一种芒草白斑病的分子检测方法
【专利说明】-种苦草白斑病的分子检测方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于植物病虫害检疫领域，具体设及一种芒草白斑病的分子检测方法。
【背景技术】 阳00引芒草（ifiscan施W)是禾本科、C4多年生草本植物，由于芒草具有高光和效率、低C〇2排放、富含纤维质等优良特质，被认为是最具潜在价值的生物能源植物。近年来，随着芒 草在生物质能源方面的逐步应用，使大规模生产成为现实。但因其常年无性繁殖，使一些疾 病积累，产量和品质无法得到保证。白斑病是禾本科植物中的常见疾病，在其它禾本科植物 中玉米、水稻和高梁均有白斑病的相关报道，白斑病导致作物减产，危害巨大。因此，提早发 现致病菌病原并提前预防能够减少损失。
【发明内容】
[0004] 本发明发现了泛生菌属（Pantoea)可W感染芒草使芒草患白斑病，本发明的目的 在于提供一种芒草白斑病的分子检测方法。该方法操作简便、快速、准确，为芒草白斑病的 防治、检测提供有效手段。 阳0化]本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种芒草白斑病的分子检测方法，该方法利用聚合酶链式反应（PCR)对芒草中白斑病 进行快速检测，所用引物序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。
[0006] 优选的，所述的芒草白斑病的分子检测方法包括如下步骤： (1)设计一对检测芒草白斑病的特异性引物，序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。
[0007] (2)提取芒草基因组DNA作为PCR的模板。
[0008] (3)配制50μLPCR反应体系：DNA聚合酶（2U/μL)2μレ10XDNA聚合酶Buffer 5yL，20mMMgClz4yL，10mMdNTPs3yL，上下游引物各（20μM)2μL，DNA模板（10ng/ μL) 2μL，(1地2〇 30μL。
[0009] (4)按如下程序进行PCR反应：94°C5min;94°C30s，65°C30s，72°C10s，30 个循 环；72°C5min。
[0010] (5)PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，若凝胶电泳结果有l(K)bp电泳条带， 表明测试样品为白斑病患病植株，判为阳性；若凝胶电泳结果无l(K)bp的电泳条带，表明测 试样品为健康植株，判为阴性。 W11] -对检测芒草白斑病的特异性引物，序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。
[0012]本发明利用PCR高效扩增技术的特异性强及方便快捷的特点，为芒草白斑病致病 菌的检测、防治提供了有效手段。本发明具有W下优点和效果： (1)首次发明芒草白斑病的快速检测方法。
[0013] (2)检测方法简便、灵敏、引物针对性和特异性高而且成本低。
【附图说明】
[0014] 图1是不同样品PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，Μ为DNA Marker,泳道1-7的DNA 模板分别为健康芒草、致病菌感染的芒草、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌、±壤芽抱杆菌、乳酸 菌、假单胞菌的基因组DNA。
【具体实施方式】
[0015]W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均在常 规生化试剂商店购买。
[0016] 实施例1 选取健康芒草植株、泛生菌属感染的芒草植株作为检测样品，并W枯草芽抱杆菌、大肠 杆菌、±壤芽抱杆菌、乳酸菌、假单胞菌等基因组DNA作为对照。
[0017] (1)针对芒草白斑病致病菌泛生菌属的leSrDNA中间部分核屯、核酸序列的特殊位 点设计引物，序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。 阳0化](2)取芒草叶化采用植物DNA提取试剂盒提取芒草的基因组DNA。
[0019] (3)采用鼎国生物技术有限公司的PCR试剂配制50μL PCR反应体系：DNA聚合酶 (2U/μL)2μL，10XDNA聚合酶Buffer5μL，20mMMgCl2 4μL，10mMdNTPs3μL，上下游 引物各（20μ Μ)2μ L，DNA模板（lOng/μ L)2μ L，d地2〇30μ L。
[0020] (4)按如下程序进行PCR反应：94°C5min;94°C30s，65°C30s，72°C10s，30 个循 环；72°C5min。
[0021] (5 )PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1。图1中，M为DNA Marker， 泳道1-7的DNA模板分别为健康芒草、致病菌感染的芒草、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌、±壤芽 抱杆菌、乳酸菌、假单胞菌的基因组DNA。从图中可W看出，只有致病菌感染的芒草扩增出 lOObp左右的条带(泳道2)，检测结果为阳性，健康芒草及其它菌株的检测结果为阴性。由 此可见，本发明的引物针对性和特异性极高，能够快速、精准的检测出染病植株。
[0022] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种芒草白斑病的分子检测方法，其特征在于：所述的分子检测方法为PCR法，所用 引物序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。2. 根据权利要求1所述的芒草白斑病的分子检测方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 设计一对检测芒草白斑病的特异性引物，序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA; (2) 提取芒草基因组DNA作为PCR的模板； (3) 配制50 4 1^?〇?反应体系：21]/^1^0嫩聚合酶2 4 1^10\0嫩聚合酶81^€615 4 1^， 20禮1%(：124 4 1^1〇1111(1犯1^3 4 1^2(^]\1上下游引物各2 4 1^10即/^1^0嫩模板2 4 1^ ddH20 30μL； (4) 按如下程序进行？0?反应：94￡€511^11;941€3〇8,65 1€3〇8,72°(：1〇8,30个循环； 72°C5min； (5) PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，若凝胶电泳结果有100bp条带，表明测试 样品为白斑病患病植株，判为阳性；若凝胶电泳结果无l〇〇bp条带，表明测试样品为健康植 株，判为阴性。3. -对检测芒草白斑病的特异性引物，其特征在于：序列如下： 上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG， 下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。
【专利摘要】本发明公开了一种芒草白斑病的分子检测方法，属于植物病虫害检疫领域。本发明的分子检测方法为PCR法，所用引物为：上游引物：CGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGG，下游引物：TTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCA。通过提取待检植株的基因组DNA进行PCR反应，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，根据是否扩增到目的片段来判定测试样品是否为白斑病患病植株。本发明利用PCR高效扩增技术的特异性强及方便快捷的特点，为芒草白斑病致病菌的检测、防治提供了有效手段。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105368977
【申请号】CN201510967853
【发明人】赵玲玲, 刁英, 胡小虎, 胡中立
【申请人】武汉大学
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2015年12月21日