的化合物中的任何特定取代基和/或变量，可以独立地与结构(i)的化合物的其它实施方案和/或取代基和/或变量组合以形成上文未明确阐述的本发明的实施方案。
131、应当理解，在本说明书中，所述式的取代基和/或变量的组合只有在产生稳定化合物的情况下才是允许的。
132、在一些实施方案中，提供的组合物包含结构(i)的任何一种或多种化合物和治疗剂。例如，在一些实施方案中，组合物包含结构(i)的任何一种化合物和治疗剂和一种或多种选自中性脂质、类固醇和聚合物缀合脂质的赋形剂。其它药学上可接受的赋形剂和/或载体也被包括在组合物的各种实施方案中。
133、在一些实施方案中，所述中性脂质选自dspc、dppc、dmpc、dopc、popc、dope和sm。在一些实施方案中，所述中性脂质是dope或dspc。在各种实施方案中，化合物与中性脂质的摩尔比为约1:4至约3:1。
134、在各种实施方案中，所述组合物还包含类固醇或类固醇类似物。在某些实施方案中，所述类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在这些实施方案的一些实施方案中，化合物与胆固醇的摩尔比为约1:5至约5:1。
135、在各种实施方案中，所述聚合物缀合脂质是聚乙二醇化脂质。例如，一些实施方案包括聚乙二醇化二酰基甘油（peg-dag）例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油（peg-dmg）、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺（peg-pe）、peg琥珀二酰甘油（peg-s-dag）例如4-o-(2’,3’-二(十四酰基氧基)丙基-1-o-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)琥珀酸酯（peg-s-dmg）、聚乙二醇化神经酰胺（peg-cer）或peg二烷氧基丙基氨基甲酸酯例如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-n-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-n-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。在各种实施方案中，化合物与聚乙二醇化脂质的摩尔比为约100:1至约10:1。
136、在前述组合物的一些实施方案中，所述治疗剂包含核酸。例如，在一些实施方案中，所述核酸选自dna、rna及其杂合体。在一些实施方案中，所述核酸选自反义寡核苷酸、反义rna和信使rna。
137、在各种实施方案中，本发明涉及向有需要的患者施用治疗剂的方法，所述方法包括制备或提供上述组合物的任何一种并向患者施用所述组合物。
138、在一种实施方案中，本发明涉及上述组合物的任何一种在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
139、在一种实施方案中，本发明涉及上述组合物的任何一种，其用作治疗疾病的药物。
140、在一种实施方案中，本发明涉及一种用于治疗疾病的药物组合物，其包含上述组合物的任何一种作为治疗活性物质。
141、在各种实施方案中，本发明涉及向有需要的患者施用治疗剂的方法，所述方法包括制备或提供上述化合物或组合物的任何一种并向患者施用所述化合物或组合物。
142、在一种实施方案中，本发明涉及上述化合物或组合物的任何一种在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
143、在一种实施方案中，本发明涉及上述化合物或组合物的任何一种，其用作治疗疾病的药物。
144、在一种实施方案中，本发明涉及一种用于治疗疾病的药物组合物，其包含上述化合物的任何一种和治疗剂。
145、为了施用目的，本发明的化合物（通常以与治疗剂相关联的脂质纳米颗粒的形式）可以作为粗化学品施用，或者可以配制为药物组合物。本发明的药物组合物包含结构(i)的化合物和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。结构(i)的化合物以有效形成脂质纳米颗粒并递送治疗剂（例如用于治疗感兴趣的特定疾病或病况）的量存在于组合物中。本领域技术人员可以容易地确定合适的浓度和剂量。
146、本发明组合物的施用可以通过任何用于类似效用的试剂的可接受施用方式来进行。本发明的药物组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊、粉末、颗粒、软膏、溶液、悬浮液、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶、微球和气溶胶。施用这类药物组合物的通常途径包括，但不限于，口服、局部、经皮、吸入、胃肠外、舌下、口含、直肠、阴道和鼻内途径。如本文所使用的术语胃肠外包括皮下注射，静脉内、肌内、皮内、胸骨内注射或输注技术。配制本发明的药物组合物以便允许经过对患者施用该组合物后其中含有的活性成分是生物可利用的。待向受试者或患者施用的组合物是一个或多个剂量单位的形式，其中，例如，片剂可以是单剂量单位，而本发明气溶胶形式的化合物的容器可以含有多个剂量单位。制备这类剂型的现行的方法是已知的，或者对于本领域技术人员会是显然的；参见，例如，remington: the science and practice of pharmacy,第20版(philadelphiacollege of pharmacy and science, 2000)。在任何情况下，待施用的组合物会含有治疗有效量的本发明化合物或其药学上可接受的盐以根据本发明的教导治疗相关的疾病或病况。
147、本发明的药物组合物可以是固体或液体形式。一方面，所述载体是微粒，使得组合物是，例如，片剂或粉末形式。载体可以是液体，在此情况下所述组合物是，例如，口服糖浆、可注射液体或气溶胶，所述气溶胶适用于，例如，通过吸入施用。
148、当旨在用于口服施用时，所述药物组合物优选为固体或液体形式，其中本文考虑的形式是固体或液体包括半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式。
149、作为用于口服施用的固体组合物，所述药物组合物可以配制成粉末、颗粒、压缩的片剂、丸剂、胶囊、咀嚼胶、薄片等形式。这类固体组合物通常会含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。另外，可以存在以下的一种或多种：粘合剂，例如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂，例如海藻酸、海藻酸钠、普莫凝胶、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂；以及着色剂。
150、当所述药物组合物是胶囊（例如，明胶胶囊）形式时，其可以含有上述类型材料之外的液体载体，例如聚乙二醇或油。
151、药物组合物可以是液体的形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两种实例，所述液体可以用于口服施用或用于注射递送。当旨在用于口服施用时，优选的组合物含有，除本发明化合物以外的，甜味剂、防腐剂、染色/着色剂和增味剂中的一种或多种。在用于通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
152、本发明的液体药物组合物，不论其为溶液、悬浮液或是其它类似的形式，可以包括以下佐剂中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠；不挥发性油类，例如可用作溶剂或悬浮介质的合成的单甘酯或双甘酯，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苄醇或尼泊金甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖；用作冷冻保护剂的试剂，例如蔗糖或海藻糖。胃肠外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。生理盐水是优选的佐剂。可注射的药物组合物优选为无菌的。
153、旨在用于胃肠外或口服施用的本发明的液体药物组合物应含有可获得适合剂量的本发明化合物的量。
154、本发明的药物组合物可以旨在用于局部施用，在这种情况下，所述载体可以适当地包含溶液基、乳液基、软膏基或凝胶基。例如，所述基质可以包含以下的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、例如水和醇的稀释剂、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的药物组合物中。如果旨在用于经皮施用，所述组合物可以包含经皮贴片或离子电渗装置。
155、本发明的药物组合物可以旨在用于直肠施用，例如，以栓剂的形式，其在直肠中溶解并释放药物。用于直肠施用的组合物可以含有油脂性基质作为适合的无刺激性赋形剂。这类基质包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
156、本发明的药物组合物可以包括修饰固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。例如，所述组合物可以包括形成活性成分周围的包衣壳的材料。形成包衣的材料通常是惰性的，并且可以选自，例如，糖、虫胶、和其它肠溶包衣试剂。或者，所述活性成分可以封装在明胶胶囊中。
157、固体或液体形式的本发明药物组合物可以包括与本发明化合物结合从而促进所述化合物递送的试剂。可以以这种能力作用的适合的试剂包括单克隆或多克隆抗体或蛋白质。
