富集精细胞群的方法

专利名称:富集精细胞群的方法
技术领域：
本发明一般涉及富集精细胞群。具体而言，本发明一般涉及不物理分选细胞而对活精细胞群的富集。
发明背景
通过人工授精(Al)使动物受精以及体外受精后的胚胎移植已经是ー项成熟的操作。在家畜产业中，能够对繁殖结果施加影响而使其后代具有ー种或多种期望特征有明显的优势。例如，乳制品产业中如能预先选择后代有利于雌性以保证奶牛的产量，则会带来经济效益。将精子分离为富集的带有X和Y染色体的细胞群，即称作的性别富集精子或性别富集精液，便是实现预选后代的方法之一。
Johnson等人(美国专利号5，135，759)描述了使用流式细胞仪/细胞分选仪根据DNA内容物将带有完整X和Y染色体的精子群分离为带有X和Y染色体精子富集的细胞群。如所述，将精子与DNA选择性标记物在30°C到39°C的温度下混合I小时(39°C )到I. 5小时(30°C)。接着使用流式细胞仪測量当精子通过激光束时发出的荧光量。由于带有X染色体的精子比带有Y染色体的精子含有更多的DNA(由物种决定约为3<%到5%)，带有乂染色体的精子比带有Y染色体的精子产生更大的荧光光強。使含有预定荧光強度的单个精子的液滴带上电荷并使其静电偏离至收集容器中。接着将收集的性别富集的精子群用于显微注射或人工授精。显然，这一方法需要物理分选精细胞以获得性别富集的精子群。根据JOhnson的物理分选是费时且高成本的。
发明概沭
本发明的多方面之一是关于一种特征富集的精子分散体(有时称为悬浮液)的制备方法。在一个实施方案中，例如，将本发明的方法用于制备关于X或Y染色体精子富集的精子分散体。
简言之，因此，本发明涉及选择性降低精细胞分散体中精细胞的亚群使卵受精的能力。该方法包括在液体中形成标记的精细胞的分散体，所述液体包含诱导精子不运动性的化学剂或具有诱导精子不运动性的温度，其中与精细胞结合的标记的存在、缺少或数量指示分散体中精细胞亚群的遗传、蛋白质组学、结构或功能特征。该方法还包括光学检测分散体以鉴定作为亚群成员的个体精细胞；确定分散体中亚群成员的位置；和向分散体内不同位置递送能量剂量以选择性降低亚群成员使卵受精的能力而不类似地影响在分散体中其它位置的精细胞。
本发明还涉及使用富集的精细胞群授精雌性哺乳动物的方法。该方法包括在液体中形成标记的精细胞的分散体，所述液体包含诱导精子不运动性的化学剂或具有诱导精子 不运动性的温度，其中与精细胞结合的标记的存在、缺少或数量指示分散体中精细胞亚群的遗传、蛋白质组学、结构或功能的特征。该方法还包括光学检测分散体以鉴定作为亚群成员的个体精细胞；确定分散体中亚群成员的位置；向分散体内不同位置递送一定的能量以选择性降低亚群成员使卵受精的能力而不类似地影响在分散体中其它位置的精细胞；和其后使用该分散体或其衍生物授精雌性哺乳动物。
本发明还涉及体外受精的方法。该方法包括在液体中形成标记的精细胞的分散体，所述液体包含诱导精子不运动性的化学剂或具有诱导精子不运动性的温度，其中与精细胞结合的标记的存在、缺少或数量指示分散体中精细胞亚群的遗传、蛋白质组学、结构或功能的特征。该方法还包括光学检测分散体以鉴定作为亚群成员的个体精细胞；确定分散体中亚群成员的位置、向分散体内不同位置递送能量剂量以选择性降低亚群成员使卵受精的能力而类似地影响在分散体中其它位置的精细胞；和其后使用所述分散体或其衍生物使卵体外受精。可以在其后将受精卵导入雌性哺乳动物的子宮。
本发明还涉及形成冷冻的精子分散体的方法。该方法包括在液体中形成标记的精细胞分散体，所述液体包含诱导精子不运动性的化学剂或具有诱导精子不运动性的温度，其中与精细胞结合的标记的存在、缺少或数量指示分散体中精细胞亚群的遗传、蛋白质组学、结构或功能的特征。该方法还包括光学检测分散体以鉴定作为亚群成员的个体精细胞；确定分散体中亚群成员的位置；向分散体内不同位置递送能量剂量以选择性降低亚群成员使卵受精的能力而不类似地影响在分散体中其它位置的精细胞；和其后冷冻保藏该分散体。
本发明的其它方面和特征部分是显而易见的，部分将于下文说明。
发明详述
有利的是，不使用物理分选细胞可以关于根据本发明的一种特征富集活的精细胞群。这ー特征可以是，例如，精细胞带有X还是Y染色体。备选地，该特征可以是另ー遗传特征，例如单核苷酸多态性(“SNP”)的存在，所述多态性编码提高的动物生育力(例如，提高的奶产量)，或编码改善所选细胞的冷藏的脂质。该特征还可以是蛋白质组特征，例如提高精子性能的蛋白质，例如将会通过改善有益的顶体特征而提高在子宮内的性能的蛋白质。该特征还可以是结构特征(例如顶体完整性)，或功能特征(例如前向运动性)。
可以关于遗传、蛋白质组、结构或功能特征实现精细胞群的富集，其通过，例如标记群体中具有(或，备选地，缺少)该特征的精细胞，使精细胞基本不动和选择性地向不动的精细胞施加一定能量以降低所施用的细胞的存活力或至少降低所施用的细胞在体外或体内使卵受精的能力(即，授精之后)。因为分散体(有时称为悬浮液)中的精细胞基本不运动并且被选择性标记，所以可以将能量束传递到分散体中的特定位置来向个体精细胞施用；通过重复这一方法步骤，即个别地向分散体中不同位置上不运动的精细胞施用，可以有效富集分散体中具有期望特征的精细胞亚群，例如就具有所期望特征的亚群细胞的百分比而论；就由于用精细胞受精而产生的具有某种遗传或蛋白质组特征的子代的百分数而论或就这两者而论有效富集。在任意事件中，可以不用物理分离具有期望特征的细胞与缺少期望特征的细胞(即，不用分离施用的细胞和未施用的细胞)而富集精细胞群的特定亚群。任选地，可以根据下述方法通过物理分离施用的和未施用的细胞成分开的亚群，另外地纯化所述细胞以获得细胞的进ー步富集。
精细胞分散体[0018]精细胞密度
一般而言，可以用宽范围精细胞密度制备具有可以以某种特征富集的群体的精细胞分散体。然而，通常精细胞密度在至少约I X IO3个精子/ml，并且通常不超过约5X IOltl个精子/ml，且更优选地不超过约5X IO8个精子/ml分散体。例如，在一个实施方案中，分散体中可含有“相对低”密度的精子，即精子密度少于约IX IO7个精子/ml，优选少于约IX IO6个精子/ml，更优选约I X IO3至约5 X IO6个精子/ml，还更优选约I X IO3至约I X IO6个精子/ml，甚至更优选约I X IO4至约I X IO5个精子/m l，和最优选约I X IO5个精子/ml分散体。在备选的实施方案中，分散体中可含有“中间”密度的精子，即密度为约I X IO7至约I X IO8个精子/ml分散体。在再一个实施方案中，分散体中可含有“相对高”密度的精子，即精子密度至少为约I X IO8个精子/ml，优选约I X IO8至约5 X 101°个精子/ml，更优选约I. 5 X IO8至约2 X 101°个精子/ml，甚至更优选约I. 5 X IO8至约2 X IO8个精子/ml，还更优选约I. 5 X IO8个精子/ml分散体。因此，例如，在一个实施方案中，分散体中可含有至少约O. 