专利名称:同时检测两种兰花病毒的二温式多重rt-pcr试剂盒与制备方法
技术领域：
本发明涉及一种植物病毒检测试剂盒，尤其是涉及一种同时检测两种兰花病毒的 二温式多重RT-PCR试剂盒与制备方法。
背景技术
兰花病毒多达20多种，其中以建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus, CyMV)禾口 齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, 0RSV)最为普遍，危害最严重。由于兰花 病毒无法使用药剂进行防治，因此如何尽早检测兰花病毒，剔除带病兰花，成为目前最主要 的防治途径。
公开号为CN1975427、CN1975428、CN1975425、CN1975426、CN101294962 的中国专
利申请分别采用斑点酶联、双抗夹心酶联和胶体金试纸条等血清学技术建立建兰花叶病毒 和齿兰环斑病毒检测技术；但是涉及的检测技术无法克服血清学检测方法的缺陷，存在灵 敏度低和大量假阴性样品无法检出等缺点；仅仅能够满足日常生产检测需要，对于病毒含 量较低的样品，难于有效进行检测。因此在兰花生产过程中采用以上发明的检测技术只能 够对发病前的样品进行检测、筛选，对于病毒的防治仅仅是治标，无法从根本上解决病毒问 题。
只有通过高灵敏度的病毒检测技术筛选真正无毒的植株作为母本进行种苗的生 产，才能从根本上解决病毒的问题。目前，有关高灵敏度病毒检测方法，最为成熟的技术就 是RT-PCR检测方法，该方法能够检测的最低病毒浓度为500CopieS/mL，相当于每毫升样品 液含2fg病毒，检测灵敏度达到血清学技术的IO6倍。因此该方法是目前最为可靠的病毒 检测技术，能够满足无毒扩繁母株的筛选，从而生产无毒种苗，从根本上解决病毒的危害问 题。但是由于该方法检测成本非常高，按每个样品检测两种病毒进行两次RT-PCR的话，就 需要1000元人民币检测费用，非常昂贵。再加上由于现在病毒泛滥，通常都需要通过检测 10份以上的样品，才有机会得到一株无毒母株。由于企业无法承担高昂的成本种苗，因此最 终只能通过继续生产普通种苗充斥兰花产业，造成恶性循环。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的病毒检测技术存在灵敏度低、需要分次检测、费用 较高等问题，提供一种能够在一次检测过程中同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR 试剂盒及其使用方法。
所述同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒由以下试剂组成
试剂A =RT反应液，含有M-MuLV逆转录酶缓冲液、随机引物、dNTP。
试剂B =M-MuLV逆转录酶。
试剂C :PCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、检测引物。
试剂D Taq聚合酶。[0011]试剂E:对照品。
所述5XM-MuLV逆转录酶缓冲液为5 10 y L，所述随机引物(0. luM)为1 2 y L， 所述 dNTP (10mM)为 0. 5 1 ii L。
所述PCR 缓冲液为 2. 5 5ii L，所述 MgCl2(25mM)为 2. 5 5 ii L，所述 dNTP (10mM) 为0. 5 1 y L，所述检测引物(0. luM)为1 2 y L ；所述检测引物的序列如下
CyMV 上游引物5 ‘ -GCTACCGCCGCCATCGTCAT-3 ‘
CyMV 下游引物5 ‘ -GCGCAGCACGTTCACGGTCA-3 ‘
ORSV 上游引物5 ‘ -CCACCGAACTTACTGAAGCA-3 ‘
ORSV 下游引物5' -TGTCGTAAGGTTGACCACTC-3 ‘。
所述对照品分为阳性对照和阴性对照，阳性对照为带有两种病毒的冻干兰花叶片 粉末，阴性对照为无两种病毒的冻干兰花叶片粉末。
所述两种兰花病毒为建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)和齿兰环斑 病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)。
所述同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒的使用方法如下 每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。
1)逆转录即cDNA合成。总体积25 u L，RNA经94°C预变性5min后置于冰浴中待 测，取RNA 1 u L、试剂A 23. 5 u L、试剂B 0. 5 ii L。于37°C水浴反应1小时合成cDNA。
2)扩增检测总体积25 ii L，其中cDNA 1 u L，同时检测两种病毒的PCR反应液 23. 5ii L、试剂 D 0. 5u L0
3)取反应产物5 u L按常规琼脂糖凝胶电泳测定扩增条带大小。
在步骤2)中，所述扩增检测采用二温式PCR，具体程序(即反应条件)如下94°C 变性 5min ；然后 94°C 45s，68°C 100s，25 个循环；最后 72°C延伸 5min。
结果判定方法如下