158、本发明的药物组合物可以由可作为气溶胶被施用的剂量单位构成。术语气溶胶用于表示从胶体性质的系统到由加压包装组成的系统的多种系统。可以通过液化气或压缩气来递送，或者通过用于分散活性成分的适合的泵系统来递送。本发明化合物的气溶胶可以以单相、双相系统或三相系统被递送，用于所述活性成分的递送。气溶胶的递送包括必要的容器、活化剂、阀、子容器等，其在一起可以形成试剂盒。本领域技术人员无需过度实验即可确定优选的气溶胶。
159、本发明的药物组合物可以通过制药领域熟知的方法来制备。例如，旨在通过注射施用的药物组合物可以通过将本发明的脂质纳米颗粒与无菌、蒸馏的水或其它载体结合以形成溶液来制备。可以加入表面活性剂以促进形成均匀的溶液或悬浮液。表面活性剂是与本发明化合物非共价地相互作用以促进所述化合物在水性递送系统中溶解或均匀悬浮的化合物。
160、本发明的组合物或其药学上可接受的盐以治疗有效量施用，所述治疗有效量会依赖于多种因素而变化，包括采用的特定治疗剂的活性；所述治疗剂的代谢稳定性和作用时长；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用的模式和时间；排泄速率；药物组合物；特定病症或病况的严重性；以及经历治疗的受试者。
161、本发明的组合物也可以在施用一种或多种其它治疗剂的同时、之前或之后施用。这类组合疗法包括施用本发明组合物和一种或多种另外的活性剂的单一药物剂量制剂，以及施用本发明组合物和在其自身单独药物剂量制剂中的各个活性剂。例如，本发明组合物和其它活性剂可以以单一口服剂量组合物（例如片剂或胶囊）一起向患者施用，或者各个试剂可以以不同的口服剂量制剂施用。当使用不同的剂量制剂时，本发明化合物和一种或多种另外的活性剂可以在基本上相同的时间（即，同时）施用，或者在相互交错的时间（即，依序）施用；应理解组合疗法涵盖所有的这些给药方案。
162、合成方法
163、制备上述化合物和组合物的方法如下所述，和/或是本领域已知的。
164、本领域技术人员会认可，在本文所述的方法中，中间体化合物的官能团可能需要被适合的保护基保护。这类官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。
165、本领域技术人员还会认可，虽然本发明化合物的此类被保护的衍生物可能不具有药理学活性，但它们可以施用于哺乳动物，并且然后在体内代谢以形成具有药理学活性的本发明化合物。因此，这类衍生物可被描述为“前药”。本发明化合物的所有前药均包括在本发明的范围内。
166、并且，游离碱或游离酸形式的所有本发明化合物可以通过根据本领域技术人员已知的方法用适合的无机或有机碱或酸处理而转化为其药学上可接受的盐。本发明化合物的盐可以通过标准技术转化为其游离碱或酸形式。
167、以下通用反应方案1或2说明了制备本发明化合物，即结构(ii)、(iii)或(iv)的化合物的方法
168、(ii)、(iii)或(iv)，
169、或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中q、r、r1、r2、m、n和o如本文所定义。
170、通用合成路线基于下述方案。注意，下文列出的方案是示例性的而非限制性的。应当理解，本领域的技术人员可以在不脱离本发明范围的条件下对以下方案做出任意改动。这里的符号v是体积（ml）/起始原料重量（g）。
171、方案1：通用的t1和式(ii)的合成
172、
173、
174、方案1提供了用于制备结构(ii)的化合物的示例性方法，其中q、r、r1、r2、m、n和o如本文所定义。tbs-基团表示羟基保护基。在其它实施方案中，所述羟基保护基可以是本领域已知的其它羟基保护基。
175、在步骤1中，在反应温度下，在koh和四丁基溴化铵（tbab）存在下，反应物4a与反应物在溶剂中反应一定反应时间。
176、的量为0.5-4.0当量，优选1.0-3.0当量，并且更优选2.0当量。
177、koh的量为1.5-4.5当量，优选2.0-4.0当量，并且更优选3.0当量。
178、tbab的量为0.05-0.2当量，优选0.05-0.1当量，并且更优选0.1当量。
179、所述反应温度为60-120℃，优选80-120℃，并且更优选100℃。
180、所述反应时间为8-20小时，优选10-15小时，并且更优选12小时。
181、优选地在步骤1中所述溶剂为甲苯（tol），并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
182、在步骤2中，在反应温度下，在nah存在下，中间体4c-1与反应物在溶剂中反应一定反应时间。
183、的量为0.5-4.0当量，优选1.0-3.0当量，并且更优选2.0当量。
184、nah的量为2.0-6.0当量，优选3.0-5.0当量，并且更优选4.0当量。
185、所述反应温度为40-100℃，优选60-80℃，并且更优选70℃。
186、所述反应时间为8-20小时，优选10-15小时，并且更优选12小时。
187、优选地在步骤2中所述溶剂为四氢呋喃（thf），并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
188、在步骤3中，在反应温度下，在四正丁基氟化铵（tbaf）存在下，，使中间体4c中的羟基保护基叔丁基二甲基硅醚（tbs-基团）在溶剂中脱保护一定反应时间，以获得带有羟基基团的中间体4e。
189、tbaf的量为0.5-4.0当量，优选1.0-3.0当量，并且更优选2.0当量。
190、所述反应温度为10-30℃，并且优选25℃。
191、所述反应时间为0.5-3小时，优选1-3小时，并且更优选2小时。
192、优选地在步骤3中所述溶剂为thf，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
193、在步骤4中，在反应温度下，在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（edci）和4-二甲氨基吡啶（dmap）存在下，中间体4e和反应物之间的酯化反应在溶剂中持续一定反应时间以获得中间体4b。
194、的量为0.5-4.0当量，优选1.0-3.0当量，并且更优选2.0当量。
195、edci的量为0.5-2.0当量，优选1.0-2.0当量，并且更优选1.3当量。
196、dmap的量为0.05-0.3当量，优选0.05-0.2当量，并且更优选0.1当量。
197、所述反应温度为10-40℃，优选20-30℃，并且更优选25℃。
198、所述反应时间为8-20小时，优选10-15小时，并且更优选12小时。
199、优选地在步骤4中所述溶剂为二氯甲烷（dcm），并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
200、在步骤5中，在催化剂存在下，中间体4b在h2（50 psi）下被还原以获得中间体t1。
201、所述催化剂优选为10% pd/c和10% pd(oh)2。
202、所述反应温度为30-70℃，优选40-60℃，并且更优选50℃。
203、所述反应时间为8-20小时，优选10-15小时，并且更优选12小时。
204、所述溶剂优选为thf，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
205、在步骤6中，在反应温度下，在edci和dmap存在下，中间体t1与反应物在溶剂中反应一定反应时间以获得式(ii)的化合物。
206、的量为0.5-2.0当量，优选1.0-1.5当量，并且更优选1.2当量。
207、edci的量为0.5-2.0当量，优选1.0-2.0当量，并且更优选1.5当量。
208、dmap的量为0.05-0.3当量，优选0.05-0.2当量，并且更优选0.1当量。
209、所述反应温度为10-40℃，优选20-30℃，并且更优选20℃。
210、所述反应时间为8-20小时，优选10-15小时，并且更优选12小时。
211、优选地在步骤6中所述溶剂为dcm，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选7v。
212、方案2：通用的t2、式(iii)和式(iv)的合成
213、
214、
215、或
216、
217、方案2提供了用于制备结构(iii)或(iv)的化合物的示例性方法，其中q、r、r1、r2、m、n和o如本文所定义。tbs-基团表示羟基保护基。在其它实施方案中，所述羟基保护基可以是本领域已知的其它羟基保护基。bn-基团表示羧基保护基。在其它实施方案中，所述羧基保护基可以是本领域已知的其它羧基保护基。
218、在步骤1中，在反应温度下，在nah存在下，反应物13与在溶剂中反应持续一定反应时间。
219、的量为0.5-4.0当量，优选1.0-3.0当量，并且更优选2.2当量。
220、nah的量为0.5-4.0当量，优选1.0-3.0当量，并且更优选2.2当量。
221、所述反应温度为0-30℃，优选0-20℃。
222、所述反应时间为10-30小时，优选12-20小时，并且更优选16.5小时。
223、优选地在步骤1中所述溶剂为甲苯和二甲基甲酰胺（dmf），甲苯的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v；dmf的体积为15-50v，优选20-40v，并且更优选30v。
224、在步骤2中，在反应温度下，中间体14在溶剂中被2-碘氧基苯甲酸（ibx）氧化一定反应时间。
225、ibx的量为0.5-2.0当量，优选1.0-2.0当量，并且更优选1.2当量。
226、所述反应温度为60-100℃，优选70-90℃，并且更优选80℃。
227、所述反应时间为2-6小时，优选3-5小时，并且更优选4小时。