04X 106、在另ー个实施方案中至少约I X 106、在另ー个实施方案中至少约I. 5X 106、在另ー个实施方案中至少约2X 106、在另ー个实施方案中至少约3 X 106、在另ー个实施方案中至少约O. 5X107、在另ー个实施方案中至少约IX 107、在另ー个实施方案中至少约I. 25X 107、在另ー个实施方案中至少约2X107、在另ー个实施方案中至少约3X107、在另ー个实施方案中至少约4X 107、在另ー个实施方案中至少约5X 107、在另ー个实施方案中至少约6X 107、在另ー个实施方案中至少约7. OX 107、在另ー个实施方案中至少约8X 107、在另ー个实施方案中至少约9X107、在另ー个实施方案中至少约IOX 107、在另ー个实施方案中至少约11X107、在另ー个实施方案中至少约12X107、在另ー个实施方案中至少约I. OX 108、在另ー个实施方案中至少约I. 25X 108、在另ー个实施方案中至少约I. 5X 108、在另ー个实施方案中至少约I. 75X 108、在另ー个实施方案中至少约2. OX 108、在另ー个实施方案中至少约2. 25X IO8,在另ー个实施方案中至少约2. 5X 108、在另ー个实施方案中至少约2. 75X 108、在另ー个实施方案中至少约3X108、在另ー个实施方案中至少约5X108、在另ー个实施方案中至少约
7.OX 108、或甚至至少约8 X IO8个精子/ml分散体。在备选的实施方案中，分散体可以含有少于约9/105、少于约7/105、少于约5/105、少于约2/105、少于约1/105、少于约1父104，或甚至少于约I X IO3个精子/ml分散体。
精子的密度可以基于许多因素改变，所述因素包括，例如哺乳动物不同物种之间的差异、哺乳动物单个物种之中的差异和甚至在单个哺乳动物不同的，(一次射出的)精液中的差异。例如，牛精子可以高密度，但通常较小的体积存在于分散体中，例如在约O. 5ml到约25ml的体积中O. 5X IO6个精子/ml到约8X IO7个精子/ml。然而，猪精子可以较低密度，但通常较大的体积存在于分散体中，例如在约50ml到约250ml的体积中O. 04X IO6个精子/ml到约I X IO7个精子/ml。
精子分散体中的精子密度还取决于精细胞随后被富集或分选的方法。例如，可以如在美国专利申请公开号US 2005/0112541(其内容在此被完整引入作为參考)所述使用流式细胞仪分选精细胞。在这类情况下，分散体可以通常为“中间”或“相对高”密度的精子。使用标记物(例如本文所述的染料和标记物)标记的较低密度的精子，如相对低”密度的精子可适用于如下文更详细描述的其它的分选或富集技木。
还可以人工地操作精子分散体中的精子密度以获得特定精子密度的分散体。精子分散体中(例如包含在授精吸管中的)精子密度的操作可以基于如下因素，如分散体可储存的温度、储存时间长度、精子在精子分散体中是分选的或未分选的、从其收集精子的雄性哺乳动物的物种、从其收集精子的哺乳动物的生育力以及将被授精的雌性哺乳动物的物种。[0023]还可以通过简单地浓缩精子(例如通过离心)影响精子分散体中精子的密度。在这类情况下，所述分散体将被基本分成(通常称为)沉淀(含有少量液体的细胞团)和上清液(可溶的液体级分)。接着可以不破坏沉淀地倒掉上清液，由此产生含有少量抑制剂的精细胞相对致密的沉淀，该作用減少分散体体积而不改变分散体的组分。结果，沉淀的精细胞保持在不运动状态。
精细胞的不运动性
精细胞分散体含有相当大程度上減少运动性的精细胞。精细胞分散体中精细胞运动性的相当大程度上的減少可通过多种方式获得，其包括例如，通过将精细胞与运动性抑制剂接触、通过降低精细胞或精细胞周围紧邻环境(即精子分散体)的温度、或通过两者的组合。在优选的实施方案中，本发明的精子分散体中精细胞在某些方面表现出附睾精子特征性方式的行为，例如，群体中的精细胞基本不运动，和/或相对于洗涤或刚射出的精子而言，其内源呼吸速率更低。有利地，不运动的精细胞(有时称为静止精细胞)在从抑制剂分离或暴露于升高的温度中时，其运动性能够表现出射出的精子的特征性行为，而在ー个实施方案中，其运动性和呼吸都可表现出射出精子的特征性行为。
在一个实施方案中，例如，通过HTM-IVOS精子分析(Hamilton-Thorne HTM-IVOS计算机辅助精子分析系统，Hamilton-Thorne Research,Beverly MA)测量,抑制剂、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的路径速度(有时称为运动性或路径运动性)、前向速度(有时称为前向运动性)或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时，降低至少约50%。优选通过HTM-IVOS精子分析測量，运动抑制齐U、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时，降低至少约60%。更优选通过HTM-IVOS精子分析測量，运动抑制剂、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时，降低至少约70%。还更优选通过HTM-IVOS精子分析測量，运动抑制齐U、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时，降低至少约80%。甚至更优选通过HTM-IVOS精子分析測量，运动抑制剂、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时，降低至少约90%。甚至更优选通过HTM-IVOS精子分析測量，运动抑制剂、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时，降低至少约95%。最优选通过HTM-IVOS精子分析測量，运动抑制剂可使分散体中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的路径速度、前向速度或两者同时，降低至少约99%。
可以使用运动抑制剂在相当大程度上降低精细胞分散体中精细胞的运动性。抑制剂可以为对精子运动性具有抑制作用的一系列组合物中的任意ー种。此类组合物包括如钠通道抑制剂，如毒毛花苷G ;包含钾离子的组合物；以及包含钾离子和钠离子的组合物。例如，分散体中相对高浓度的钾离子会抑制精子运动性。因此一般而言，优选分散体包含钾离子源且分散体中的钾浓度为至少约O. 05mol/Lo更优选钾离子浓度为至少约O. 05mol/L至约O. 5mol/Lo还更优选钾离子浓度为至少约O. lmol/L至约O. 3mol/L。最优选钾离子浓度为约O. 173mol/L。此类分散体通常(但非必须)也包含钠离子源。当存在钠时，钾和钠的摩尔比一般分别等于或大于I : 1，但摩尔比一般不超过8 I。优选钾和钠的摩尔比为至少约I. 25 I。还更优选钾和钠的摩尔比为至少约1.5 I。还更优选钾和钠的摩尔比为 至少约I. 75 I。还更优选钾和钠的摩尔比为至少约I. 78 I。在ー个具体实施方案中，钾和钠的摩尔比为至少约2 I。而在另一实施方案中，钾和钠的摩尔比为至少约3 I。在另ー实施方案中，钾和钠的摩尔比为至少约4 I。在另ー实施方案中，钾和钠的摩尔比为至少约5 I。在另ー实施方案中，钾和钠的摩尔比为至少约6 I。在另ー实施方案中，钾和钠的摩尔比为至少约7 I。在另ー实施方案中，钾和钠的摩尔比为至少约8 I。
