本申请涉及生物化学分析检测，具体涉及一种基于碳酸根定量的脲酶活性浓度测量方法及应用。

背景技术：

1、脲酶（urease）是一种能催化尿素水解成氨和二氧化碳的酶，其在医学诊断（如幽门螺杆菌检测）、土壤农化分析、环境监测及食品加工等领域具有重要的研究意义。目前，测量脲酶活性的常用方法包括纳氏试剂比色法、靛酚蓝比色法以及电导率法等。

2、然而，现有技术主要存在以下不足：

3、1.操作繁琐，反应条件控制要求高，易受样品本身颜色或浊度的干扰。

4、2.测量精度较低，尤其是在低浓度活性范围内，灵敏度不足；在较高活性浓度下，产生的产物需要经过稀释才能进入有效测量范围内，稀释过程容易引入新的误差或本底干扰。

5、3.现有方法大多只能提供相对定性活性值或间接参数（如米氏常数等），缺乏针对特定条件下活性浓度（即单位质量或体积的底物酶的活性单位）的严格定量校准体系；且测量范围多集中于酶的动力学线性区间内，时间范围较窄，无法体现实际应用中脲酶的累计处理能力。

6、因此，如何提供一种操作简便、抗干扰能力强、测量精度高，且能实现严格定量、并反映酶累计处理能力的脲酶活性浓度测量方法，是本领域亟待解决的实际技术问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本申请的目的在于提供一种基于碳酸根定量的脲酶活性浓度测量方法及应用。该方法将待测样品与过量尿素底物在控温条件下反应，使脲酶催化底物水解生成碳酸根，再通过加入过量钙离子使碳酸根沉淀，并用edta滴定法测定剩余钙离子量，间接定量碳酸根生成量，进而计算酶活性浓度。该方法操作简便、抗干扰性强，且具有优异的重复性，可实现脲酶活性浓度的准确定量。

2、为达到上述目的，本申请提供了如下技术方案：

3、第一方面，本申请提供了一种基于碳酸根定量的脲酶活性浓度测量方法，包括以下步骤：

4、（1）对待测样品进行预处理，获得含有脲酶的待测液；

5、（2）配置过量的尿素底物溶液；所述尿素底物溶液中尿素的初始物质的量大于待测液中脲酶在反应时间内所能催化水解的尿素的最大物质的量；

6、（3）将待测液加入过量尿素底物溶液中，在设定温度下反应设定时间后，测定反应体系中碳酸根（co32-）的生成量；

7、（4）根据步骤（3）碳酸根的生成量计算脲酶活性（u），再根据参与反应的待测液所对应的待测样品质量，计算得出待测样品中脲酶的活性浓度（u/g）；所述脲酶活性为反应时间内生成的碳酸根总量与反应时间的比值；所述酶活性浓度为脲酶活性与参与反应的待测液所对应的待测样品质量的比值。

8、在某些实施方式中，步骤（1）中，所述样品预处理包括：将含脲酶的固体样品干燥粉碎后与水混合形成浊液，再将浊液进行过滤或离心分离，取上部清液作为待测液。

9、在某些实施方式中，步骤（2）中，尿素底物溶液的浓度为5-80 g/l。

10、在某些实施方式中，步骤（3）中，反应温度为5-65 ℃；反应时间为24小时。

11、在某些实施方式中，步骤（3）中，所述测定碳酸根生成量的具体步骤为：向反应后的体系中加入过量氯化钙溶液和适量氢氧化钠溶液，使碳酸根完全沉淀为碳酸钙，经过滤或离心分离后，采用edta标准溶液对剩余钙离子进行滴定，通过钙离子的消耗量间接计算碳酸根的生成量。

12、在某些优选的实施方式中，所述步骤（1）还包括设置样品空白对照的步骤：取灭活的样品或向样品中加入底物抑制剂，按照相同步骤进行测定，将样品测定结果扣除空白对照结果，以消除样品基质的干扰。

13、在某些实施方式中，所述脲酶活性浓度的计算公式为：

14、酶活性浓度（u/g）=脲酶活性/待测液中所含样品质量，其中1个酶活性单位（u）定义为每分钟催化生成1微摩尔碳酸根所需的酶量。

15、在某些优选的实施方式中，所述待测样品为豆粉，所述豆粉包括黄豆粉、黑豆粉或刀豆粉。

16、第二方面，本申请提供了第一方面所述的测量方法在豆粉中脲酶活性浓度检测中的应用。

17、与现有技术相比，本申请至少具备以下有益效果：

18、1.本申请提供的方法操作简便、设备要求低。整个检测过程仅涉及样品预处理、恒温反应和edta滴定等常规操作，无需使用分光光度计等精密仪器，对设备种类和复杂性要求低；所采用的试剂获取便利、毒性低、价格低廉，适合在常规实验室及工业生产现场推广应用。

19、2.本申请通过测定碳酸根生成量间接反映脲酶活性，能够有效避免样品自身颜色或浊度对检测结果的干扰，且无需考虑环境中氨本底值的影响，尤其适用于高活性浓度样品的准确检测，克服了现有比色法在有色或浑浊样品中适用性差的技术缺陷。

20、3.本申请通过底物过量和24小时充分反应的设计，使测量结果能够真实反映脲酶对底物的累计处理能力，实现了样品中脲酶活性浓度的准确定量，为后续生产应用中物料投加量的确定提供了可靠的数据支撑。

21、4.本申请具有良好的测量重复性和准确性。实验结果表明，在底物浓度为5-80 g/l的宽范围内，同一批次样品的测量结果误差小于2%，批内和批间误差均可控制在2%以内。此外，与纳氏试剂比色法的对比实验表明，本申请测量结果与国家标准方法的相对误差小于2%，验证了本申请的准确性和可靠性。

1.一种基于碳酸根定量的脲酶活性浓度测量方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的脲酶活性浓度测量方法，其特征在于，步骤（1）中，所述样品预处理包括：将含脲酶的固体样品干燥粉碎后与水混合形成浊液，再将浊液进行过滤或离心分离，取上部清液作为待测液。

3.根据权利要求1所述的脲酶活性浓度测量方法，其特征在于，步骤（2）中，尿素底物溶液的浓度为5-80 g/l。

4.根据权利要求1所述的脲酶活性浓度测量方法，其特征在于，步骤（3）中，反应温度为5-65 ℃；反应时间为24小时。

5.根据权利要求1所述的脲酶活性浓度测量方法，其特征在于，步骤（3）中，所述测定碳酸根生成量的具体步骤为：向反应后的体系中加入过量氯化钙溶液和适量氢氧化钠溶液，使碳酸根完全沉淀为碳酸钙，经过滤或离心分离后，采用edta标准溶液对剩余钙离子进行滴定，通过钙离子的消耗量间接计算碳酸根的生成量。

6.根据权利要求1所述的脲酶活性浓度测量方法，其特征在于，所述步骤（1）还包括设置样品空白对照的步骤：取灭活的样品或向样品中加入底物抑制剂，按照相同步骤进行测定，将样品测定结果扣除空白对照结果，以消除样品基质的干扰。

7.根据权利要求1所述的脲酶活性浓度测量方法，其特征在于，所述脲酶活性浓度的计算公式为：

8.根据权利要求1所述的脲酶活性浓度测量方法，其特征在于，所述待测样品为豆粉，所述豆粉包括黄豆粉、黑豆粉或刀豆粉。

9.权利要求1-8任一所述的脲酶活性浓度测量方法在豆粉中脲酶活性浓度检测中的应用。