228、优选地在步骤2中所述溶剂为乙腈，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
229、在步骤3中，在反应温度下，中间体15在naclo2和nah2po3存在下在溶剂中被氧化一定反应时间。
230、naclo2的量为3.0-6.0当量，优选4.0-5.0当量，并且更优选4.15当量。
231、nah2po3的量为1.0-3.0当量，优选2.0-3.0当量，并且更优选2.1当量。
232、所述反应温度为10-30℃，并且优选20℃。
233、所述反应时间为2-6小时，优选3-5小时，并且更优选4小时。
234、优选地在步骤3中所述溶剂为二甲基亚砜（dmso）和乙腈/水（5/1），dmso的量为1.5-3.0当量，优选2.0-3.0当量，并且更优选2.3当量，并且乙腈/水（5/1）的体积为5-30v，优选10-20v，并且更优选12v。
235、在步骤4中，在反应温度下，在k2co3存在下，通过将中间体16与bnbr在溶剂中反应持续一定反应时间使中间体16的羧基基团被羧基保护基bn-基团保护。
236、bnbr的量为0.5-2.5当量，优选1.0-2.0当量，并且更优选1.2当量。
237、k2co3的量为1.0-3.0当量，优选1.5-2.5当量，并且更优选2.0当量。
238、所述反应温度为10-30℃，优选15-25℃，并且更优选20℃。
239、所述反应时间为4-6小时，优选5-7小时，并且更优选6小时。
240、优选地在步骤4中所述溶剂为dmf，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
241、在步骤5中，在反应温度下，在tbaf存在下，使中间体17中的羟基保护基tbs-基团在溶剂中脱保护一定反应时间以获得带有羟基基团的中间体18。
242、tbaf的量为1.0-3.0当量，优选1.5-2.5当量，并且更优选2.0当量。
243、所述反应温度为10-30℃，并且优选20℃。
244、所述反应时间为2-6小时，优选3-5小时，并且更优选4小时。
245、优选地在步骤5中所述溶剂为thf，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
246、在步骤6中，在反应温度下，在edci和dmap存在下，中间体18和之间在溶剂中一定反应时间的酯化反应获得中间体19。
247、的量为1.5-4.5当量，优选2.0-4.0当量，并且更优选3.0当量。
248、edci的量为2.5-4.5当量，优选3.0-4.0当量，并且更优选3.5当量。
249、dmap的量为0.05-0.3当量，优选0.05-0.2当量，并且更优选0.1当量。
250、所述反应温度为10-40℃，优选15-30℃，并且更优选20℃。
251、所述反应时间为60-100小时，优选60-80小时，并且更优选72小时。
252、优选地在步骤6中所述溶剂为dcm，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
253、在步骤7中，在催化剂存在下，中间体19被还原以获得中间体t2。
254、所述催化剂优选为pd/c (10%, 15psi)。
255、所述反应温度为10-30℃，优选15-25℃，并且更优选20℃。
256、所述反应时间为2-8小时，优选3-6小时，并且更优选4小时。
257、优选地所述溶剂为乙醇，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
258、在步骤8中，在反应温度下，在pph3和diad存在下，中间体t2与反应物在溶剂中反应一定反应时间以获得式(iii)的化合物。
259、的量为0.5-2.0当量，优选0.8-1.5当量，并且更优选1.0当量。
260、pph3的量为0.5-2.0当量，优选1.0-2.0当量，并且更优选1.5当量。
261、偶氮二甲酸二异丙酯（diad）的量为0.5-2.0当量，优选1.0-2.0当量，并且更优选1.5当量。
262、所述反应温度为10-40℃，优选15-30℃，并且更优选20℃。
263、所述反应时间为8-20小时，优选10-15小时，并且更优选12小时。
264、优选地在步骤8中所述溶剂为thf，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
265、或在步骤8’中，在反应温度下，在2-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n’,n’-四甲基脲六氟磷酸盐（hatu）和n,n-二异丙基乙胺（diea）存在下，中间体t2与反应物在溶剂中反应持续一定反应时间以获得式(iv)的化合物。
266、的量为0.5-2.0当量，优选0.8-1.5当量，并且更优选1.1当量。
267、hatu的量为0.5-2.0当量，优选1.0-2.0当量，并且更优选1.2当量。
268、diea的量为1.5-4.5当量，优选2.0-4.0当量，并且更优选3.0当量。
269、所述反应温度为10-40℃，优选15-30℃，并且更优选20℃。
270、所述反应时间为8-20小时，优选10-15小时，并且更优选12小时。
271、优选地在步骤8’中所述溶剂为dcm，并且所述溶剂的体积为5-30v，优选5-20v，并且更优选10v。
272、在一种实施方案中，以下为用于合成t1和icl-200的具体方案。
273、
274、
275、在一种实施方案中，以下为用于合成t2和icl-209的具体方案。
276、
277、
278、
279、提供以下实施例是为了说明而非限制的目的。
280、实施例
281、实施例1：制备cpd 4c-1的通用步骤
282、
283、在25℃以及n2下，向cpd4a（10.0 g, 36.9 mmol, 1.00当量）在甲苯（100 ml）中的混合物中加入cpd10（）（19.7 g, 73.7 mmol, 2.00当量）、koh（6.20 g, 111mmol, 3.00当量）和tbab（1.19 g, 3.69 mmol, 0.10当量）。混合物在100℃下搅拌12小时。tlc（石油醚：乙酸乙酯=10:1，产物rf=0.2）显示起始原料消耗完全。混合物用nh4cl水溶液（50.0 ml）淬灭并且用乙酸乙酯（100 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（50.0 ml）洗涤并且用na2so4干燥。将混合物过滤并且将滤液真空浓缩。将粗产物用于下一步。获得呈无色油状的cpd4c-1（27.0 g，粗品）。
284、tlc:
285、
286、制备cpd 4c的通用步骤
287、
288、在25℃以及n2下，向cpd4c-1（17.0 g, 37.1 mmol, 1.00当量）在thf（320 ml）中的混合物中分批加入nah（5.94 g, 149 mmol, 60%纯度, 4.00当量）。混合物在25℃下搅拌0.5小时。然后将cpd 10（19.9 g, 74.3 mmol, 2.00当量）加入到混合物中。混合物在70℃下搅拌12小时。tlc（石油醚：乙酸乙酯=10:1，产物rf=0.5）显示起始原料消耗完全。混合物用nh4cl水溶液（30.0 ml）淬灭并且用乙酸乙酯（30.0 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（2 ×30.0 ml）洗涤并且用na2so4干燥。将混合物过滤并且将滤液真空浓缩。混合物通过硅胶色谱纯化（石油醚/乙酸乙酯=1/0, 30/1）以得到呈无色油状的cpd4c（18.0 g, 28.0 mmol,75.3%产率）。
289、 tlc:
290、
291、 1h nmr:cpd4c(400 mhz, cdcl3)
292、 δ: 7.38 (d, j= 7.6 hz, 4h), 7.17 - 7.20 (m, 2h), 7.18 (t, j= 7.2 hz,2h), 3.63 (s, 4h), 3.59 - 3.62 (m, 5h), 3.56 - 3.59 (m, 2h), 3.38 - 3.40 (m,5h), 3.07 - 3.08 (m, 1h), 1.59 - 1.62 (m, 8h), 1.24 (s, 18h), 0.03 (s, 12h).
293、制备cpd 4e的通用步骤
294、
295、在25℃以及n2下，向cpd4c（18.0 g, 28.0 mmol, 1.00当量）在thf（120 ml）的溶液中一次性加入tbaf（1 m, 61.5 ml, 2.20当量）。混合物在25℃下搅拌2小时。tlc（石油醚：乙酸乙酯=0:1，产物rf=0.5）显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（10.0 ml）并且用乙酸乙酯（10.0 ml）萃取。混合物用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤并且将有机相真空浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化（石油醚/乙酸乙酯=100/1, 2/1）以获取呈无色油状的cpd4e（5.00 g, 12.0 mmol, 43.1%产率）。
296、tlc:
297、
298、 1h nmr:cpd4e(400 mhz, cdcl3)
299、 δ: 7.45 (d, j= 7.2 hz, 4h), 7.36 (t, j= 7.2 hz, 4h), 7.27 - 7.33 (m,2h), 3.70 (s, 4h), 3.65 - 3.68 (m, 8h), 3.50 - 3.52 (m, 4h), 3.13 - 3.15 (m,1h), 2.30 (s, 2h), 1.70 - 1.77 (m, 8h).
300、制备cpd 4b的通用步骤
301、
302、在0℃以及n2下，向cpd4e（5.00 g, 12.0 mmol, 1.00当量）和cpd1（）（6.87 g, 30.1 mmol, 2.50当量）在dcm（10.0 ml）中的混合物中一次性加入edci（7.61 g, 39.8 mmol, 3.30当量）和dmap（147 mg, 1.20 mmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时并且加热至25℃持续48小时。lcms (et84757-34-p1a1, 产物：rt=2.642分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（30.0 ml）并且用dcm（2 × 20.0ml）萃取。有机相用饱和食盐水（20.0 ml）洗涤并且用na2so4干燥。将混合物过滤并且将滤液真空浓缩。混合物通过硅胶色谱纯化（石油醚/乙酸乙酯=1/0, 50/1）以得到呈无色油状的cpd4b（8.60 g, 10.3 mmol, 85.5%产率）。
303、tlc:
304、
305、 lcms:cpd4b:
306、 lcms (产物：rt=2.642分钟；[m+1]+: 836.5)
307、 1h nmr:cpd4b(400 mhz, cdcl3)
308、 δ: 7.38 - 7.40 (m, 4h), 7.27 - 7.30 (m, 4h), 7.20 - 7.22 (m, 2h),3.80 (s,4h), 3.56 - 3.63 (m, 4h), 3.42 - 3.60 (m, 4h), 3.39 - 3.40 (m, 1h),2.10 - 2.33 (m, 2h), 1.63 - 1.70 (m, 12h), 1.60 - 1.62 (m, 4h), 1.30 (s,32h), 0.88 (t, j= 7.6 hz, 12h).
309、制备t1的通用步骤
310、
311、在50 psi (h2)下以及在50℃下，搅拌化合物4b（3.50 g, 4.19 mmol, 1.00当量）、pd/c（0.35 g, 329 μmol, 10%纯度）和pd(oh)2（0.35 g, 249 μmol, 10%纯度）在thf（40.0 ml）中的混合物12小时。tlc（石油醚/乙酸乙酯=10:1，产物rf=0）显示起始原料消耗完全。将混合物通过硅藻土过滤并且将滤液真空浓缩。混合物通过硅胶色谱纯化（二氯甲烷：甲醇=60/1 30/1）以得到呈黄色油状的t1（2.70 g, 4.12 mmol, 98.3%产率）。
312、tlc:
313、
314、 1h nmr:t1(400 mhz, cdcl3)
315、 δ: 4.10 (t, j= 6.0 hz, 4h), 3.48 - 3.50 (m, 6h), 3.46 - 3.47 (m, 2h),3.33 - 3.44 (m, 1h), 2.32 - 2.34 (m, 2h) 1.65 - 1.69 (m, 12h), 1.63 - 1.64(m, 4h), 1.44 (s, 32h), 0.88 (t, j= 6.8 hz, 12h).
316、制备icl-200的通用步骤
317、
318、在0℃以及n2下，向t1（0.20 g, 305 μmol, 1.00当量）和a1（42.9 mg, 366 μmol,1.20当量）在dcm（5.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（87.7 mg, 457 μmol, 1.50当量）、dmap（3.72 mg, 30.5 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至20℃并且搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.279分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（5.00 ml）并且用dcm（2 × 3.00 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（5.00 ml）洗涤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh3150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）以得到呈无色油状的icl-200（0.13 g,165 μmol, 54.0%产率, 95.6%纯度）。
319、lcms:icl-200
320、lcms (产物：rt=2.279分钟；[m+1]+: 755.6)
321、1h nmr:icl-200(400 mhz, cdcl3)
322、δ: 4.11 (s, 1h), 4.07 - 4.09 (m, 4h), 3.43 - 3.52 (m, 8h), 2.39 (s,2h), 2.28 - 2.33 (m, 10h), 1.64 - 1.70 (m, 12h), 1.62 - 1.63 (m, 4h), 1.60(s, 33h), 0.88 (t, j= 7.6 hz, 12h).
323、实施例2制备icl-201的通用步骤
324、
325、在0℃以及n2下，向t1（0.20 g, 305 μmol, 1.00当量）和a2（48.0 mg, 366 μmol,1.20当量）在dcm（3.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（87.7 mg, 457 μmol, 1.50当量）、dmap（3.72 mg, 30.5 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至20℃并且搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.239分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（5.00 ml）并且用dcm（2 × 3.00 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（5.00 ml）洗涤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh3150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）以得到呈无色油状的icl-201（0.15 g,188 μmol, 61.6%产率, 96.3%纯度）。
326、lcms:icl-201
327、lcms (产物：rt=2.239分钟；[m+1]+: 769.6)
328、1h nmr:icl-201(400 mhz, cdcl3)
329、δ: 6.57 (d, j= 8.4 hz, 1h), 4.22 (s, 1h), 4.08 - 4.11 (m, 4h), 3.50 -3.53 (m, 2h), 3.26 - 3.48 (m, 6h), 2.26 -2.37 (m, 12h), 1.69 - 1.81 (m, 2h),1.64 - 1.68 (m, 12h), 1.62 - 1.63 (m, 4h), 1.61 (s, 32h), 0.88 (t, j= 7.6 hz,12h).
330、实施例3制备icl-202的通用步骤
331、
332、在0℃以及n2下，向t1（0.20 g, 305 μmol, 1.00当量）和a3（53.1 mg, 366 μmol,1.20当量）在dcm（3.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（87.7 mg, 457 μmol, 1.50当量）、dmap（3.72 mg, 30.5 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至20℃并且搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.320分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（5.00 ml）并且用dcm（2 × 3.00 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（5.00 ml）洗涤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh3150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）以得到呈无色油状的icl-202（0.14 g,174 μmol, 57.1%产率, 97.4%纯度）。
333、lcms:icl-202:
334、lcms (产物：rt=2.320分钟；[m+1]+: 783.6)
335、1h nmr:icl-202(400 mhz, cdcl3)
336、δ: 6.0 (d, j= 8.4 hz, 1h), 4.20 - 4.35 (m, 1h), 4.09 (t, j= 6.8 hz,4h), 3.45 - 3.53 (m, 8h), 2.31 - 2.33 (m, 4h), 2.22 - 2.25 (m, 8h), 1.64 -1.69 (m, 14h), 1.60 - 1.62 (m, 4h), 1.29 (s,, 34h), 0.87 (t, j= 7.2 hz, 12h).
337、实施例4制备icl-203的通用步骤
338、
339、在0℃以及n2下，向t1（0.17 g, 259 μmol, 1.00当量）和a4（44.5 mg, 311 μmol,1.20当量）在dcm（5.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（74.5 mg, 3889 μmol, 1.50当量）、dmap（3.17 mg, 25.9 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至20℃并且搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.359分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（5.00 ml）并且用dcm（2 × 3.00 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（5.00 ml）洗涤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh3150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）以得到呈无色油状的icl-203（0.10 g,118 μmol, 45.6%产率, 92.4%纯度）。
340、lcms:icl-203
341、lcms (产物：rt=2.359分钟；[m+1]+: 781.6)
342、1h nmr:icl-203(400 mhz, cdcl3)
343、δ: 8.41 (brs, 1h), 4.20 - 4.36 (m, 1h), 4.08 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.43- 3.51 (m, 8h), 2.76 (s, 2h), 2.59 (s, 3h), 2.42 (s, 2h), 2.31 - 2.42 (m,2h), 1.80 (s, 4h), 1.63 - 1.69 (m, 12h), 1.58 - 1.61 (m, 4 h), 1.26 (s, 32h),0.87 (t, j= 6.8 hz, 12h).
344、实施例5制备icl-204的通用步骤
345、
346、在0℃以及n2下，向t1（0.20 g, 305 μmol, 1.00当量）和a5（57.5 mg, 366 μmol,1.20当量）在dcm（3.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（87.7 mg, 457 μmol, 1.50当量）、dmap（3.72 mg, 30.5 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至20℃并且搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.298分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（5.00 ml）并且用dcm（2 × 3.00 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（5.00 ml）洗涤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh3150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）以得到呈无色油状的icl-204（0.10 g,115 μmol, 37.7%产率, 91.5%纯度）。
347、lcms:icl-204
348、lcms (产物：rt=2.298分钟；[m+1]+: 795.7)
349、1h nmr:icl-204(400 mhz, cdcl3)
350、δ: 6.50 (d, j= 8.4 hz, 1h), 4.22 - 4.36 (m, 1h), 4.09 (t, j= 6.8 hz,4h), 3.43 - 3.53 (m,8h), 2.58 (s, 5h), 2.29 - 2.31 (m, 5h), 1.69 - 1.82 (m,5h), 1.42 - 1.67 (m, 12h), 1.29 - 1.42 (m, 4h), 1.26 (s, 32h), 0.88 (t, j= 6.8hz, 12h).