精子分散体中还可另外含有能够促进运动性下调的离子或ニ氧化碳源。在该实施方案中，ニ氧化碳的来源可以为，例如ー种或多种碳酸盐。在目前优选的一个实施方案中，精子分散体含有NaHCO3和KHC03(由此提供钾和钠离子源)以及增加的ニ氧化碳分压(相对于周围大气)。例如，在目前优选的一个实施方案中，精子分散体含有NaHCO3和KHCO3的水溶液，优选NaHC03、KHCO3和C6H8O7 · H2O的水溶液；ー般而言，分散体系中KHCO3的浓度可为至少约O. 05mol/Lo更优选KHCO3的浓度为至少约O. 05mol/L至约O. 5mol/し还更优选KHCO3的浓度为至少约O. lmol/L至约O. 3mol/L。在特别优选的实施方案中，如 Salisbury&Graves, J. Reprod. Fertil.，6 :351-359 (1963)中公开的那样，使用含O. 097mol/L NaHCO3^O. 173mol/L KHC03、0. 090mol/L C6H8O7 · H2O 的水溶液的运动抑制剂形成分散体。只要精细胞暴露于运动抑制剂，它们一般都会保持静止。
当分散体中含有C6H8O7 ·Η20时，KHCO3与NaHCO3间的摩尔比可如上所述。KHCO3与C6H8O7A2O间的摩尔比一般分别等于或大于I : 1，但一般不会超过摩尔比8 I。优选KHCO3与C6H8O7 -H2O间的摩尔比为至少约I. 25 I。还更优选KHCO3与C6H8O7 -H2O间的摩尔比为至少约I. 5 I。还更优选KHCO3与C6H8O7W2O间的摩尔比为至少约I. 75 I。在ー个具体实施方案中，KHCO3与C6H8O7^H2O间的摩尔比为至少约1.78 I。在另一具体实施方案中，KHCO3与C6H8O7 -H2O间的摩尔比为至少约2:1。在再一实施方案中，KHCO3与C6H8O7 -H2O间的摩尔比为至少约3 I。又在另ー实施方案中，KHCO3与C6H8O7^H2O间的摩尔比为至少约4 I。又在另ー实施方案中，KHCO3与C6H8O7 ·Η20_的摩尔比为至少约5 I。又在另ー实施方案中，KHCO3与C6H8O7^H2O间的摩尔比为至少约6 I。又在另ー实施方案中，KHCO3与C6H8O7 -H2O间的摩尔比为至少约7:1。又在另ー实施方案中，KHCO3与C6H8O7 -H2O间的摩尔比为至少约8 : I。在特别优选的实施方案中，如Salisbury&Graves, J. Reprod. Fertil. ,6 351-359(1963)中所公开的那样，使用含O. 097mol/L NaHC03>0. 173mol/L KHCO3、(λ 09OmoI/L C6H8O7 · H2O的水溶液的抑制性缓冲液形成分散体。只要精细胞暴露于运动抑制剂，它们一般都会保持静止。
迄今为止的实验证据还提示，如果将精细胞分散体保存在降低或防止氧气向该分散体扩散的大气中，可以改善精细胞的整体健康和其他重要特征。通过用如ニ氧化碳、氮气或其他惰性气体分压比周围空气增高的气体来代替精子分散体上方的大气，可以达到这一目的。在具体的实施方案中，分散体維持在具有比周围空气高的ニ氧化碳分压的大气下。在优选实施方案中，分散体上方空气的ニ氧化碳分压为至少约O. OOOlatm,但一般小于约5atm大气压。在一个实施方案中，ニ氧化碳分压为约O. 5atm至约2atm大气压；在另ー实施方案中，ニ氧化碳分压为约O. 9atm至约2atm大气压；在另ー实施方案中，ニ氧化碳分压为约O. 95atm至约2atm大气压。在特别优选的实施方案中，分散体上方大气的ニ氧化碳分压为至少O. 9atm ;更优选至少约O. 95atm。
除使用运动抑制剂之外或可替代之的是，可以改变精细胞或分散体的温度以引起精细胞变得不运动。诱导精子不运动性的温度可以被诱导，例如通过降低精细胞或分散体的温度到约0°C至约15°C，优选从约TC至约10°C ;更优选从约2°C至约8V ;还更优选从约3°C至约6V ;甚至更优选为约4°C至约5°C ;更优选约5°C。然而，优选不将精细胞暴露于会对细胞存活力造成实质不良影响或显著影响精细胞结合或摄取标记物能力的温度下。
在另ー实施方案中，可以改变精细胞或精子分散体的温度使其介于约4°C至约50°C范围内；优选从约7°C至约43°C ;更优选从约10°C至约39°C ;还更优选从约15°C至约300C ;且最优选从约17°C至约25°C的温度。在特别优选的实施方案中，精细胞或其周围分散体的温度为约4°C。
在任何时间一旦从源哺乳动物获得精细胞，可以将其暴露于降低的温度从而使其基本不运动。例如，可以在从源哺乳动物收集细胞时、在将细胞与缓冲液混合时、在形成标记混合物时(包括标记过程之前、期间或之后)、或在形成标记细胞的分散体时降低精细胞的温度，由此引起精子不运动性。然而，通常在先于分散体的光学检测之前通过降低温度诱导精子不运动性。
例如，可以在标记细胞之后降低精细胞温度(即，诱导精子不运动性)，从而允许在下文讨论的更优选的温度下进行标记。在优选的实施方案中，可以在标记后和在光学检测细胞之前降低精细胞或周围分散体的温度。
将精细胞暴露于抑制剂、降低的温度或两者的组合诱导精细胞不运动。在ー个实施方案中，例如，运动抑制剂、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的运动性、前向运动性或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的运动性、前向运动性或两者同吋，降低至少60%。优选地，运动抑制剂、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的运动性、前向运动性或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的运动性、前向运动性或两者同时，降低至少70%。更优选地，运动抑制剂、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的运动性、前向运动性或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的运动性、前向运动性或两者同时，降低至少80%。优选地，运动抑制剂、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的运动性、前向运动性或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的运动性、前向运动性或两者同时，降低至少90%。优选地，运动抑制剂、温度的降低或两者的组合可使分散体中精细胞的运动性、前向运动性或两者同时相对于相同物种刚射出精液中精细胞的运动性、前向运动性或两者同吋，降低至少99%。