阳性对照在多重扩增中均得到了清晰特异的预期扩增条带，与100bp标准分子量 对照，CyMV条带大小为769bp、0RSV条带大小为1000bp，阴性对照无扩增条带。样品跟条带 的有无及出现位置可以判定是否感染相应病毒。
本发明在常规RT-PCR基础上，采用多重PCR技术(m_PCR)提供了一种同时检测 两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒。该试剂盒可以在一次检测过程中利用一次 RT-PCR实验同时快速检测两种兰花病毒，将PCR退火和延伸两个步骤合并为一个步骤，同 常规RT-PCR相比具有检测时间更短和检测灵敏度更高等优点，检测灵敏度相对血清学方 法有较大提高。从而减少检测的反应数目，降低成本，可节约一半的检测费用，是一种高效、 低成本的检测方法，可促进企业生产无毒种苗，保障产业健康发展，也能够由检疫部门所采 用，对进出口兰花进行严格的检验检疫，更加有效地保障国内兰花企业的利益，是一种经 济、快速、高效的试剂盒。
本发明特别适用于兰花企业、口岸检疫部门以及相关科研院所使用。
图1为本发明实施例1的电泳检测结果。在图1中，M 标准分子量；1 阴性对照； 2:阳性对照；3 10:检测样品。[0031]图2为本发明实施例2的电泳检测结果。在图2中，M 标准分子量；1 阳性对照； 2:阴性对照；3 5:检测样品。
图3为二温式多重RT-PCR随机检测大棚兰花样品。在图3中，M为DNA标准分子 量(λ /EcoR 471) ；+ =CyMV与ORSV阳性对照；-健康植株；1 12 检测样品。根据结果表 明样品1、2、4、5、7、10、11带有ORSV ；样品4带有CyMV0
图4为二温式多重RT-PCR随机检测大棚兰花样品。在图4中，M为DNA标准分子 量(λ /EcoR 471) ；+ =CyMV与ORSV阳性对照；-健康植株；13 20 检测样品。根据结果 表明样品14、16、17、18带有ORSV ；样品13、17、20带有CyMV0
图5为二温式多重RT-PCR随机检测大棚兰花样品。在图5中，M为DNA标准分子 量(λ /EcoR 471) ；+ =CyMV与ORSV阳性对照；-健康植株；21 33 检测样品。根据结果 表明样品 22、24、25、26、29、30、31、32、33 带有 ORSV ；样品 27,29 带有 CyMV0
具体实施方式
以下实施例将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1 二温式多重RT-PCR试剂盒在无毒蝴蝶兰母本筛选中的应用
根据实际运用的要求，在进行病毒检测前，完成蝴蝶兰样品的采集工作，并采用 Trizol试剂提取样品RNA备用。本实施例仅作为示范，采集样品数量可以包括3个样品，同 时也可以根据不同的要求检测更多或更少的样品数。
UcDNA合成取Trizol试剂提取的总RNA IyL经94°C预变性5min后置于冰浴 中待测，加入试剂A 23. 5 μ L、试剂B 0.5 μ L0于37°C水浴反应1小时合成cDNA。
2、扩增检测总体积25 μ L，其中cDNA 1 μ LPCR反应液23. 5 μ L试剂D 0. 5 μ L反 应条件94°C变性5min ；然后94°C 45s, 68°C 100s，25个循环；最后72°C延伸5min。
3、取反应产物5 μ L按常规琼脂糖凝胶电泳测定扩增条带大小。
4、结果判定电泳结果见图1、阴性对照无扩增条带，阳性对照可扩增到大小为 769bp (CyMV) UOOObp (ORSV)的片段。在检测的8个样品中，样品3、7无扩增条带说明不带 有病毒，适合作为母本繁殖种苗；其他样品带有1 2种病毒，因此不适宜作为母本进行繁 殖。
实施例2 二温式多重RT-PCR试剂盒在进口蝴蝶兰病毒检测中的应用
根据实际运用的要求，在进行病毒检测前，完成隔离试种的蝴蝶兰样品的采集工 作，并采用Trizol试剂提取样品RNA备用。本实施例仅作为示范，采集样品数量可以包括 3个样品，同时也可以根据不同的要求检测更多或更少的样品数。
UcDNA合成取Trizol试剂提取的样品总RNA IyL经94°C预变性5min后置于 冰浴中待测，加入试剂A23. 5 μ L、试剂B 0. 5 μ L。于37°C水浴反应1小时合成cDNA。
2、扩增检测总体积25 μ L，其中cDNA 1 μ L、PCR反应液23. 5 μ L、试剂D 0· 5 μ L。 反应条件94°C变性5min ；然后94°C 45s, 68°C 100s，25个循环；最后72°C延伸5min。
3、取反应产物5 μ L按常规琼脂糖凝胶电泳测定扩增条带大小。
4、结果判定电泳结果见图2、阳性对照可以扩增到大小为769bp (CyMV)、 IOOObp(ORSV)的片段，阴性对照无扩增条带。样品1带有齿兰环斑病毒、样品3带有建兰花 叶病毒不符合检疫要求，因此不能进口 ；样品2无带毒，因此允许进口。[0048]实施例3 二温式多重RT-PCR试剂盒在兰花病毒调查中的应用
根据实际运用的要求，在进行病毒检测前，完成大棚种植兰花样品的采集工作，并 采用Trizol试剂提取样品RNA备用。本实施例仅作为示范，采集样品数量可以包括33个 样品，同时也可以是根据不同的要求检测更多或更少的样品数。
1、cDNA合成取Trizol试剂提取的样品总RNA luL经94°C预变性5min后置于 冰浴中待测，加入试剂A 23. 5 u L、试剂B 0. 5 ii L。于37°C水浴反应1小时合成cDNA。