351、实施例6制备a6的通用步骤
352、
353、在0℃以及n2下，向a6-1（1.00 g, 8.54 mmol, 1.00当量）和丙醛（1.98 g, 34.2mmol, 2.49 ml, 4.00当量）在dcm（10.0 ml）中的混合物中分批加入nabh(oac)3（7.24 g,34.2 mmol, 4.00当量）。混合物在25℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=0.358分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入nahco3中（20.0 ml）并且搅拌10分钟。水相用dcm（10 ml ×2）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化（二氯甲烷：甲醇=1/0, 8/1）以得到呈无色油状的a6（0.20 g,994 μmol, 11.6%产率）。
354、lcms:a6:
355、lcms (产物：rt=0.328分钟；[m+1]+: 202)
356、1h nmr:a6(400 mhz, cdcl3)
357、δ: 2.81-2.86 (m, 6h), 2.26 (t, j= 6.4 hz, 2h), 1.58 - 1.67 (m, 9h),0.94 (t, j= 7.6 hz, 6h).
358、制备icl-205的通用步骤
359、
360、在0℃以及n2下，向t1（0.20 g, 305 μmol, 1.00当量）和a6（73.6 mg, 366 μmol,1.20当量）在dcm（3.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（87.7 mg, 457 μmol, 1.50当量）、dmap（3.72 mg, 30.5 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至20℃并且搅拌12小时。lcms (et84757-51-p1a1, 产物：rt=2.358分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（5.00 ml）并且用dcm（2 × 3.00 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（5.00 ml）洗涤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh3150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）以得到呈无色油状的icl-205（0.05 g, 59.6 μmol, 19.5%产率, 95.0%纯度）。
361、lcms:icl-205
362、lcms (产物：rt=2.358分钟；[m+1]+: 839.7)
363、1h nmr:icl-205(400 mhz, cdcl3)
364、δ: 6.00 (dd, j= 94.8 hz, j= 8.4 hz, 1h), 5.59 (dd, j= 6.0 hz, j= 1.6 hz,1h), 4.19 - 4.21 (m, 1h), 4.09 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.94 - 3.97 (m, 2h), 3.41 -3.54 (m, 8h), 3.15 - 3.20 (m, 1h), 2.41 - 2.52 (m, 2h), 2.20 -2.35 (m, 4h),1.96 - 2.06 (m, 2h), 1.78 - 1.87 (m, 4h), 1.56 - 1.71 (m, 16h), 1.40 - 1.47(m, 4h), 1.26 - 1.31 (m, 30h), 0.86 - 0.93 (m, 18h).
365、实施例7制备a7-2的通用步骤
366、
367、在0℃以及n2下，向a7-1（1.78 g, 8.54 mmol, 1.00当量）和3-(二甲氨基)丙酸（1.00 g, 8.54 mmol, 1.00当量）在dcm（5.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（2.13 g,11.1 mmol, 1.30当量）、dmap（104 mg, 854 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至25℃并且搅拌12小时。tlc（二氯甲烷：甲醇=10:1，产物rf=0.4）显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（10.0 ml）并且水相用dcm（2 × 5.00 ml）萃取。有机相用1n hcl（10.0 ml）和饱和食盐水（10.0 ml）洗涤。有机相用na2so4干燥并且真空浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化（二氯甲烷：甲醇=100/1, 30/1）以得到呈无色油状的a7-2（1.80 g,5.86 mmol, 68.6%产率）。
368、tlc:
369、
370、1h nmr:a7-2(400 mhz, cdcl3)
371、δ: 7.32 - 7.39 (m, 5h), 5.12 (s, 2h), 4.09 (t, j= 6.4 hz, 2h), 2.61(t, j= 7.6 hz, 2h), 2.48 (t, j= 7.2 hz, 2h), 2.41 (t, j= 7.2 hz, 2h), 2.25 (s,6h), 1.68 - 1.72 (m, 4h).
372、制备a7的通用步骤
373、
374、向a7-2（0.50 g, 1.63 mmol, 1.00当量）在乙醇（10.0 ml）中的混合物中加入pd/c（0.05 g, 47.0 μmol, 10%纯度）。将悬浮液在真空下脱气并且用h2吹扫数次。混合物在h2(15 psi)下以及在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=0.099分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物通过硅藻土过滤并且用乙醇（2 × 20.0 ml）洗涤滤饼。将滤液真空浓缩。将粗产物用于下一步。获得呈无色油状的a7（0.30 g, 1.38 mmol, 84.9%产率）。
375、lcms: a7
376、lcms (产物：rt=0.099分钟；[m+1]+: 218)
377、1h nmr:a7(400 mhz, cdcl3)
378、δ: 9.29 - 9.34 (m, 1h), 4.11 - 4.16 (m, 2h), 2.90 (t, j= 7.6 hz, 2h),2.64 (t, j= 7.2 hz, 2h), 2.33 (s, 6h) 2.28 (t, j= 6.8 hz, 2h), 1.63-1.72 (m,4h).
379、制备icl-206的通用步骤
380、
381、在0℃以及n2下，向t1（0.20 g, 305 μmol, 1.00当量）和a7（79.5 mg, 366 μmol,1.20当量）在dcm（3.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（87.7 mg, 457 μmol, 1.50当量）、dmap（3.72 mg, 30.5 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至20℃并且搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.380分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（5.00 ml）并且用dcm（2 × 3.00 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（5.00 ml）洗涤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh3150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）以得到呈无色油状的icl-206（0.10 g,104 μmol, 34.1%产率, 88.8%纯度）。
382、lcms:icl-206
383、lcms (产物：rt=2.380分钟；[m+1]+: 881.7)
384、1h nmr:icl-206(400 mhz, cdcl3)
385、δ: 5.93 (d, j= 8.4 hz, 1h), 4.12 (s, 1h), 4.09 - 4.10 (m, 6h), 3.48 -3.54 (m, 2h), 3.43 - 3.47 (m, 6h), 2.32-2.52 (m, 2h), 2.23-2.29 (m, 2h),1.68-1.70 (m, 10h), 1.64-1.67 (m, 16h), 1.61-1.63 (m, 4h), 1.26-1.44 (m,32h), 0.88 (t, j= 6.4 hz, 12h).
386、实施例8制备a8-2的通用步骤
387、
388、在0℃以及n2下，向a8-1（1.45 g, 6.98 mmol, 1.00当量）和3-吡咯烷-1-基丙酸（1.00 g, 6.98 mmol, 1.00当量）在dcm（5.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（1.74 g,9.08 mmol, 1.30当量）、dmap（85.3 mg, 698 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至25℃并且搅拌12小时。tlc（二氯甲烷：甲醇=10:1，产物rf=0.4）显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（10.0 ml）并且水相用dcm（2 × 5.00 ml）萃取。有机相用1n hcl（10.0 ml）和饱和食盐水（10.0 ml）洗涤。有机相用na2so4干燥并且真空浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化（二氯甲烷：甲醇=100/1, 30/1）以得到呈无色油状的a8-2（1.60 g,4.80 mmol, 68.7%产率）。
389、tlc:
390、
391、1h nmr:a8-2(400 mhz, cdcl3)
392、δ: 7.32 - 7.39 (m, 5h), 5.12 (s, 2h), 4.09 (t, j= 6.4 hz, 2h), 2.83(t, j= 7.2 hz, 2h), 2.58 - 2.60 (m, 6h), 2.40 (t, j= 7.2 hz, 2h), 1.82 - 1.83(m, 4h), 1.69-1.81 (m, 4h).
393、制备a8的通用步骤
394、
395、向a8-2（0.50 g, 1.50 mmol, 1.00当量）在乙醇（10.0 ml）中的混合物中加入pd/c（0.05 g, 47.0 μmol, 10%纯度）。将悬浮液在真空下脱气并且用h2吹扫数次。混合物在h2(15 psi)下以及在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=0.103分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物通过硅藻土过滤并且用乙醇（2 × 20.0 ml）洗涤滤饼。将滤液真空浓缩。将粗产物用于下一步。获得呈无色油状的a8（0.29 g, 1.19 mmol, 79.48%产率）。
396、lcms: a8
397、lcms (产物：rt=0.103分钟；[m+1]+: 244)
398、1h nmr:a8(400 mhz, cdcl3)
399、δ: 9.82 - 10.02 (m, 1h), 4.10 - 4.13 (m, 2h), 3.12 (t, j= 7.6 hz, 2h),3.00 (s, 4h), 2.74 (t, j= 7.6 hz, 2h), 2.29 (t, j= 6.4 hz, 2h), 1.96 - 2.02 (m,4h), 1.62-1.71 (m, 4h).
