一种土壤抗生素污染的诊断方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于污染环境修复技术领域，尤其涉及一种土壤抗生素污染的诊断方法。
【背景技术】
[0002] 在二十世纪，抗生素可以说是医药界最伟大的发明之一。抗生素被广泛用于人类、 畜禽业及水产养殖中各种疾病的防治。但绝大部分抗生素不能完全被机体吸收，以原形或 者代谢物形式经由病人和畜禽的粪、尿排入环境，经不同途径对畜类食品、禽类食品、水产 品、水体和土壤造成了污染，进而通过食物链危害人类健康。
[0003] 中国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一，抗生素一方面可以导致器官的损 伤，另一方面可以引起细菌的耐药性增强，形成超级细菌，使人类无药可医，我国每年有8 万人死于滥用抗生素。在众多的抗生素中，四环素类和青霉素类抗生素是在世界范围内应 用最为广泛的抗生素。近年来，四环素和青霉素类抗生素的使用呈上升势头，导致其药物 残留问题日趋严重，排放到环境中的药物及其潜在的影响也引起了越来越多的科学家的关 注。
[0004] 土壤是抗生素等污染物质的最终归宿地，大量抗生素的使用必将造成严重的抗生 素类土壤污染问题。随着抗生素长期暴露于土壤环境中，抗生素对土壤环境中的动植物产 生毒性影响，土壤中的抗生素极易向植物体内富集，并在食物链中经生物富集、浓缩和传 递，对人类健康造成危害。综上，控制和检测抗生素的残留，研宄抗生素污染的生态毒性效 应是非常必要的。
[0005] 欧盟规定的环境中药物安全的限量值为100yg?L'目前，抗生素残留的检测方 法主要包括高效液相色谱法、色谱/质谱联用测定法等，大多数的检测方法具有一定可靠 性和较好的灵敏度，但是这些方法也存在一定的局限性，如费时，操作繁琐，需要昂贵的仪 器，另外还会受到仪器检测限的限制；还有一些快速的检测方法，如微生物抑制法、酶联免 疫法等，这些方法对实验条件要求比较高，试剂容易受到污染；而且这些传统的检测方法只 能定量计算抗生素的浓度，而无法评估抗生素的生物毒性。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种土壤抗生素污染的诊断方法，具有简单、快速、成本低廉的优 点。
[0007] 一种土壤抗生素污染的诊断方法，包括以下步骤：
[0008] (1)将肝细胞接种到一组抗生素浓度呈梯度分布的培养基中培养，培养一段时间 后检测培养基中肝细胞分泌的酶的活性；
[0009] (2)建立培养基中抗生素浓度与所述酶的活性之间的关系曲线；
[0010] (3)将肝细胞接种到含待测土壤浸提液的培养基中培养，培养一段时间后检测相 应酶的活性，根据关系曲线计算得到待测土壤中抗生素的浓度；
[0011] 所述酶为乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶或丙氨酸氨基转移酶。
[0012] 本发明对肝细胞培养基中抗生素浓度与所述酶的活性之间建立关系曲线，再根据 关系曲线计算得到待测土壤中抗生素的浓度，方法简单快速；所述乳酸脱氢酶的活性指示 肝细胞膜的通透性，碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶的活性可以指示肝细胞的功能，本发明 通过检测酶的活性，还可以评估抗生素的生物毒性。
[0013] 本发明中所述肝细胞为人体肝细胞HL-7702,采用人体肝细胞HL-7702的酶的活 性作为检测抗生素的指标，可以评估抗生素对人体的毒性。
[0014] 本发明中所述抗生素为四环素或青霉素，四环素和青霉素的应用范围最为广泛， 更具代表性。
[0015] 本发明步骤（2)中采用线性回归或一元二次方程拟合建立关系曲线，所述关系曲 线为：
【主权项】
1. 一种土壤抗生素污染的诊断方法，包括以下步骤： (1) 将肝细胞接种到一组抗生素浓度呈梯度分布的培养基中培养，培养一段时间后检 测培养基中肝细胞分泌的酶的活性； (2) 建立培养基中抗生素浓度与所述酶的活性之间的关系曲线； (3) 将肝细胞接种到含待测土壤浸提液的培养基中培养，培养一段时间后检测相应酶 的活性，根据关系曲线计算得到待测土壤中抗生素的浓度； 所述酶为乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶或丙氨酸氨基转移酶。
2. 根据权利要求1所述的土壤抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述肝细胞为人 体肝细胞HL-7702。
3. 根据权利要求1所述的土壤抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述抗生素为四 环素或青霉素。
4. 根据权利要求1所述的土壤抗生素污染的诊断方法，其特征在于，采用线性回归或 一元二次方程拟合建立关系曲线。
5. 根据权利要求4所述的土壤抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述关系曲线为： y:= 0. 1258x !+146. 67, R2= 0. 9591,0 ^ y ^ 2500 ； y:= 0. 0002x 2+0. 9604, R2= 0. 8757,0 ^ y ^ 2500 ； y:= 0. 0091x 3+2. 685, R2= 0. 9677,0 ^ y ^ 500 ； y2= 0. 1009x !+69. 717, R2= 0. 8727,0 ^ y 2500 ； y2= 0. 0003x 2+0. 9681, R2= 0. 9135,0 ^ y2^ 2500 ； y2= 0? 0025x 3+3. 1936, R2= 0? 9552,0 彡 y 2彡 2500 ; 71为四环素的浓度，单位为青霉素的浓度，单位为乳酸脱 氢酶的活性，单位为U/L ;x2为碱性磷酸酶的活性，单位为Kim unit/100ml ;x 3为丙氨酸氨 基转移酶的活性，单位为卡门氏单位；R2为相关系数。
6. 根据权利要求1所述的土壤抗生素污染的诊断方法，其特征在于，步骤（1)和（3)中 细胞培养时间为不少于4小时。
7. 根据权利要求1所述的土壤抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述培养基为无 血清DMEM高糖培养基。
8. 根据权利要求1所述的土壤抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述肝细胞的接 种密度为1 X 105?1 X 10 6个/ml。
9. 根据权利要求1所述的土壤抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述肝细胞的培 养条件：温度为37°C，C02体积浓度为5%。
10. 根据权利要求1所述的土壤抗生素污染的诊断方法，其特征在于，所述土壤浸提液 稀释50?100倍。
【专利摘要】本发明公开了一种土壤抗生素污染的诊断方法，包括以下步骤：(1)将肝细胞接种到一组抗生素浓度呈梯度分布的培养基中培养，培养一段时间后检测培养基中肝细胞分泌的酶的活性；(2)建立培养基中抗生素浓度与所述酶的活性之间的关系曲线；(3)将肝细胞接种到含待测土壤浸提液的培养基中培养，培养一段时间后检测相应酶的活性，根据关系曲线计算得到待测土壤中抗生素的浓度；所述酶为乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶或丙氨酸氨基转移酶。本发明具有灵敏、低廉和简便的优点，不仅能检测土壤中抗生素的浓度，又能反映土壤中抗生素的生物毒性。
【IPC分类】C12Q1-42, C12Q1-32, C12Q1-52
【公开号】CN104531835
【申请号】CN201410764095
【发明人】杨肖娥, 刘娣, 卢玲丽, 冯英, 李廷强
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月12日