一种鉴别鲤鱼品种的分子标记及利用其进行鉴别的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鉴别鲤鱼品种的分子标记及利用其进行鉴别的方法，属于分子标 记技术领域。
【背景技术】
[0002] 鲤鱼是我国最主要的淡水养殖品种之一，养殖品种众多，目前已获得水产新品种 证书的鲤鱼品种就多达20多种。在区分不同鲤鱼品种的时候，往往是根据形态学特征，如 体色或是体长、体高、侧线鳞、鳍条等可数性状和可量性状进行鉴别，但这些表型性状的数 值，在不同的鲤鱼品种中都有部分重叠，以至于无法准确地判别不同品种。
[0003] 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水 平遗传多态性的直接的反映。其中，目标区域扩增多态性（target region amplified polymorphism, TRAP)也叫革E位区域扩增多态性，是一种基于PCR的新型分子标记技术。 TRAP技术是利用生物信息学工具和表达序列标签数据库信息，通过对目标候选基因区域的 PCR扩增，产生围绕目标候选基因序列的多态性标记。是一种与性状相关联的分子标记。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是克服形态学特征无法准确鉴别鲤鱼品种的不足，提供一种TRAP 分子标记及其获得方法，有助于快速、准确鉴别福瑞鲤与其原始亲本一一建鲤和黄河鲤，在 鲤鱼选育、种质资源鉴定、保护和利用中有极大的应用价值。
[0005] 按照本发明提供的技术方案，一种鉴别鲤鱼品种的分子标记，采用的引物对为： 核苷酸序列为5' -3' ；固定引物序列为：5' -GCCGACTTGAAAATGG-3'，随机引物序列为： 5' -GGAACCAAACACATGAAGA-3'。
[0006] 采用所述分子标记进行鲤鱼品种鉴别的方法，步骤为：
[0007] (1)设计TRAP分子标记引物：设计固定引物序列和随机引物序列；
[0008] (2)?0?反应：总体积为15以1^，其中]\%2+1.5臟〇1/1、(1阶1^0.35臟〇1/1、随机引物 6pmol/L、固定引物10pm 〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶1.0U，用灭菌双蒸馏水补足 体积；
[0009] PCR 反应条件为：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 个循环；94°C 45s， 53°C 45s，72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin ;
[0010] (3)电泳：对步骤（3)的所得PCR产物用质量浓度为8. 0%的聚丙烯酰胺凝胶进行 电泳分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果；
[0011] ⑷结果观察：针对特定鲤鱼品种电泳后样品出现电泳条带，用于鲤品种鉴另I」、保 种和分子辅助选择育种。
[0012] 本发明的有益效果：本发明提供的引物对在针对福瑞鲤样本中，扩增出一条 200bp左右的明显特异条带，而原始亲本建鲤和黄河鲤中并无此条带，通过该分子标记可广 泛用于鲤鱼品种鉴别、保种和分子辅助选择育种。
【附图说明】
[0013] 图1是实施例1福瑞鲤的特异TRAP标记示意图（箭头所示）。
[0014] 图2是实施例2福瑞鲤的特异TRAP标记示意图（箭头所示）。
[0015] 图3是实施例3福瑞鲤的特异TRAP标记示意图（箭头所示）。
【具体实施方式】
[0016] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0017] 实施例1
[0018] 福瑞鲤及其原始亲本一一建鲤和黄河鲤均取自中国水产科学研宄院淡水渔业研 宄中心宜兴实验基地，每种鱼随机各取10尾。剪取每尾鱼的鳍条抽提基因组DNA。
[0019] 选择可能与鲤鱼生长性状相关的GH(GenBank accession no. M27000. 1)， GHR(AY741100. 1)，IGF(D83272. 1)，TRH(AB179818. l)and GTH(X56497. 1)基因作为目标候 选基因，设计18个固定引物。针对外显子或内含子的特点，设计了 4个富含GC或AT核心 区的随机引物，依据Hu(2006)文献设计合成。具体如表1所示。
[0020] 以所取基因组DNA为模板，用18个固定引物分别与4个随机引物组合进行PCR扩 增，引物具体如表1所示。
[0021] PCR 反应总体积为 15 yL，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPsO. 35mmol/L、随机引物 6pmol/ U固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，用灭菌双蒸馏水补足体积。 PCR 反应条件为：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 个循环；94°C 45s，53°C 45s， 72°C lmin，35 个循环；72°C lOmin。
[0022] PCR反应结束后，产物用8. 0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染 色后，拍照记录电泳结果。