400、制备icl-207的通用步骤
401、
402、在0℃以及n2下，向t1（0.20 g, 305 μmol, 1.00当量）和a8（89.0 mg, 366 μmol,1.20当量）在dcm（3.00 ml）中的混合物中一次性加入edci（87.7 mg, 457 μmol, 1.50当量）、dmap（3.72 mg, 30.5 μmol, 0.10当量）。混合物在0℃下搅拌0.5小时，然后加热至20℃并且搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.328分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（5.00 ml）并且用dcm（2 × 3.00 ml）萃取。有机相用饱和食盐水（5.00 ml）洗涤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh3150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）以得到呈无色油状的icl-207（0.08 g,79.1 μmol, 25.9%产率, 87.1%纯度）。
403、lcms:icl-207
404、lcms (产物：rt=2.328分钟；[m+1]+: 881.7)
405、1h nmr:icl-207(400 mhz, cdcl3)
406、δ: 5.93 (d, j= 8.4 hz, 1h), 4.09 - 4.10 (m, 1h), 3.49 - 3.51 (m, 8h),2.58 (s, 2h), 2.23 (s, 2h), 1.70 - 1.86 (m, 4h), 1.69 (s, 4h), 1.63 - 1.68(m, 17h), 1.62 - 1.63 (m, 4h), 1.26 - 1.30 (m, 32h), 0.88 (t, j= 7.2 hz, 12h).
407、实施例9制备化合物14的通用步骤
408、
409、在20℃下，向cpd13（5.00 g, 41.6 mmol, 1.00当量）在dmf（150 ml）的溶液中加入nah（3.66 g, 91.6 mmol, 60.0%纯度, 2.20当量）持续0.5小时，然后在0℃下向混合物中加入在甲苯（50.0 ml）中的cpd10（24.5 g, 91.6 mmol, 2.20当量）。混合物在20℃下搅拌16小时。lcms (rt=2.959分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入nh4cl水溶液中（400 ml）并且搅拌5分钟。水相用乙酸乙酯（150 ml, 100 ml）萃取。将合并的有机相用饱和食盐水（400 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化（柱高：250 mm，直径：100 mm，100-200目硅胶，石油醚/乙酸乙酯=100/1, 0/1）。获得呈无色油状的cpd14（7.10 g, 14.4 mmol, 34.6%产率）。
410、1h nmr:cpd14(400 mhz, cdcl3)
411、δ: 3.63 (t, j= 6.0 hz, 4h), 3.57 (s, 2h), 3.42 - 3.45 (m, 6h), 3.38(d, j= 8.0 hz, 2h), 1.56 - 1.61 (m, 9h), 0.90 (s, 18h), 0.86 (s, 3h), 0.05 (s,12h)
412、制备化合物15的通用步骤
413、
414、向cpd14（7.10 g, 14.4 mmol, 1.00当量）在乙腈（71.0 ml）的溶液中加入ibx（4.84 g, 17.3 mmol, 1.20当量）。混合物在80℃下搅拌4小时。tlc表明cpd14消耗完全并且一个新点形成了。将混合物真空浓缩。产物无需纯化即用于下一步。获得呈白色油状的cpd15（7.00 g, 粗品）。
415、tlc:
416、
417、制备化合物16的通用步骤
418、
419、向cpd15（7.00 g, 14.3 mmol, 1.00当量）和dmso（2.56 g, 32.8 mmol, 2.30当量）在乙腈（70.0 ml）的溶液中加入naclo2（5.35 g, 59.2 mmol, 4.15当量）、nah2po4（3.59g, 30.0 mmol, 2.10当量）和水（14.0 ml）。反应混合物在20℃下搅拌4小时。tlc表明反应物1消耗完全并且一个新点形成了。将混合物倒入na2so3水溶液中（150 ml）并且搅拌5分钟。水相用乙酸乙酯（150 ml, 100 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（200 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化（柱高：250 mm，直径：100 mm，100-200目硅胶，石油醚/乙酸乙酯=100/1, 0/1）。获得呈无色油状的cpd16（4.70 g, 9.27mmol, 65.0%产率）。
420、tlc:
421、
422、1h nmr:cpd16(400 mhz, cdcl3)
423、δ: 3.63 (t, j= 6.0 hz, 4h), 3.56 (s, 4h), 3.51 (t, j= 6.0 hz, 4h), 1.56- 1.66 (m, 9h), 1.24 (s, 3h), 0.90 (s, 19h), 0.05 (s, 12h).
424、制备化合物17的通用步骤
425、
426、向cpd16（4.70 g, 9.27 mmol, 1.00当量）在dmf（47.0 ml）的溶液中加入k2co3（2.56 g, 18.6 mmol, 2.00当量）和bnbr（1.90 g, 11.1 mmol, 1.20当量）。混合物在20℃下搅拌6小时。lcms (rt=2.252分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入nahco3水溶液中（150 ml）并且搅拌5分钟。水相用乙酸乙酯（150 ml, 100 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（200 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。获得呈黄色油状的cpd17（5.50 g, 粗品）。
427、制备化合物18的通用步骤
428、
429、向cpd17（5.50 g, 9.21 mmol, 1.00当量）在thf（55.0 ml）的溶液中加入tbaf（1.00 m, 18.4 ml, 2.00当量）。混合物在20℃下搅拌4小时。tlc表明反应物1消耗完全并且一个新点形成了。将混合物倒入水中（100 ml）并且搅拌5分钟。水相用乙酸乙酯（70.0ml, 50.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（100 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化（柱高：250 mm，直径：100 mm，100-200目硅胶，石油醚/乙酸乙酯=100/1，0/1）。获得呈黄色油状的cpd18（3.00 g, 8.14 mmol, 88.4%产率）。
430、tlc:
431、
432、1h nmr:cpd18(400 mhz, cdcl3)
433、δ: 7.30 - 7.36 (m, 5h), 5.16 (s, 2h), 3.56 - 3.63 (m, 8h), 3.44 (t, j=5.6 hz, 4h), 1.97 (s, 2h), 1.58 - 1.67 (m, 8h), 1.22 (s, 3h).
434、制备化合物19的通用步骤
435、
436、向cpd18（3.00 g, 8.14 mmol, 1.00当量）和cpd1（5.58 g, 24.4 mmol, 3.00当量）在dcm（30.0 ml）的溶液中加入edci（5.46 g, 28.5 mmol, 3.50当量）和dmap（99.5 mg,814 μmol, 0.10当量）。混合物在20℃下搅拌72小时。lcms (et84820-42-p1a3, rt=4.255分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物倒入水中（100 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（100ml, 50.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（100 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。残余物通过硅胶色谱纯化（柱高：250 mm，直径：100 mm，100-200目硅胶，石油醚/乙酸乙酯=100/1, 0/1）。获得呈无色油状的cpd19（5.50 g, 6.97 mmol, 85.6%产率）。
437、1h nmr:cpd19(400 mhz, cdcl3)
438、δ: 7.30 - 7.35 (m, 5h), 5.15 (s, 2h), 4.06 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.53(s, 4h), 3.40 (t, j= 6.0 hz, 4h), 2.27 - 2.33 (m, 2h), 1.56 - 1.64 (m, 14h),1.30 - 1.50 (m, 4h), 1.22 - 1.29 (m, 35h), 0.88 (t, j= 6.8 hz, 12h).
439、制备t2的通用步骤
440、
441、在氩气气氛下向cpd19（5.50 g, 6.97 mmol, 1.00当量）在乙醇（55.0 ml）的溶液中加入pd/c（550 mg, 517 μmol, 10.0%纯度）。将悬浮液脱气并且用h2吹扫3次。混合物在h2(15psi)下以及在20℃下搅拌4小时。lcms (et84820-54-p1a1, 产物：rt=3.914分钟)显示起始原料消耗完全。将混合物过滤，将滤液真空浓缩至残余物。获得呈无色油状的t2（4.50g, 6.44 mmol, 92.4%产率）。
442、1h nmr:t2(400 mhz, cdcl3)
443、δ: 4.09 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.56 (s, 4h), 3.50 (t, j= 6.0 hz, 4h), 2.32- 2.34 (m, 2h), 1.65 - 1.70 (m, 13h), 1.44 (m, 4h), 1.24 - 1.31 (m, 35h),0.88 (t, j= 6.4 hz, 12h).
444、制备icl-209的通用步骤
445、
446、向t2（400 mg, 572 μmol, 1.00当量）和a11（51.0 mg, 572 μmol, 1.00当量）在thf（4.00 ml）的溶液中加入pph3（225 mg, 858 μmol, 1.50当量）和diad（174 mg, 858 μmol, 1.50当量）。混合物在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.455分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入水中（10.0 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（10.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh2 150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）。获得呈无色油状的icl-209（200 mg, 259 μmol, 45.4%产率）。
447、1h nmr:icl-209(400 mhz, cdcl3)
448、δ: 4.26 (s, 2h), 4.08 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.51 (s, 4h), 3.42 (t, j= 6.4hz, 4h), 2.66 - 2.73 (m, 2h), 2.31 - 2.36 (m, 6h), 1.58 - 1.67 (m, 14h), 1.44(m, 5h), 1.26 - 1.29 (m, 32h), 1.20 (s, 3h), 0.88 (t, j= 6.8 hz, 12h).
