本发明属于生物。更具体地，本发明涉及一种对细胞内q-trna含量敏感的报告基因构建体，其可用于测量样本中的辫苷（queuosine）（q）或辫苷前体。

背景技术：

1、将遗传信息翻译为蛋白质，需要核糖体和转运rna（trna）对信使rna（mrna）进行高效且准确的解码。在所有rna种类中，trna发生的化学修饰类型最为丰富。越来越多的证据表明，trna修饰对trna功能的多个方面（例如折叠、稳定性及解码）至关重要，代表了另外的基因调控水平。尽管其在翻译过程中发挥着关键作用，但人们对几种trna修饰的生理功能尚不完全清楚。

2、一种这样的修饰是辫苷。辫苷（q）是一种核苷，其可以取代酪氨酸、组氨酸、天冬酰胺和天冬氨酸trna反密码子第34位上的鸟苷，从而对蛋白质翻译进行精细调控。编码这些氨基酸的密码子分别为uau/uac（tyr）、cau/cac（his）、aau/aac（asn）和gau/gac（asp），其被统一表示为nau/nac。q存在于细菌和真核生物中，但其从头生物合成仅在细菌中发生。q的生物合成途径始于对gtp进行五次连续的修饰，该过程由酶fole、qued、quee、quec和quef催化，从而生成preq1前体。该前体通过trna-鸟嘌呤转糖基酶（tgt）被整合到trna中，并最终在quea和queg/queh的作用下转化为q。尽管许多物种能够从头合成q，但q前体的补救合成同样存在。某些物种利用yhhq转运蛋白导入preq0和preq1前体。某些细菌能够捕获喹因（queuine（q），即q核碱基），并将其转化为preq1。其他细菌和真核生物分别通过使用tgt同源物或真核tgt（etgt）直接用q替换trna第34位上的鸟嘌呤。无法从头合成q的细菌以及真核生物需要通过微生物组和/或营养源来补救合成q前体。

3、鉴于q修饰位于对密码子识别至关重要的摆动反密码子位置，现有观点认为trnaq修饰的作用之一是调节nau密码子翻译速率。然而，其生理作用仍未完全阐明。多项针对真核生物开展的研究已揭示，trna q-修饰参与了多种不同的过程，包括黑腹果蝇（ drosophila melanogaster）的蛹成熟、盘基网柄菌（ dictyostelium discoideum）的细胞聚集以及哺乳动物的抗氧化防御系统、缺氧、癌症和增殖。已有报道称，在细菌中的trna q-修饰不仅参与了对多种胁迫因子（例如热休克、低酸性ph、紫外线辐射、高氯酸盐和砷）的抵抗过程，还参与了病原体弗氏志贺菌（ shigella flexneri）毒力的调控以及苜蓿中华根瘤菌（ sinorhizobium meliloti）根瘤细胞感染效率的调控。这些广泛多样且分布广泛的表型背后的分子机制目前尚未被完全阐明。先前的研究表明，q的可用性尤其会影响富含nau密码子的基因（称为“q-基因”）的翻译，导致其所编码的蛋白质的表达水平将随trna的q修饰程度的不同而产生差异。在这方面，这种通用调控机制可能是导致各种各样的报道的q相关表型的原因，而这些表型可能因特定nau密码子富集基因在每个生物体中的作用而异。此外，由于在多细胞生物体中，q修饰完全依赖于饮食或肠道微生物组，且q在细菌中控制着生物膜的形成和毒力，因此人们认为，较高含量的q与某些微生物生态失调相关的病理疾病（例如慢性肠道疾病）存在关联。

技术实现思路

1、因此，本领域对检测和调控辫苷含量具有明显的兴趣，这不仅有助于阐明trna q-修饰的生理作用，还可以帮助治疗细菌感染及其他与微生物组相关的复杂病理疾病。在这方面，目前尚无用于测量辫苷或其前体的特异性技术。理论上，这些测量可以使用色谱法或质谱法等通用技术进行。然而，尚无标准化的方案能够利用这些技术来测量辫苷；此外，由于这些技术极其复杂，不仅价格昂贵，还需要专业人员。

技术特征：

1.一种基因构建体，其中所述基因构建体包含：

2.根据权利要求1所述的基因构建体，其中所述基因构建体包含：

3.根据权利要求1或2中任一项所述的基因构建体，其中所述报告蛋白由egfp基因的修饰版本编码，其中所有nau密码子已被nac密码子替换（egfp（nac））。

4.根据权利要求3所述的基因构建体，其中所述构建体具有与seq id no:3具有80%同源性的序列。

5.一种宿主细胞，其中所述宿主细胞仅能使用外源辫苷或选自preq0、preq1和q的外源辫苷前体，并且其中所述宿主细胞包含根据权利要求1至4中任一项所述的基因构建体。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是δquef突变体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌的δquef突变株或枯草芽孢杆菌的δquef突变株。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的基因构建体或根据权利要求5至7中任一项所述的宿主细胞用于测量细胞中trna的辫苷修饰程度、用于检测样本中的辫苷和/或辫苷前体或用于测量样本中的辫苷和/或辫苷前体的用途，其中所述样本优选为生物样本。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的基因构建体或根据权利要求5至7中任一项所述的宿主细胞用于鉴定基因、蛋白质或化合物是否是q-trna生物合成的抑制剂或激活剂的用途。

10.一种用于测量样本中辫苷和/或辫苷前体的浓度的方法，其中所述样本优选为生物样本，所述方法包括：

11.一种用于鉴定化合物是否是q-trna生物合成的抑制剂或激活剂的方法，其中所述方法包括：

12.一种用于鉴定基因或基因产物是否是q-trna生物合成的抑制剂或激活剂的方法，其中所述方法包括：

13.一种试剂盒或测定装置，其包含足以检测和/或测量样本中辫苷和/或辫苷前体的试剂，其中所述试剂盒包含根据权利要求1至4中任一项所述的基因构建体或根据权利要求5至7中任一项所述的宿主细胞，并且其中所述试剂占所述试剂盒中的试剂的至少10%。

技术总结
本发明涉及一种对细胞内辫苷（Q）‑tRNA含量敏感的基因构建体。所述构建体是基于大肠杆菌组氨酸（His）操纵子的调控机制构建的，所述机制依赖于tRNA的辫苷修饰。所述构建体包括启动子，例如His操纵子（Phis）的启动子和His先导基因（hisL）。除了Phis和hisL之外，本发明的基因构建体还包含编码报告蛋白的基因，其中编码报告蛋白的基因缺少NAU密码子（即，编码报告蛋白的基因中的所有NAU密码子都已被修饰为NAC密码子）。通过这种方式，报告基因本身的翻译与Q‑tRNA含量无关。此外，基因构建体包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同源性的序列。所述构建体可用作成功检测细胞内的Q‑tRNA（His）的标志物，其也可用于定量检测样本中的辫苷和/或辫苷前体。
技术研发人员：J·迪亚斯-鲁略·阿罗科,J·E·冈萨雷斯·帕斯托尔
受保护的技术使用者：西班牙国家航空航天技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2026/9/4