[0023] 当用固定引物Me 7 (gccgacttgaaaatgg)和随机引物Em l(ggaaccaaacacatgaaga)进行扩增时，在福瑞鲤中均出现一个约200bp的扩增条带，而建 鲤和黄河鲤中没有这一条带。根据这一特异性的TRAP条带标记，将福瑞鲤与原始亲本建 鲤、黄河鲤区分出来，具体如图1所示。
[0024] 实施例2
[0025] 福瑞鲤及其原始亲本之一--建鲤取自中国水产科学研宄院淡水渔业研宄中心 南泉实验基地，另一原始亲本一一黄河鲤均取自河南郑州黄河鲤鱼良种场，每种鱼随机各 取10尾。剪取每尾鱼的鳍条抽提基因组DNA。
[0026] 以所取基因组DNA为模板，用18个固定引物分别与4个随机引物组合进行PCR扩 增，引物具体如表1所示。
[0027] PCR 反应总体积为 15 yL，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPsO. 35mmol/L、随机引物 6pmol/ U固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，用灭菌双蒸馏水补足体积。 PCR 反应条件为：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 个循环；94°C 45s，53°C 45s， 72°C lmin，35 个循环；72°C 10min。
[0028] PCR反应结束后，产物用8. 0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染 色后，拍照记录电泳结果。
[0029] 当用固定引物Me 7 (gccgacttgaaaatgg)和随机引物Em l(ggaaccaaacacatgaaga)进行扩增时，在福瑞鲤中均出现一个约200bp的扩增条带，而建 鲤和黄河鲤中没有这一条带。根据这一特异性的TRAP条带标记，将福瑞鲤与原始亲本建 鲤、黄河鲤区分出来，如图2所示。
[0030] 实施例3
[0031] 福瑞鲤10尾及其原始亲本--建鲤和黄河鲤各7尾均取自中国水产科学研宄院 长江水产研宄所。剪取每尾鱼的鳍条抽提基因组DNA。
[0032] 以所取基因组DNA为模板，用18个固定引物分别与4个随机引物组合进行PCR扩 增，引物具体如表1所示。
[0033] PCR反应总体积为 15 μ 1，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPsO. 35mmol/L、随机引物 6pmol/ U固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶I. 0U，用灭菌双蒸馏水补足体积。 PCR 反应条件为：94°C 4min ;94°C 45s，35°C 45s，72°C lmin，5 个循环；94°C 45s，53°C 45s， 72°C lmin，35 个循环；72°C lOmin。
[0034] PCR反应结束后，产物用8. 0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染法染 色后，拍照记录电泳结果。
[0035] 当用固定引物Me 7 (gccgacttgaaaatgg)和随机引物Em l(ggaaccaaacacatgaaga)进行扩增时，在福瑞鲤中均出现一个约200bp的扩增条带，而建 鲤和黄河鲤中没有这一条带。根据这一特异性的TRAP条带标记，将福瑞鲤与原始亲本建 鲤、黄河鲤区分出来，如图3所示。
[0036] 表1固定引物及随机引物序列
[0037]
[0038]
【主权项】
1. 一种鉴别鲤鱼品种的分子标记，其特征是采用的引物对为：核苷酸序列为5' -3'；固 定引物序列为：5 ' -GCCGACTTGAAAATGG-3 '，随机引物序列为：5 ' -GGAACCAAACACATGAAGA-3 '。2. 采用权利要求1所述分子标记进行鲤鱼品种鉴别的方法，其特征是步骤为： (1) 设计TRAP分子标记引物：设计固定引物序列和随机引物序列； (2) PCR 反应：总体积为 15 y L，其中 Mg2+L 5mmol/L、dNTPs 0. 35mmol/L、随机引物 6pmol/L、固定引物10pm〇l/L、含DNA模板60ng、Taq DNA聚合酶1.0U，用灭菌双蒸馏水补足 体积； PCR 反应条件为：94 °C 4min ;94 °C 45s，35 °C 45s，72 °C lmin，5 个循环；94 °C 45s， 53°C 45s，72°C lmin，35 个循环；72°C IOmin ; (3) 电泳：对步骤（3)的所得PCR产物用质量浓度为8.0%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳 分离，银染法染色后，拍照记录电泳结果； (4) 结果观察：针对特定鲤鱼品种电泳后样品出现电泳条带，用于鲤品种鉴别、保种和 分子辅助选择育种。
【专利摘要】本发明涉及一种鉴别鲤鱼品种的分子标记及利用其进行鉴别的方法，属于分子标记技术领域。其提供一固定引物序列和一随机引物序列，并通过这对引物进行PCR反应，电泳后得到结果。本发明提供的引物对只在福瑞鲤样本中，扩增出一条200bp左右的明显特异条带，而原始亲本建鲤和黄河鲤中并无此条带。可通过分子标记用于鲤鱼品种鉴别、保种和分子辅助选择育种。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104946787
【申请号】CN201510436129
【发明人】董在杰, 曲疆奇, 朱文彬, 王兰梅
【申请人】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月22日