449、实施例10制备icl-210的通用步骤
450、
451、向t2（350 mg, 501 μmol, 1.00当量）和a12（64.7 mg, 501 μmol, 1.00当量）在thf（3.50 ml）的溶液中加入pph3（197 mg, 751 μmol, 1.50当量）和diad（152 mg, 751 μmol, 1.50当量）。混合物在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.628分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入水中（10.0 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（10.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh2 150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）。获得呈无色油状的icl-210（150 mg, 185 μmol, 37.0%产率）。
452、1h nmr:icl-210(400 mhz, cdcl3)
453、δ: 4.23 - 4.25 (m, 1h), 4.08 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.50 (s, 4h), 3.42(t, j= 6.4 hz, 4h), 2.29 - 2.62 (m, 7h), 1.56 - 1.67 (m, 19h), 1.44 (m, 6h),1.26 - 1.29 (m, 32h), 1.19 (s, 3h), 0.88 (t, j= 6.8 hz, 12h).
454、实施例11制备icl-211的通用步骤
455、
456、向t2（350 mg, 501 μmol, 1.00当量）和a13（51.6 mg, 501 μmol, 1.00当量）在thf（3.50 ml）的溶液中加入pph3（197 mg, 751 μmol, 1.50当量）和diad（152 mg, 751 μmol, 1.50当量）。混合物在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.558分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入水中（10.0 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（10.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh2 150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）。获得呈无色油状的icl-211（50.0 mg, 63.8 μmol, 12.7%产率）。
457、1h nmr:icl-211(400 mhz, cdcl3)
458、δ: 4.14 (t, j= 6.4 hz, 2h), 4.08 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.50 (t, j= 9.2 hz,4h), 3.44 (t, j= 6.4 hz, 4h), 2.29 - 2.32 (m, 9h), 1.67 (s, 2h), 1.58 - 1.66(m, 13h), 1.44 (m, 4h), 1.26 - 1.29 (m, 32h), 1.19 (s, 3h), 0.88 (t, j= 6.4hz, 12h).
459、实施例12制备icl-212的通用步骤
460、
461、向t2（300 mg, 429 μmol, 1.00当量）和a14（50.3 mg, 429 μmol, 1.00当量）在dcm（3.00 ml）的溶液中加入edci（165 mg, 858 μmol, 2.00当量）和dmap（78.6 mg, 644 μmol, 1.50当量）。混合物在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.574分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入水中（10.0 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（10.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh2 150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）。获得呈无色油状的icl-212（100 mg, 125 μmol, 29.2%产率）。
462、1h nmr:icl-212(400 mhz, cdcl3)
463、δ: 4.06 - 4.12 (m, 6h), 3.50 (t, j= 3.2 hz, 4h), 3.42 (t, j= 6.0 hz,4h), 2.27 - 2.33 (m, 10h), 1.58 - 1.67 (m, 17h), 1.44 (m, 5h), 1.26 - 1.29(m, 32h), 1.18 (s, 3h), 0.88 (t, j= 6.4 hz, 12h).
464、实施例13制备icl-213的通用步骤
465、
466、向t2（400 mg, 572 μmol, 1.00当量）和a15（99.2 mg, 572 μmol, 1.00当量）在dcm（4.00 ml）的溶液中加入edci（219 mg, 1.14 mmol, 2.00当量）和dmap（105 mg, 858 μmol, 1.50当量）。混合物在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.643分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入水中（10.0 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（10.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh2 150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）。获得呈黄色油状的icl-213（90.0 mg, 105 μmol, 18.4%产率）。
467、1h nmr:icl-213(400 mhz, cdcl3)
468、δ: 4.06 - 4.11 (m, 6h), 3.50 (t, j= 4.4 hz, 4h), 3.42 (t, j= 6.0 hz,4h), 2.31 - 2.35 (m, 7h), 1.58 - 1.67 (m, 16h), 1.44 - 1.45 (m, 8h), 1.26 -1.29 (m, 32h), 1.18 (s, 3h), 0.88 (t, j= 6.4 hz, 18h).
469、实施例14制备icl-214的通用步骤
470、
471、向t2（400 mg, 572 μmol, 1.00当量）和a16（55.5 mg, 629 μmol, 1.10当量）在dcm（4.00 ml）的溶液中加入hatu（261 mg, 687 μmol, 1.20当量）和diea（222 mg, 1.72mmol, 3.00当量）。混合物在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.419分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入水中（10.0 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（10.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh2 150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）。获得呈无色油状的icl-214（240 mg, 312 μmol, 54.5%产率）。
472、1h nmr:icl-214(400 mhz, dmso- d 6)
473、δ: 7.36 (t, j= 5.2 hz, 1h), 4.02 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.35 - 3.39 (m,8h), 3.11 - 3.12 (m, 2h), 2.25 - 2.27 (m, 4h), 2.12 (s, 6h), 1.39 - 1.59 (m,16h), 1.21 - 1.25 (m, 32h), 1.01 (s, 3h), 0.84 (t, j= 6.8 hz, 12h).
474、实施例15制备icl-215的通用步骤
475、
476、向t2（350 mg, 501 μmol, 1.00当量）和a17（70.6 mg, 551 μmol, 1.10当量）在dcm（3.50 ml）的溶液中加入hatu（228 mg, 601 μmol, 1.20当量）和diea（194 mg, 1.50mmol, 3.00当量）。混合物在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.542分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入水中（10.0 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（10.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh2 150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）。获得呈无色油状的icl-215（200 mg, 247 μmol, 49.4%产率）。
477、1h nmr:icl-215(400 mhz, cdcl3)
478、δ: 4.08 (t, j= 6.0 hz, 4h), 3.51 (s, 4h), 3.46 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.33(s, 2h), 2.29 - 2.33 (m, 6h), 1.58 - 1.69 (m, 17h), 1.44 (m, 6h), 1.26 - 1.29(m, 33h), 1.17 (s, 3h), 0.88 (t, j= 6.8 hz, 12h).
479、实施例16制备icl-216的通用步骤
480、
481、向t2（350 mg, 501 μmol, 1.00当量）和a18（56.3 mg, 551 μmol, 1.10当量）在dcm（3.50 ml）的溶液中加入hatu（228 mg, 601 μmol, 1.20当量）和diea（194 mg, 1.50mmol, 3.00当量）。混合物在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.434分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入水中（10.0 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（10.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh2 150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）。获得呈无色油状的icl-216（150 mg, 192 μmol, 38.3%产率）。
482、1h nmr:icl-216(400 mhz, cdcl3)
483、δ: 7.39 (t, j= 5.2 hz, 1h), 4.09 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.44 - 3.52 (m,8h), 3.30 (q, j= 6.0 hz, 2h), 2.81 (s, 1h), 2.29 - 2.31 (m, 9h), 1.63 - 1.69(m, 15h), 1.44 (m, 4h), 1.26 - 1.29 (m, 32h), 1.17 (s, 3h), 0.88 (t, j= 6.8hz, 12h).
484、实施例17制备icl-217的通用步骤
485、
486、向t2（350 mg, 501 μmol, 1.00当量）和a19（64.0 mg, 551 μmol, 1.10当量）在dcm（3.50 ml）的溶液中加入hatu（228 mg, 601 μmol, 1.20当量）和diea（194 mg, 1.50mmol, 3.00当量）。混合物在20℃下搅拌12小时。lcms (产物：rt=2.428分钟)显示起始原料消耗完全。将残余物倒入水中（10.0 ml）并且搅拌5分钟。水相用dcm（10.0 ml）萃取。合并的有机相用饱和食盐水（10.0 ml）洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并且真空浓缩。粗产物通过正相hplc纯化（柱：agela durashell nh2 150mm30mm5μm；流动相：[庚烷-thf:acn=2:1]；梯度：0%-30% b持续10.0 分钟）。获得呈无色油状的icl-217（150 mg, 188 μmol, 37.6%产率）。
487、1h nmr:icl-217(400 mhz, cdcl3)
488、δ: 7.02 (t, j= 5.2 hz, 1h), 4.09 (t, j= 6.4 hz, 4h), 3.45 - 3.50 (m,8h), 3.23 (q, j= 6.8 hz, 2h), 2.81 (s, 1h), 2.28 - 2.34 (m, 9h), 1.63 - 1.69 (m,17h), 1.54 - 1.56 (m, 6h), 1.26 (m, 32h), 1.16 (s, 3h), 0.88 (t, j= 6.4 hz, 12h).
489、
490、实施例18：lnp制剂和特性
491、简而言之，将脂质以47.5:12.5:38:2的摩尔比（可电离脂质/dspc/胆固醇/peg-dmg2k）溶解在乙醇中。使用微流体混合器（precision nanosystems，温哥华，不列颠哥伦比亚省）将脂质混合物与含有内部制备的vzv ge mrna的25 mm乙酸钠缓冲液（ph 4）以3:1的比例（水：乙醇）组合。将制剂在透析盒中对20 mm tris缓冲液（ph 7.5）进行透析至少18小时。使用amicon超离心过滤器（emd millipore，比尔里卡，马萨诸塞州）浓缩制剂，通过0.22-µm过滤器。所有制剂均使用zetasizer nano zs（malvern instruments ltd，马尔文，伍斯特郡，英国）测试粒度和pdi。用quant-ittmribogreen® rna分析（invitrogencorporation，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）测量rna封装和浓度。结果示于表2。基于结果，用蔗糖和tris缓冲液将lnp稀释至期望的最终浓度，并在-80℃下储存直至使用。
492、大多数lnp具有范围为80-150 nm的尺寸，并且具有封装效率>80%。具有尺寸>150nm和/或封装效率<50%的lnp通常不做进一步测试。
493、表2
494、
495、
496、实施例19：体内研究
497、根据iacuc（机构动物护理和使用委员会）建立的指导方针，用6-8周龄雌性c57bl/6小鼠（杰克逊）进行研究。通过肌肉注射或尾静脉注射施用50 µl的含有10 µg 的mrna的lnp溶液。在某些情况下，使用多剂量。在特定的时间点（例如21天）对动物实施安乐死并进行终末采血。经由心脏穿刺收集血液样本，并且在一些组中还收集脾脏。以下是用于被用于评估lnp制剂的通常的体内研究的详细的研究方案和研究设计。
498、5.4.1研究时间表
499、
500、5.4.3体内研究设计
501、5.1试验动物描述
502、
503、5.2试验系统管理
504、
505、5.3研究设计
506、
507、表3研究设计
508、
509、
510、
511、实施例20通过elisa测量的血清总igg
512、通过elisa测量了由vzv ge变体mrna/候选阳离子脂质疫苗诱导的vzv ge-特异性血清总igg。
513、使用abcam vzv ge重组蛋白（abcam，vzv ge重组蛋白，43050）以3 µg/ml包被96孔捕获板并且在4℃下孵育过夜。使用1x pbst洗涤该板三次并且在37℃下封闭1小时120±10分钟。在同步阴性对照组中，所有样品用1% bsa稀释100倍，并且其它样品用1% bsa进行3倍梯度稀释且稀释待测样品至阴性（样品od<截止值为阴性，而且截止值=2.1×平均od（同步阴性对照组）。
514、该板使用1x pbst洗涤三次并拍干。处理后的样品取100 μl/孔（单孔），添加100 μl的二抗（羊抗鼠igg fc人/牛/马sp ads-hrp用1%bsa稀释5000倍）并在37℃下孵育其60±5分钟。洗涤该板6次并且100 μl 的tmb底物溶液被添加到每个孔中，在室温下在黑暗中孵育10±5分钟。100 μl的终止溶液添加至每个孔中并且在biotek孔板读数器上在450 nm下读取捕获板。结果在图1中示出。
515、lnp 257（基于脂质icl-209的lnp制剂），lnp 260（基于脂质icl-211的lnp制剂）和lnp 261（基于脂质icl-212的lnp制剂）均优于lnp 232（使用行业金标准sm102的lnp制剂），其p值<0.01。进行的t检验是单尾、等方差t检验。
516、
517、实施例21 lnp稳定性评估
518、为探究使用新型的可电离脂质配制的那些lnp的稳定性，基于脂质icl-209的lnp制剂lnp 217和lnp 257以及基于脂质icl-212的lnp制剂lnp 229和lnp 261被用于中期储存期间的稳定性评估。具体地，lnp217和lnp229在-80℃下储存达6个月，而lnp257和lnp261在4℃下储存作为加速稳定性研究达4个周。选取储存期间的不同时间点，测定lnp的尺寸和封装效率（ee%）。结果示于图2。
519、lnp217和lnp229两者均在-80℃下稳定达6个月，lnp的尺寸和封装效率变化极小。对于加速4℃稳定性，lnp217和lnp229两者均显示出优异的稳定性，在至少达4周期间尺寸和封装效率变化极小。这些数据表明以可电离脂质icl-209和icl-212配制的lnp在中期储存和潜在的长期储存期间具有优异的稳定性。在不优化lnp储存缓冲液的情况下取得该结果，如优化lnp储存缓冲液很可能进一步提升其长期储存稳定性。
520、
521、实施例22 lnp体内肝脏人epo蛋白表达评价
522、通过改变其4种脂质组分的比例，评价了由可电离脂质icl-211和icl-212制成的不同lnp以人促红细胞生成素(hepo) mrna为载体靶向肝脏的能力，如表4所示。所有制备的lnp具有良好的尺寸、pdi和高ee%。各组分在这些lnp中的具体比例示于表5。作为阳性对照，选择使用sm-102 (cas no.2089251-47-6)、脂质5 (cas no. 2089251-33-0)和脂质a9(cas no.2036272-50-9)（其均为业内广泛认可的可电离脂质）制成的lnp。公知来自moderna的脂质5和来自acuitas therapeutics的脂质a9用于蛋白替代疗法或基因编辑中的旨在靶向肝脏（主要为肝细胞）的lnp。
523、根据iacuc（机构动物护理和使用委员会）建立的指导方针，用6-8周龄雌性balb/c小鼠（杰克逊）进行研究。通过肌肉注射或尾静脉注射施用150 µl的含有50 µg hepo mrna的lnp溶液。在给药后6小时的时间点对动物实施安乐死并进行终末采血。经由心脏穿刺收集血液样本。以下为用于评价lnp制剂的典型体内研究的详细的研究方案和研究设计。
524、1.研究时间表
525、
526、2.试验动物描述
527、
528、3.试验系统管理
529、
530、4.研究设计
531、
532、5.使用的试验品
533、
534、6.研究样本采集
535、
536、
537、实施例23.通过elisa的血清总人促红细胞生成素(hepo)水平测定
538、使用human erythropoietin simplestep elisa®试剂盒(abcam)按照制造商说明书测定血清总人促红细胞生成素(hepo)水平。简言之：
539、所有试剂、标准品和样品均按照制造商说明书的指示制备。移除任何未使用的微孔板条，将其放回原装有干燥剂的铝箔袋中，密封后于4℃保存。将50 μl各样品或标准品加入微孔板的合适孔。将50 μl的antibody cocktail加入各孔。密封板并将其在设置为400rpm的平板振荡器上室温孵育1小时。
540、使用350 μl的1x洗涤缓冲液清洗各孔三次。每次洗涤时：向每孔加入350 μl 1x洗涤缓冲液，使其静置至少10秒，然后移除液体。最后一次洗涤后，将板倒置并在干净的纸巾上轻拍，以去除任何残液。
541、向每孔加入100 μl的显色液，在400 rpm的平板振荡器上避光孵育10分钟。注意：最佳孵育时间可在5至20分钟之间变化，取决于实验室条件。加入终止液后，孔内颜色将由蓝色变为黄色，并且信号强度将提高约三倍。
542、向每孔加入100 μl的终止液。在平板振荡器上振荡1分钟以确保充分混匀。于450nm波长处测量光密度并记录最终读数。随后根据最终读数反算出hepo水平。
543、结果示于图3。与阳性对照（包括由acuitas脂质a9（已知其是一种强效的肝脏表达脂质）制成的lnp421）相比，lnp415、lnp416、lnp412和lnp411显示出相似或更优的体内hepo表达。与moderna脂质5制成的lnp420相比，由脂质icl-211和icl-212二者制备的多种lnp显示出相似或更优的肝脏内hepo表达。综上，这表明在此给出的脂质库，除应用于lnp疫苗外，还具有制成用于优异的肝脏递送和高肝脏蛋白表达的强效lnp制剂的潜力。因此，这些脂质有潜力用于开发用于肝脏内蛋白替代疗法或基因编辑的lnp。
544、表4.小鼠体内hepo试验使用的lnp
545、
546、表5. lnp中各组分的具体比例
547、
548、