无论所使用的方法，优选使细胞不运动，从而允许充分的时间进行分散体的光学检测、确定亚群成员细胞的位置和将能量源施用于亚群的成员细胞。如果期望物理地分离被施用的细胞与未施用的细胞，还可以优选在这ー过程步骤中维持精细胞在不运动状态。同样地，如果要冷藏精细胞，可以在冷藏步骤中使其維持在不运动状态(无论在冷藏之前施用的细胞是否与未施用的细胞分离)。在优选的实施方案中，冷藏步骤过程始終保持细胞不运动。
可以通过将细胞与运动性抑制剂分离，将其暴露于空气，升高细胞或细胞分散体的温度(优选至刚射出精液的典型温度)，通过使用生理盐水(Salisbury等人，1963)或诸如TCA缓冲液或PBS的缓冲液稀释，或通过以上任意的组合(其取决于诱导不运动性所用的方法)将不运动细胞恢复到活性状态(即刚射出精液的行为特征)。 一般而言，根据HTM-IVOS精子分析測量，至少约20%、优选至少约50%、更优选至少约60%、还更优选至少约70%、甚至更优选至少约80%、甚至更优选至少约90%、还更优选至少约95%、最优选至少约99%恢复活性状态的细胞(即再活化细胞)具有这样的路径速度、前向性速度或两者同时即其为与运动性抑制剂混合前的精细胞(即刚射出的精细胞)的路径速度、前向性速度或两者同时的至少约50%,优选至少约60%,更优选至少约70%,还更优选至少约80%,甚至更优选至少约90 %,甚至更优选至少约95 %,最优选至少约99 %。
从哺乳动物收集细胞
已知多种收集活精子的方法。这类方法包括，例如，手握法、使用人エ阴道以及电刺激射精。
在收集时，或在其后，可以将收集的精液与适合精子的许多不同缓冲液中的任意一种混合，所述缓冲液为，诸如TCA、HEPES、PBS或在美国专利申请公布号US2005/0003472(其内容在此处被完整地引入作为參考)中公开的任何其它的缓冲液。例如，可以将通常每毫升含有约5亿至约100亿精细胞的牛精液样品直接从源哺乳动物收集至含有缓冲液的容器中以形成精子悬浮液。备选地，可以将精液样品收集至空的容器并随即在收集后的数分钟至数小时之内使之与缓冲液接触以形成精子悬浮液。
备选地，可以收集精细胞并且使之与代替缓冲液或缓冲液之外的运动抑制剂接触，从而形成精子分散体。可以将精细胞直接从动物收集至含有运动抑制剂的容器中以形成精子分散体，或备选地，将其收集至空容器中井随即在收集的数分钟(或甚至数小吋)之内使之与运动抑制剂接触以形成精子分散体。
精子分散体还可以含有一系列其它添加剂以提高精子存活力。例示性的添加剂包括蛋白质源、抗生素、生长因子以及调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。这些添加剂的各种实例是本领域众所周知的，如在，例如美国申请系列号60/557，407和11/092,313的公开(其各自内容在这里被引入作为參考)中所证明。
细胞的标记
可以使用多种不同标记物的任意一种标记精细胞，所述标记物包括结合至细胞外部的标记物(例如荧光标记的抗体)以及跨细胞膜并结合至细胞内容物的标记物(例如，荧光DNA选择性染料)。一般而言，标记方法包括在允许快速和有效结合或摄取标记物的温度或PH下，将精细胞与一定浓度的标记物接触(从而形成标记混合物，有时称为染色混合物)，使时间足够长以获得期望的标记程度而不实质影响细胞的生存力。
精子可以是纯精液形式，或备选地，含有精子的精液衍生物(其通过离心或使用其它方法分离精液为级分而获得)。接着将精细胞与标记物接触或另外混合以形成标记混合物；任选地，该标记物可以是固体或溶液的形式。然而，一般而言，标记物、精细胞或两者同时是在介质，例如缓冲液中。
在一个实施方案中，将精细胞与缓冲液混合以形成精子悬浮液。可以使用适合精子的许多不同缓冲液的任何ー种，诸如TCA、HEPES, PBS或在美国专利申请公布号US2005/0003472中公开的缓冲液。一旦形成精子悬浮液，可将其与标记物源混合以形成标记混合物；任选地，所述标记物可以是固体或液体的形式并且，作为进ー步选择，可以另外地包含任ー种上述缓冲液。
在另ー实施方案中，标记物可与缓冲液相混合形成标记悬浮液并且该标记悬浮液与精子源混合形成标记混合物，所述精子源是纯精液、含有精子的精液衍生物或精子悬浮液的形式。
在优选的实施方案中，使用含有运动性抑制剂的缓冲液形成标记混合物。例如，运动性抑制剂可以包含在用于形成精子悬浮液(其接着与标记物混合)或标记悬浮液(其接着与精子源混合)的缓冲液中以形成标记混合物。在任一事件中，产生含有运动性抑制剂和标记物的精子分散体。
可以通过使用多种标记物的任何ー种，如以前在美国专利号5，135，759和WO02/41906中所述(均在此处引用作为參考)，一种或多种可经UV或可见光激发的DNA选择性染料形成标记混合物。例示性的UV光激发的DNA选择性染料包括Hoechst 33342和Hoechst 33258, 二者均可从Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)商购。例示性的可见光激发的染料包括可从 Molecular Probe, Inc. (Eugene, OR)商购的 SYBR-14,以及 WO 02/41906中所述的双苯甲亚胺-BODIPY 缀合物6- {[3- ((2Z) -2- {[I- ( ニ氟硼烷基)-3，
5-ニ甲基-IH-吡咯-2-基]亚甲基}-2H-吡咯-5-基)丙酰基]氨基}-N-[3-(甲基{3-[({4-[6-(4-甲基哌嗪-I-基)-1H，3’ H_2，5，-双苯并咪唑_2’ -基]苯氧基}こ酰基)氨基]丙基}氨基)丙基]己酰胺(“BBC”)。这些染料中的每ー种都可以单独使用或者组合使用；备选地，也可以单独使用其它细胞通透性的UV和可见光激发的染料或将其与前述染料组合使用，只要所述染料在可进行别处所述分选的浓度下使用时不会对精细胞的存活力产生不良影响至不可接受的程度。
备选地，可使用荧光聚酰胺形成标记混合物，更具体地缀合有荧光标记物或报道分子的聚酰胺。此类标记物在结合于核酸时会发出荧光。连接有荧光标记物或报道分子的聚酰胺的实例包括，如Best等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，100 (21)12063-12068(2003) ;Gygi 等人，Nucleic Acids Res. ,30(13) :2790-2799(2002);美国专利号5，998，140 ;美国专利号6，143,901以及美国专利号6，090，947中公开的那些，其中每ー篇的内容均在此处引入作为參考。
荧光核苷酸序列也可用于标记精细胞。此类核苷酸序列在与含有靶序列或互补序列的核酸杂交时会发出突光，但在非杂交状态时则不会发出突光。此类核苷酸公开见于如美国专利申请公开号2003/0113765(此处引入作为參考)。
性别特异性抗体也可用于标记标记混合物中的精细胞。例如，在该实施方案中，性别特异性抗体可缀合荧光部分(或等价报道分子)。由于抗体结合只存在于带有X染色体 或，备选地，带有Y染色体的细胞上的抗原，根据其荧光(相对于未标记细胞的无荧光)能够选择性地鉴定此类细胞。此外，可以同时使用ー种以上的性别特异性抗体，每种抗体连接不同的荧光部分。从而能根据带有X染色体或Y染色体的细胞间的不同荧光，对它们进行区分。
也可使用发光的颜色选择性纳米晶体标记标记混合物中的精细胞。这些颗粒也称为量子点，正如美国专利号6，322，901和美国专利号6，576，291所述为本领域所公知(均在此处引用作为參考)。这些纳米晶体已被缀合于多种生物材料，包括如肽、抗体、核酸、链霉亲和素及多糖(见如美国专利号6，207，392,6, 423，551,5, 990，479和6，326，144，均在此处引用作为參考)，且已用于检测生物学靶标(见如美国专利号6，207，392和6，247，323，两者均在此处引用作为參考)。
标记混合物中标记物的优选浓度为一系列变量的函数,所述变量包括，例如，标记物是否结合于细胞外部或它是否必须跨细胞膜；细胞对于所选标记物的透性(如果标记物必须跨细胞膜)；标记混合物的温度；进行标记的时间量以及期望的选择性程度。一般而言，优选的标记物浓度足以在适度短的时间内达到细胞的所期望的标记程度，而不会对精子存活力产生实质的不良影响。例如，Hoechst 33342, Hoechst 33258、SYBR-14或BBC在标记混合物中的浓度一般在约O. I μ M至约I. OM之间，优选为从约O. I μ M至约700 μ Μ，更优选为约100 μ M至约200 μ Μ。在特别优选的实施方案中，Hoechst 33342,Hoechst 33258、SYBR-14或BBC在染色混合物中的浓度一般在约400 μ M至约500 μ Μ，最优选为约450 μ Μ。因此，在一种标记条件设置下，Hoechst 33342的浓度优选为约100 μ Μ。在另ー种标记条件设置下，Hoechst 33342的浓度为约150 μ Μ。又在另ー种标记条件设置下，浓度优选为约200 μ M0而在另一种标记条件设置下，Hoechst33342的浓度最优选为约450 μ Μ。
又例如，荧光聚酰胺的浓度(例如美国申请公开号2001/0002314中所述的那些)一般为约O. I μ M至约ImM之间，优选从约I μ M至约ImM，更优选约5 μ M至约100 μ Μ，甚至更优选约 ο μ Μ。
标记混合物一旦形成，可以在一系列温度范围中的任意温度下保存；例如，使用Hoechst 33342或Hoechst 33258标记通常在约4°C至约50°C范围内进行。例如，可以将标记混合物保存干“相对低”的温度下，即温度为约4°C至约30°C ;在该实施方案中，温度优选从约200C至约300C，更优选从约25°C至约30°C，最优选为约28°C。备选地，可将标记混合物保存干“中间”温度范围内，即温度为约30°C至约39°C ;在该实施方案中，温度优选在约34°C至约39°C，更优选为约37°C。此外，还可将标记混合物保存于“相对高”的温度范围内，即温度为约40°C至约50°C;在该实施方案中，温度优选从约40°C至约45°C，更优选从约40°C至约43°C，最优选为约41°C。对于优选温度的选择一般取决于一系列变量，包括如标记物是否结合于细胞外部或它是否必须跨细胞膜、细胞对于所选标记物的透性(如果标记物必须跨细胞膜)、标记混合物中标记物的浓度、进行标记的时间量以及期望的选择性程度。
标记混合物的pH可以保持在任何的pH值范围内。例如，使用Hoechst33342或Hoechst 33258标记一般在约5. O至约9. O的pH范围进行。例如，可使标记混合物保持在 “微酸性”PH下，即从约5. O至约7. O。在该实施方案中，优选pH从约6. O至约7. O,更优选从约6. O至约6. 5，最优选为约6. 2。备选地，还可使标记混合物保持在“微碱性” pH下，SP从约7. O至约9. O。在该实施方案中，优选pH从约7. O至约8. O，更优选从约7. O至约7. 5，而最优选为约7. 3。然而，一般而言，如果在除了约7. O之外的pH形成标记，一旦完成足以进行期望程度的标记所需要的时间，就将标记混合物调节为约7. O的pH。[0058]任选地，标记混合物还含有添加剂以提高精子存活力。例示性的添加剂包括如上文对于细胞样品收集讨论过的抗生素、生长因子或调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。可以据此将这些添加剂加入标记混合物。
精细胞摄取或结合标记混合物中的标记物可以持续足够长的一段时间，以得到所期望程度标记的精细胞的分散体。所述时间一般足以使标记物结合于精细胞或精细胞的DNA，从而能鉴定细胞的亚群成员并确定其在分散体中的位置。优选时间的选择通常取决于一系列变量，包括例如标记物是否结合于细胞外部或它是否必须跨细胞膜、细胞对于所选标记物的透性(如果标记物必须跨细胞膜)、标记混合物中标记物的浓度、标记混合物的温度以及期望的选择性程度。例如，所述时间可以是足以使荧光DNA选择性染料结合于带有X和Y染色体的精细胞DNA的时间，从而能根据两者之间不同的且可测量的荧光强度，将两者分选开来。例如，当使用Hoechst 33342或Hoechst 33258标记时,一般而言,这一标记时间将不超过约160分钟，优选不超过约90分钟，还更优选不超过约60分钟，最优选从约5分钟至约40分钟。
某些标记物，并且特别是某些染料，能够渗透精细胞并特异性结合DNA而不用另外地干预以增加细胞的透性。然而，使用其它的标记物可以期望先于标记前处理精细胞以增加渗透速率而不会不可接受地降低生存力或运动性。可以使用本领域技术人员公知的任何合适的方法。这类方法包括电穿孔、使用促进细胞滲透的溶液(如温和的表面活性剤)或化学休克。其中使用其它的或更严格的技术是所期望的或有利吋，这类处理可以包括使用脂质体或许多本领域技术人员使用将染色剂、染料、基因或载体导入活细胞的技木。这些方法包括，但不限于显微注射(如Gordon等人所用(Proc. Natl. Acad. ScI. USA177 (12)7380-4(1980))，并且自此扩展至兔、绵羊、牛和猪)、DEAE-葡聚糖介导的转移、使用磷酸钙的共沉淀和其它技术，这些技术均为本领域技术人员熟知的。在另ー情况下，可期望离心精子并在另一介质中重悬浮离心的精子(尽管是基于相同或基本相同的缓冲液体系)，以移去可能干扰后期操作步骤的某些组分(其可能在先前被加入精子分散体)。
增加精细胞对标记物的透性的一个特别优选的方法是众所周知的光注射(optoinjection)法，如在美国专利号6，753，161所公开，其内容在此处引用作为參考。一般而言，光注射法是通过使用辐射脉冲接触细胞瞬时地透化细胞的方法。基于细胞照度的检测来照亮、鉴定和定位细胞，并使用足以瞬时透化细胞的辐射脉冲照射细胞。例如，如本发明所应用的，可以使用光注射瞬时透化精细胞从而使结合至细胞内容物的标记物(例如，结合至DNA或RNA的标记物)更容易和有效地进入细胞。因此，例如，可以使用光注射减少使用荧光DNA选择性染料(如Hoechst 33342、Hoechst 33258)或使用荧光聚酰胺充分标记精细胞所需时间。
光注射还可用于在降低的温度下标记细胞。先前，精细胞一般使用，例如荧光DNA选择性染料在超过30°C和甚至40°C的温度下标记(由于更高的温度帮助增加染料摄取)。在这些温度下标记当然是可行的，然而避免将精细胞暴露于较高的温度下(特别是在延长的时间)是有益的。因此，光注射可以用于透化精细胞，由此允许在较低温度下标记细胞而仍然保持或超过通常与更高温度下标记相关的染色效率和速度。
因此，在一个实施方案中，形成含有精细胞、运动性抑制剂和浓度从约ΙΟΟμΜ至约200 μ M的染料的标记混合物，且将该染色混合物于约41°C的温度保持一段时间。在另一个实施方案中，运动性抑制剂于每25ml纯化水中含有O. 204g NaHC03、0. 433g KHCO3和
O.473g C6H8O7 · H2O (NaHCO3O. 097mol/L、KHCO3O. 173mol/L、C6H8O7 · H2O 0. 090mol/L 的水溶液)。
在另ー个实施方案中，形成含有精细胞、运动性抑制剂和浓度从约400μ M至约500 μ M的染料的标记混合物，且将该染色混合物于约41 V的温度保持一段时间。在另ー个实施方案中，染料浓度为450 μ Μ。在另ー个实施方案中，运动性抑制剂于每25ml纯化水中含有 O. 204g NaHCO3、O. 433g KHCO3 和 O. 473g C6H8O7 · H2O (NaHCO3O. 097mol/L、KHCO3O. 173mol/L、C6H8O7 · H2O 0. 090mol/L 的水溶液)。
在另ー个实施方案中，形成含有精细胞、运动性抑制剂和浓度从约100 μ M至约200 μ M染料的标记混合物，且将该染色混合物于约28°C的温度保持一段时间。在另ー个实 施方案中，运动性抑制剂于每25ml纯化水中含有O. 204g NaHCO3^O. 433g KHCO3和O. 473gC6H8O7 · H2O (NaHCO3O. 097mol/L、KHCO3O. 173mol/L、C6H8O7 · H2O 0. 090mol/L 的水溶液)。
在再一个实施方案中，形成含有精细胞、运动性抑制剂和浓度从约400 μ M至约500 μ M的染料的标记混合物，且将该染色混合物于约28°C的温度下保持一段时间。在另ー个实施方案中，染料浓度为450 μ M。在另ー个实施方案中，运动性抑制剂于每25ml纯化水中含有 O. 204g NaHCO3、O. 433g KHCO3 和 O. 473g C6H8O7 · H2O (NaHCO3O. 097mol/L、KHCO3O. 173mol/L、C6H8O7 · H2O 0. 090mol/L 的水溶液)。
标记细胞分散体的形成
一旦形成标记混合物，该标记混合物用于形成标记细胞的分散体，其随即被检测和施用。这类分散体包括标记的精细胞和诱导精子不运动的化学剤。备选地，或另外地，分散体除标记的精细胞之外还可以包含液体，例如如上所述的缓冲液，并且其中细胞或液体的温度诱导精子不运动。
标记的精细胞可以是多种形式的任意ー种。例如，标记的细胞还可以是标记混合物的部分。在这样情况下，标记细胞还可在多余的或未结合的标记物中。或者，标记的细胞可以已经与任何多余的或未标记的标记物分离,例如通过洗漆细胞或通过旋转下来细胞(例如通过离心)，并接着将细胞与未结合的标记物分离。在这类情况下，标记细胞通常与如上文细胞样品的收集中讨论过的缓冲液混合。在任何事件中，分散体中的精细胞被标记从而与一个或多个精细胞结合的标记物的缺少或其数量使能够鉴定分散体中精细胞亚群的遗传、蛋白质组、结构或功能特征。该精细胞可以維持在引起或増加精子不运动性的温度下。
标记的细胞的分散体还可以含有诱导精子不运动性的化学剤，例如，如上讨论过的运动性抑制剂。可以在光学检测分散体之前的任何时间(例如，精细胞标记之前、期间或之后)将该化学剂加入标记混合物或标记细胞。可以将化学剂与标记细胞混合，标记细胞为以上讨论过的多种形式的任意ー种(即，仍然在标记混合物中或从其移出)。在具体的实施方案中，形成的标记混合物包含精细胞和标记物，并随即将标记混合物与诱导精子不运动性的化学剂混合。相对于化学剂备选地，或在此之外，可以如上讨论过的降低标记混合物的温度以弓丨起或増加精子不运动性。
细胞的检测、确定和施用
一旦形成标记细胞的分散体，光学检测该分散体以鉴定作为亚群成员的个体精细胞，确定在分散体中的亚群成员的位置和将能量束传递至分散体内的不同位置以选择性地将能源施用于亚群成员，从而降低被施用细胞的生存力或至少它们的使卵受精的能力而不同时影响分散体中其它位置的精细胞。
这些步骤通常通过设备和以商业上称为LEAP (激光激活的分析和加工)技术平台(Cyntellect, Inc. , San Diego, CA)的方法进行。一般而言，这ー方法需要使用标记物标记细胞以鉴定和定位在细胞混合物或更大群内细胞亚群的个体细胞。接着照亮细胞群，使能够鉴定亚群的个体细胞的位置。继之定位处理激光器使其能够发生能量束以诱导亚群的鉴定细胞的改变。该诱导的改变通常为细胞死亡。这些方法和设备在美国专利号6，534，308,6, 514，722,6, 753，161和6，642，018中被进ー步描述，均在此处引用作为參考。本发明中使用的能源可以是任何来源，当将其以某种剂量用于精细胞时，可降低被施用细胞的生存力，或至少它们使卵受精的能力，而对分散体种其它位置的精细胞具有最小或没有相似的影响。通常，能源是能量束的形式。合适的能源的实例包括激光、平行或聚焦的非激光光、射频能量(RF energy)、加速的颗粒、聚焦的超声能量、电子束或其它辐射束。然而，优选的能量源是激光，由于激光具有在紧凑体积中提供高強度能量和相对有效的能量利用以及最小产热的优势，从而允许向个体细胞施用而不显著地不利影响周围细胞。
可以将细胞置于任何适于对细胞进行光学检测和施用的表面。一般而言，这类表面具有水平的表面(顶部、底部，或两者同吋)，其对于用于光学检测细胞的能源和用于向亚群成员施用的能源是光学上可透过的。这类合适的表面包括，例如玻璃、塑料或其它相关的聚合物，和Pyrex ,并且可以是平的载玻片、培养皿、单孔平板或多孔板的形式。实例在例如美国专利号6，534，308和6，514，722中被讨论。
可以将精细胞的样品分为几个更小的个体样品，例如通过分成许多个体样品用于多孔板。可以富集相同特征的各种样品(例如，在每个孔内)，由此产生各自由于ー种特征而被富集的多个样品。然而，最好可以富集不同特征的各种样品。例如，可以将精细胞样品分为更小的个体样品，并且将每个个体样品置于96孔平板的ー个孔中。接着可以以与其它的每孔样品不同的一种特征富集每孔的单独样品，产生各自以不同的特征富集的96个个体样品。
—旦使用能源向亚群的成员细胞施用，可以通过纯化未被施用的细胞(即没有使用能量施用的精细胞)进ー步富集细胞群。可以通过从分散体移去被施用细胞或未被施用细胞进行未施用细胞的纯化，产生含有由特定特征富集的未施用细胞的亚群。例如，如果该特定特征是带有Y染色体的精细胞，可以纯化未施用的细胞从而其含有至少约85%带有Y染色体的精细胞；优选至少约90%带有Y染色体的精细胞；更优选至少约95%带有Y染色体的精细胞；甚至更优选至少约97%带有Y染色体的精细胞；和最优选至少约99%带有Y染色体的精细胞。备选地，如果该特定的期望特征是带有X染色体的精细胞，可以纯化未施用的细胞从而其含有至少约85 %带有X染色体的精细胞；优选至少约90 %带有X染色体的精细胞；更优选至少约95%带有X染色体的精细胞；甚至更优选至少约97%带有X染色体的精细胞；和最优选至少约99%带有X染色体的精细胞。
可以通过本领域技术人员已知的多种方法的任意一种实现从施用的分散体(即从包含施用细胞和未施用细胞的更大的精细胞群)移去施用细胞或未施用细胞。这类方法包括，例如旋转下整个分散体(例如通过离心)，并接着移去或通过灯芯效应除去含有施用细胞的上清液。另ー方法包括向分散体加入高密度的介质。可以加入分散体的高密度介质包括，例如Pereoll 和Isolate 。一般而言，在高密度分离中，活细胞(即本申请的未施用细胞)能够游动至高密度介质的上层并且可以在其后被从介质上层撇取，而受损细胞或死细胞(即施用细胞)将保持分散在高密度介质内，通常在体相之中。使用这类介质的方法是本领域众所周知的。
最好标记细胞的分散体可以含有使用不同标记物标记的细胞亚群。每种标记物可以鉴定分散体中精细胞亚群的不同的遗传、蛋白质组、结构或功能特征。此外，当结合于精细胞时，可以分别地检测每种标记物，即能够分别地检测不同标记物。例如，标记物可以在不同波长各自发出荧光。
可以向标记混合物或标记细胞的分散体加入不同的标记物。备选地，可以在细胞的检测、測定或施用步骤的任一步骤之后加入不同的标记物。然而，优选在分散体的施用之后加入不同的标记物。例如，一旦已经向精细胞的亚群成员施用，被施用的分散体(包括施用细胞和未施用细胞)或纯化的施用分散体(仅包括未施用细胞)可以被再次标记，但是要使用不同的标记物，并且通常如上文公开的，可以基于与精细胞结合的不同标记物的缺少或数量重复细胞的检测、測定和施用。
一般而言，可以使用不同标记物鉴定未施用细胞的其它遗传、蛋白质组、结构或功能特征，所述特征可以不同于先前鉴定向其递送能量剂量的亚群成员所用的特征(即不同于先前确定是施用或未施用细胞所用的特征)。这提供了进ー步富集已富集的细胞群的途径。
例如，使用荧光DNA选择性染料可以形成标记细胞的分散体。可以接着光学检测该分散体以鉴定带有X染色体的精细胞个体。可以继之确定带有X染色体的精细胞的位置，并接着将能量剂量递送至一个或更多带有X染色体的细胞，由此获得富集的带有Y染色体的活细胞群。其后，可以使用表明顶体完整性的另ー标记物标记施用的分散体(包括施用的(带有X染色体的)和未施用的(带有Y染色体的)细胞)或纯化的被施用分散体(仅包括未施用细胞)，例如藻红蛋白缀合的花生凝集素(PE-PNA)，当其与具有反应或受损顶体的细胞接触时，诱导细胞荧光，特别是顶体的荧光。可以接着进行光学鉴定和确定PE-PNA荧光发生细胞位置的步骤，井向那些细胞施以能量。产生带有Y染色体和具有未反应和未损伤(即完整的)顶体的未被施用细胞的亚群。见，例如Nagy等人，Biol Reprod,68 :1828-1835(2003)。
细胞的冷冻延长(cryoextension)
一旦使用能源向亚群的成员细胞施用之后，整个精细胞群(被施用的和未被施用的细胞)或该群的子集(仅未被施用的细胞)可以被冷却或冷冻以备后用(例如在受精操作中)。在这种情况下，加入冷冻延长剂以最小化冷却或冷冻对存活力或解冻后运动性的影响，对未被施用的精细胞是有益的。
一般而言，冷冻延长剂可包含蛋白质源、冷冻保护剂和运动性抑制剂。若含有蛋白质源，可将其加入以提供细胞支持。蛋白质源可为任何不会干扰未施用精细胞存活力并与运动性抑制剂相容的蛋白质源。常用蛋白质源的实例包括乳(包括热匀浆和脱脂乳)、乳提取物、卵黄、卵黄提取物、大豆蛋白和大豆蛋白提取物。此类蛋白质的使用浓度可为约10%(v/v)至约 30% (v/v)，优选约 10% (v/v)至约 20% (v/v)，更优选约 20% (v/v)。[0086]冷冻延长剂中优选含有冷冻保护剂，以减轻或避免冷冻休克或保持未被施用的精细胞的生育力。本领域已知众多冷冻保护剂。适于与给定的延长剂共同使用的冷冻保护剂可有多种选择，取决于待冷冻精子来源的物种。适宜冷冻保护剂的实例包括如，甘油、ニ甲基亚砜、こニ醇、丙ニ醇、海藻糖、Triladyl 以及它们的组合。若含有冷冻保护剂，则其在冷冻延长剂中的量一般为约1% (v/v)至约15% (v/v)，优选其量为约5% (v/v)至约10%(v/v),更优选其量为约7% (v/v)，最优选量为约6% (v/v) O
此外，冷冻延长剂可以含有如上文细胞样品收集中讨论过的运动性抑制剂。可以据其向冷冻延长剂加入运动性抑制剂。
在ー个具体实施方案中，冷冻延长剂包含运动性抑制剂、水、Triladyl 、卵黄和丙酮酸。而在另ー个实施方案中，冷冻延长剂包含0.09711101/1似!10)3、0.17311101/1 KHC03、
O.090mol/L C6H8O7 · H2O 的水溶液和于每 75ml 水中含有 25g Triladyl 、25g 卵黄和 IOmM
丙酮酸。在另一具体实施方案中，冷冻延长剂包含运动性抑制剂、水、Triladyl 、和卵黄。而在另一具体实施方案中，冷冻延长剂包含O. 097mol/L NaHC03>0. 173mol/L KHCO3>
O.090mol/L C6H8O7 · H2O的水溶液和于每75ml水中含有25g Triladyl 和25g卵黄。
冷冻延长剂中也可任选地含有如上文细胞样品收集中讨论过的抗生素或调节细胞内和/或细胞外氧化/还原反应的组合物。可据此将每种添加剂加入冷冻延长剂中。
整个精子群的冷藏(即经施用分散体的冷藏)使形成具有两个亚群的冷冻分散体，每ー亚群实质上彼此不同。然而，每ー亚群由基本同质的细胞组成。也就是说，每ー亚群由细胞组成，单ー亚群的每ー个体细胞具有与相同亚群中每ー其它细胞共同的特征。在优选的实施方案中，通过纯化分散体在冷藏之前进ー步富集分散体，所述纯化是根据上述方法基于存在或缺少共同的特征进行。
因此，例如，可以使用本方法形成冷冻精子分散体，所述分散体包含被施用的细胞亚群(其中施用的亚群的全部细胞是带有X染色体的细胞)，和未施用的细胞亚群(其中未施用的亚群的全部细胞是带有Y染色体的细胞)。根据本发明的实施方案，未接受能量剂量的细胞(即，未经施用的带有Y染色体的细胞)包含至少约85%的带有Y染色体的精细胞；优选至少约90%带有Y染色体的精细胞；更优选至少约95%带有Y染色体的精细胞；甚至更优选至少约97%带有Y染色体的精细胞；最优选至少约99%带有Y染色体的精细胞。
备选地，可以使用本发明的方法形成冷冻精子分散体，所述分散体包含经施用的细胞亚群(其中施用的亚群的全部细胞是带有Y染色体的细胞)，和未施用的细胞亚群(其 中未施用的亚群的全部细胞是带有X染色体的细胞)。根据本发明的实施方案，未施用的带有X染色体的细胞会包含至少约85%的带有X染色体的精细胞；优选至少约90%带有X染色体的精细胞；更优选至少约95%带有X染色体的精细胞；甚至更优选至少约97%带有X染色体的精细胞；最优选至少约99%带有X染色体的精细胞。
受精
本发明还提供使卵受精或授精雌性哺乳动物的新方法，通常使用该新方法选择性降低在如上所述的细胞分散体中精细胞亚群的生存力。
一旦向标记细胞的分散体施用，可以将经施用的分散体(包含经施用的和未经施用的细胞)用于使雌性哺乳动物受精。可以根据本领域技术人员熟知的多种方法中的任意一种进行受精。这些方法包括，例如，显微注射、人工授精和其它本领域技术人员熟知的方法。例如，可以将包含施用和未施用细胞的经施用分散体、仅包含未施用细胞的纯化的分散体或两者中任意一种的衍生物用于授精雌性哺乳动物(例如通过人工授精)。
备选地，一旦完成标记细胞分散体的施用，可以使用该分散体使卵受精，更具体而言为体外的卵。然后可通过多种本领域技术人员熟知方法中的任意ー种，将受精卵导入雌性哺乳动物的子宮内，例如通过胚胎移植。例如，可以将施用的分散体、纯化的分散体或两者中任意一种的衍生物用于体外卵受精。接着可以将受精卵导入雌性哺乳动物的子宮内。
可以在完成分散体的施用之后不久，例如在约7天之内，优选在约5天之内，更优选在约3天之内，还更优选在约2天之内，和在具体的实施方案中，在完成分散体的施用约I天之内进行雌性哺乳动物受精或卵的体外受精。在这类情况下，通常该分散体在受精雌性哺乳动物或体外受精卵之前可以未经冷冻保藏(即，该分散体是新鲜的或包含新鲜的精细胞)；作为代替它可以已经保持在运动性抑制剂中和/或冷藏于约2°C至约7°C，更优选约3°C至约5°C，和最优选约4°C的温度。备选地，可以冷冻保藏分散体并继之在受精雌性哺乳动物或体外受精卵之前解冻(即，该分散体被冷冻/解冻或包含冷冻/解冻的精细胞)。一般而言，在这类情况下，可以在雌性哺乳动物受精或卵的体外受精之前即刻解冻冷藏的分散体。
上文已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求
定义的发明范围内可对其进行修饰和改变。
权利要求
1.选择性降低精细胞分散体中精细胞亚群使卵受精的能力的方法，该方法包括 a)用DNA选择性荧光染料标记精细胞样品以形成经标记的精细胞的分散体，其中与精细胞结合的DNA选择性荧光染料的数量表明带有X染色体的精细胞和带有Y染色体的精子; b)任选地检测分散体以鉴定个体精细胞为亚群成员； c)递送能量剂量至分散体以选择性降低亚群成员使卵受精的能力；和 d)从分散体除去被施用的细胞或未被施用的细胞。
2.权利要求
I的方法，其中所述DNA选择性荧光染料是Hoechst33342、Hoechst33258或 SYBR-H0
3.权利要求
I的方法，其中能量剂量选自辐射束、激光束、平行的非激光光、聚焦的非激光光和聚焦的超声能。
4.权利要求
I的方法，其中所述方法还包括纯化未接受能量剂量的精细胞。
5.权利要求
4的方法，其中纯化未被施用的细胞包括使分散体与高密度介质接触。
6.权利要求
4的方法，其中纯化未被施用的细胞包括离心分散体并移去被施用的细胞。
7.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中与未接受能量剂量的精细胞的生存力相比，所述能量剂量足以降低亚群成员的生存力。
8.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中所述能量剂量足以引起亚群成员的死亡。
9.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中所述方法还包括在递送能量剂量之后冷藏分散体。
10.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中未接受能量剂量的精细胞包含至少85%的带有X染色体的精细胞。
11.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中未接受能量剂量的精细胞包含至少85%的带有Y染色体的精细胞。
12.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中未接受能量剂量的精细胞包含至少90%的带有X染色体的精细胞。
13.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中未接受能量剂量的精细胞包含至少90%的带有Y染色体的精细胞。
14.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中未接受能量剂量的精细胞包含至少95%的带有X染色体的精细胞。
15.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中未接受能量剂量的精细胞包含至少95%的带有Y染色体的精细胞。
16.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中未接受能量剂量的精细胞包含至少97%的带有X染色体的精细胞。
17.权利要求
1-6中任ー项的方法，其中未接受能量剂量的精细胞包含至少97%的带有Y染色体的精细胞。
专利摘要
本发明公开了不使用物理分选细胞对一种特征选择性富集活精细胞群的方法。在这样富集的群体中含有的细胞得益于未经历分选方法的优势。还公开了利用选择性富集活精细胞群的方法授精雌性哺乳动物的方法以及形成精子分散体的方法。
文档编号C12N5/076GKCN102643780SQ201210128480
公开日2012年8月22日 申请日期2005年7月22日
发明者J·A·格雷厄姆 申请人:英格朗公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan