一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种仿生抗体的制备方法，尤其涉及一种共价型盐酸克伦特罗分子 印迹聚合物仿生抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002] 盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB)是一种肾上腺类神经兴奋剂，临床上曾用于防 治支气管哮喘、慢性支气管炎等病症。CLB是"瘦肉精"的一种，生物利用率高，能够改变动 物体内的代谢途径，促进肌肉和骨骼中蛋白质的合成，加快生长速度，改善胴体品质，增加 瘦肉率。但是，CLB易于在动物体内蓄积，在肺、肝、肾等脏器及肌肉和脂肪组织中的残留量 较大，残留时间较长，且可通过食物链在人体内蓄积，对机体产生毒副作用，主要表现为心 律失常、肌肉震颤、头晕、乏力等，严重的可危及生命。我国和欧盟等多数国家都严禁CLB在 畜禽养殖中应用。
[0003] 分子印迹聚合物仿生抗体是通过分子印迹技术（MIT)制备的对目标分子有特异选 择性的高分子聚合物，是目前代替生物抗体最理想的材料之一。分子印迹聚合物仿生抗体 具有专一识别性、理化稳定性、应用广泛性，在仿生免疫分析、样品前处理、生物传感器及色 谱固定相中具有良好的应用前景。
[0004] 目前，以CLB为目标物的分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法有沉淀聚合方法 (Rongning Liang，Qi Gao，Wei Qin. Chin J Anal Chem, 2012，40(3): 354-358)、溶 胶-凝胶聚合方法（Wei Du,Chunmei Lei, Siruo Zhang, et al. J Pharmaceutical Biomed， 2014，91:160-168)、本体聚合方法（Anders Blomgren, Christine Berggren，Anna Holmberg，et al. J Chromatogr A, 2002, 975:157-164)等，这些制备方法都是以非共价聚 合方式制备仿生抗体，虽然具有较高的吸附容量和吸附速率，但在应用过程中存在模板分 子渗漏及特异性不高的问题。为了克服模板分子的渗漏问题，利用假模板分子代替CLB制 备分子印迹聚合物仿生抗体已被成功制备（Fengxia Qiao, Jingjing Du. J Chromatogr B， 2013,923-924:136-140 ;Hongyuan Yan,Suting Liu,Mengmeng Gao,et al. J Chromatogr A，2013, 1294:11-16)，但是该方法又降低了仿生抗体的特异性，这可能会增加仿生抗体免 疫分析检测过程中假阳性现象的发生。
【发明内容】
[0005] 发明目的 针对现有技术的上述不足，本发明提出了一种新的CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制 备方法，旨在解决现有CLB分子印迹聚合物仿生抗体的特异性低及模板分子渗漏问题。
[0006] 技术方案 本发明是通过以下技术方案来实现的： 一种盐酸克伦特罗分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法，其特征在于：步骤如下： (1)制备盐酸克伦特罗（CLB)衍生物： 将盐酸克伦特罗溶于二氯甲烷溶剂中，加入三乙胺后滴加甲基丙烯酰氯于二氯甲烷溶 液中，混合物室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤反应溶液，分出有机相， 水相用二氯甲烷洗涤2次，合并有机相后用无水硫酸钠干燥，然后用旋转蒸发仪减压除去 有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为淋洗液用硅胶柱提纯得到CLB衍生物； (2)制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体： 取步骤（1)制备的盐酸克伦特罗衍生物溶于甲醇和乙酸乙酯混合溶液中，磁力搅拌至 全部溶解，然后依次加入交联剂和引发剂，待固体全部溶解后吹氮气4~6 min除氧，然后将 反应容器密封置于65~75 °C水浴中聚合45~50 h。聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生 抗体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中干燥过夜。干燥的聚合物仿生抗体用用盐酸与甲 醇的混合溶液（10:1，V: V)超声洗脱72 h，然后再用甲醇-冰乙酸混合溶液索氏提取盐酸克 伦特罗分子，直至无盐酸克伦特罗检出为止。洗脱完毕后的聚合物仿生抗体在真空干燥箱 中干燥后备用。
[0007] 步骤（1)中盐酸克伦特罗与二氯甲烷的摩尔体积比为10 mmol:50~55 mL ;盐酸克 伦特罗与三乙胺的摩尔比为1:3. 5~4 ;盐酸克伦特罗与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:2~2. 5。
[0008] 步骤（1)中淋洗液石油醚与乙酸乙酯的体积比为3:1。
[0009] 步骤（1)中硅胶柱中所用硅胶直径为200~300目。
[0010] 步骤（2)中盐酸克伦特罗衍生物和交联剂的摩尔比为1:2 ;甲醇与冰乙酸的体积 比为9:1~2 ;干燥箱的温度为45~50 °C ;盐酸溶液的摩尔浓度为3 mol/L ; 步骤（2)中聚合物仿生抗体与盐酸-甲醇混合溶液的质量体积比为lg:200mL。
[0011] 步骤（2)中的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯。
[0012] 步骤（2)中的引发剂为偶氮二异丁腈，用量为30~50 mg。
[0013] 优点及效果 本发明具有如下优点及有益效果： 本发明以化学合成的CLB衍生物为功能单体，采用共价聚合技术制备CLB分子印迹聚 合物仿生抗体，避免了非共价法制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体时模板分子与功能单体 比例不确定问题，提高了 CLB分子印迹聚合物仿生抗体的特异性；通过盐酸水解仿生抗体 中的化学键，洗脱CLB分子后，仿生抗体中保留了与CLB分子空间结构高度互补的孔穴结构 和结合位点，吸附时CLB分子又可通过氢键等非共价键结合到仿生抗体中的孔穴结构中， 保证了仿生抗体的传质速度。另外，该方法制备的仿生抗体中的CLB需要通过强酸溶液才 能释放出来，实际应用过程不会出现强酸环境，所以避免了 CLB分子的渗漏问题。
【附图说明】
[0014] 图1为CLB衍生物核磁图。分析结果如下：IH NMR (400 MHz, CDC13) δ 7. 13 (s, 2H), 6.19 - 6.09 (m, 1H), 5.80 (dd, J = 9. 9, 3.9 Hz, 1H), 5.64-5.66 (m, 1H), 5.28 - 5.15 (m, 1H), 5.13 - 4.93 (m, 1H), 4.52 (s, 2H), 4.11 - 3.91 (m, 1H), 3.63 (dd, J= 15.7，3.9 Hz, 1H), 2.02 - 1.89 (m, 6H), 1.51 (s, 9H)。 结果表明CLB衍生物成功制备。
[0015] 图2为CLB分子印迹聚合物仿生抗体（MIP)扫描电镜图。由图可见，CLB分子印迹 聚合物仿生抗体的孔穴结构均匀且直径较小。
[0016] 图3为CLB非印迹聚合物仿生抗体（NIP)扫描电镜图。由图可见，非印迹仿生抗 体的孔穴较大且呈不规则状。
[0017] 图4为CLB分子印迹聚合物仿生抗体吸附动力学（A)及拟二级动力学方程（B)，由 图可知，CLB分子印迹聚合物仿生抗体在20min内可达到吸附平衡，吸附过程符合拟二级动 力学模型。
[0018] 图5为CLB分子印迹聚合物仿生抗体（MIP)和非印迹聚合物仿生抗体（NIP)等温 吸附曲线。
[0019] 图6为CLB分子印迹聚合物仿生抗体和非印迹聚合物仿生抗体吸附CLB和其它四 种结构类似物(特布他林、异丙肾上腺素、氨溴索、沙丁胺醇）的选择性吸附实验结果。结果 表明，合成的CLB分子印迹聚合物仿生抗体对目标分子CLB有较好的选择识别能力。
【具体实施方式】
[0020] 下面参照附图对本发明进行详细的说明： 本发明是一种高特异性CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法，依次以化学合成方 法将甲基丙烯酰氯与CLB分子反应后作为功能单体，以偶氮二异丁腈为引发剂，乙二醇二 甲基丙烯酸酯为交联剂制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体。本发明中，目标物CLB与功能 单体通过共价键结合，降低了 CLB分子印迹聚合物仿生抗体中非特异性位点的数量，提高 了该仿生抗体的特异性。另外，该方法制备的仿生抗体中CLB分子的洗脱是通过强酸（HCl) 及甲醇-冰乙酸混合溶剂实现的，在实际过程中不会出现模板分子渗漏问题，同时CLB分子 印迹聚合物仿生抗体对目标物CLB的吸附是通过氢键等非共价键方式结合的，保证了仿生 抗体对CLB分子的吸附速率。
[0021] 本发明这种CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法，其步骤如下： (1)制备CLB衍生物： 将盐酸克伦特罗溶于二氯甲烷溶剂中，加入三乙胺后滴加甲基丙烯酰氯于二氯甲烷溶 液中，混合物室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤反应溶液，分出有机相， 水相用二氯甲烷洗涤2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，用旋转蒸发仪减压除去有机溶 齐U，残余物以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为淋洗液用硅胶柱提纯得到CLB衍生物。
[0022] (2)制备CLB分子印迹聚合物仿生抗体： 取步骤（1)制备的盐酸克伦特罗衍生物溶于甲醇和乙酸乙酯混合溶液中，磁力搅拌至 全部溶解，然后依次加入交联剂和引发剂，待固体全部溶解后吹氮气4~6 min除氧，然后将 反应容器密封置于65~75°C水浴中聚合45~50 h。聚合反应结束后，用研钵将聚合物仿生抗 体研至颗粒状，然后置于真空干燥箱中干燥过夜。干燥的聚合物仿生抗体用盐酸与甲醇的 混合溶液（l〇:l，V:V，即盐酸与甲醇的体积比为10:1)超声洗脱72 h，然后再用甲醇-冰乙 酸混合溶液索氏提取盐酸克伦特罗分子，直至无盐酸克伦特罗检出为止。洗脱完毕后的聚 合物仿生抗体在真空干燥箱中干燥后备用。
[0023] 上述步骤（1)中盐酸克伦特罗与二氯甲烷的摩尔体积比为10 mmol:50~55 mL ; 盐酸克伦特罗与三乙胺的摩尔比为1:3. 5~4;盐酸克伦特罗与甲基丙烯酰氯的摩尔比为 1:2?2. 5。
[0024] 上述步骤（1)中淋洗液石油醚与乙酸乙酯的体积比为3:1。
[0025] 上述步骤（I)中硅胶柱中所用硅胶直径为200~300目。
[0026] 上述步骤（2)中盐酸克伦特罗衍生物和交联剂的摩尔比为1:2 ;甲醇与冰乙酸的 体积比为9:1~2 ;干燥箱的温度为45~50°C ;盐酸溶液的摩尔浓度为3 mol/L。
[0027] 上述步骤（2)中聚合物仿生抗体与盐酸-甲醇混合溶液的质量体积比为 lg:200mL。
[0028] 上述步骤（2)中交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯。
[0029] 上述步骤（2)中的引发剂为偶氮二异丁腈，用量为30~50 mg。
[0030] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0031] 实施例1 : 一种CLB分子印迹聚合物仿生抗体的制备方法，其步骤如下： (1)制备CLB衍生物： 取10 mmol盐酸克伦特罗溶于50mL二氯甲烷中，向溶液中加入40 mmol三乙胺后，滴 加20 mmol甲基丙烯酰氯，室温反应过夜。反应结束后，用饱和碳酸氢钠溶液洗漆，分出有 机相后，水相用二氯甲烷重复洗2次后，合并分离出的所有有机相，用无水硫酸钠干燥后， 用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，残余物以石油醚-乙酸乙酯（3:1，V:V