2、扩增检测总体积25 u L，其中cDNA 1 u L、PCR反应液23. 5 u L、试剂D 0. 5u L0 反应条件94°C变性5min ；然后94°C 45s，68°C 100s，25个循环；最后72°C延伸5min。
3、取反应产物5 u L按常规琼脂糖凝胶电泳测定扩增条带大小。
4、结果判定阳性对照可以扩增到大小为769bp(CyMV)、1000bp(0RSV)的片段，阴 性对照无扩增条带。6个样品检测出CyMV，阳性率18. 2% ；20个样品检测出0RSV，阳性率 60.6%；3个样品同时检测出两种病毒，占9. 0%。因此应该及时淘汰带毒样品，或对带毒植 株进行隔离种植。
二温式多重RT-PCR随机检测大棚兰花样品参见图3 5。
权利要求
同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在于由以下试剂组成试剂ART反应液，含有M-MuLV逆转录酶缓冲液、随机引物、dNTP；试剂BM-MuLV逆转录酶；试剂CPCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、检测引物；试剂DTaq聚合酶；试剂E对照品。
2.如权利要求
1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征 在于所述5XM-MuLV逆转录酶缓冲液为5 10 ii L，所述随机引物为1 2 y L，所述dNTP为 0. 5 1 ii L。
3.如权利要求
1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在 于所述PCR缓冲液为2. 5 5 ii L，所述MgCl2为2. 5 5 y L，所述dNTP为0. 5 1 y L，所 述检测引物为1 2iiL。
4.如权利要求
1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在 于所述检测引物的序列如下CyMV 上游引物5 ‘ -GCTACCGCCGCCATCGTCAT-3 ‘CyMV 下游引物5 ‘ -GCGCAGCACGTTCACGGTCA-3 ‘0RSV 上游引物5 ‘ -CCACCGAACTTACTGAAGCA-3 ‘0RSV 下游引物5 ‘ -TGTCGTAAGGTTGACCACTC-3 ‘。
5.如权利要求
1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征在 于所述对照品分为阳性对照和阴性对照，阳性对照为带有两种病毒的冻干兰花叶片粉末， 阴性对照为无两种病毒的冻干兰花叶片粉末。
6.如权利要求
1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒，其特征 在于所述两种兰花病毒为建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CyMV)和齿兰环斑病毒 (Odontoglossum ringspot virus, 0RSV)。
7.如权利要求
1所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒的使用方 法，其特征在于包括以下步骤每次检测均应设立阳性对照和阴性对照；1)逆转录即cDNA合成。总体积25u L，RNA经94°C预变性5min后置于冰浴中待测， 取RNA lu L、试剂A 23. 5 u L、试剂B 0. 5 y L。于37°C水浴反应1小时合成cDNA ；2)扩增检测总体积25iiL，其中cDNA1 u L,同时检测两种病毒的PCR反应液 23. 5ii L、试剂 D 0. 5u L ；3)取反应产物5u L按常规琼脂糖凝胶电泳测定扩增条带大小。
8.如权利要求
7所述的同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒的使用方 法，其特征在于在步骤2)中，所述扩增检测采用二温式PCR，具体程序如下94°C变性5min ； 然后 94°C 45s，68°C 100s，25 个循环；最后 72°C延伸 5min。
专利摘要
同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒与制备方法，涉及一种植物病毒检测试剂盒。提供一种能够在一次检测过程中同时检测两种兰花病毒的二温式多重RT-PCR试剂盒及其使用方法。试剂盒包括试剂ART反应液，含有M-MuLV逆转录酶缓冲液、随机引物、dNTP。试剂BM-MuLV逆转录酶。试剂CPCR反应液，含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、检测引物。试剂DTaq聚合酶。试剂E对照品。使用方法每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。逆转录；扩增检测；取反应产物5μL按常规琼脂糖凝胶电泳测定扩增条带大小。特别适用于兰花企业、口岸检疫部门以及相关科研院所使用。
文档编号C12Q1/68GKCN101871019SQ201010225728
公开日2010年10月27日 申请日期2010年7月9日
发明者吴美爱, 明艳林, 童庆宣, 郑国华, 郑志忠, 陈良华 申请人:厦门华侨亚热带植物引种园导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan