CD1c在菌阴肺结核诊断中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及CDlc在菌阴肺结核诊断中的应用。
【背景技术】
[0002] 结核至今仍是全球范围内感染率最高的传染病，防控形势十分严峻。快速、敏感诊 断是提高治疗效果、有效控制结核病传播的关键。在全国肺结核患者中，菌阴肺结核患者占 活动性肺结核患者的60%~70%，且多种其他肺部疾病的临床症状和影像学特征难以与结 核病相区别。对菌阴肺结核有效诊断的方法缺乏，往往造成患者诊断延误或误诊。我国虽 已制定诊断的若干标准，但在临床应用中仍存在许多困惑，并未解决有效诊断菌阴肺结核 这一难题。因此，寻找菌阴肺结核诊断新标识、开创新诊断方法已成为当务之急！ 现有肺结核诊断方法可根据检测对象来源于结核菌或机体而分为直接检测与间接检 测。其中，直接检测法依赖于样品中菌含量，对菌阴患者难以确诊；故，针对菌阴肺结核的诊 断应以机体分子为标识，但目前已有的间接检测有多方面局限，无法在临床大规模使用。
[0003] 结核分枝杆菌（妙coAacterii/a? ii/Aerci/Jasis，MTB)属于胞内寄生菌，体液免疫 难以对其发挥作用，抗结核感染的免疫机制是以T细胞为主的细胞免疫。本发明前期发现 MTB下调机体免疫识别分子CD I c的表达水平，从而抑制T细胞免疫应答，逃避免疫系统的监 视。T细胞识别的抗原包括I/II类MHC分子递呈的抗原肽和⑶1分子递呈的脂类抗原，MTB 是脂类抗原含量最高的微生物，故CDl在抗结核免疫中的作用尤其重要。CDl是I类MHC样 非多态性第三类抗原递呈分子，根据基因同源性分为I、II、III类，其中I类⑶1递呈的菌 类抗原均来源于以MTB为代表的分枝杆菌，提示其在宿主与病原性分枝杆菌的相互作用中 占有重要地位。⑶1可激活包括iNKT、γ δ T和α β T在内的多种T细胞，同时介导早期固 有免疫和适应性免疫应答。I类⑶1分子包括⑶IaXDlb和⑶lc，其中⑶Ic因其广泛的分 布和所递呈抗原的独特性，在抗结核免疫中独树一帜。CDlc在脾脏边缘区B细胞、活化B细 胞、以及绝大部分树突状细胞（dendritic cell，DC) DC亚群表面组成性高表达，被认为是 介导抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC)与T细胞相互作用的重要分子。OHc 特异性递呈的MTB抗原为聚酮类脂质抗原mycoketide，仅在致病性分枝杆菌中生成，而在 非致病性分枝杆菌中缺失，表明其与细菌毒力密切相关。综上所述，CDlc在抗结核免疫反应 中发挥重要作用。然而目前，尚未见以外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中⑶Ic表达水平为指标对包括肺结核在内的肺部相关疾病进行诊断的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供CDlc在菌阴肺结核诊断中的应用。
[0005] 本发明所采取的技术方案是： 一种菌阴肺结核诊断试剂盒，该试剂盒含有能够对CDlc的表达量进行定量的试剂。
[0006] 能够对CDlc的表达量进行定量检测的试剂在制备肺结核诊断试剂盒中的应用。
[0007] 进一步的，所述肺结核为菌阴肺结核。
[0008] 进一步的，所述⑶Ic的表达量为⑶Ic mRNA的表达量。
[0009] 本发明的有益效果是： 本发明通过前期的批量筛选，从中筛选获得的CDlc作为菌阴肺结核的诊断标志物，通 过检测CDlc mRNA的表达水平，能够有效区分未感染人群与菌阴肺结核患者。
【附图说明】
[0010] 图1为实时荧光定量PCR检测MTB感染的DC中⑶Ic的表达水平； 图2为实时荧光定量PCR检测菌阴肺结核患者DC中CDlc的表达水平，图中SN-TB表 示菌阴肺结核； 图3为菌阴肺结核患者PBMC中CDlc的表达检测结果；A为健康志愿者与菌阴肺结核 患者（SN-TB)细胞表面表达⑶Ic的PBMC的百分比，B为平均荧光强度检测结果； 图4为实时荧光定量PCR检测菌阴肺结核患者PBMC中⑶Ic的表达； 图5为ROC曲线分析。
【具体实施方式】
[0011] 本发明发现：① MTB感染DC后导致⑶Ic表达下调；②菌阴肺结核患者PBMC来 源的DC中，⑶Ic的表达水平与健康志愿者相比显著下调；③对119例菌阴肺结核患者 PBMC的检测结果也显示，其⑶Ic的表达水平显著低于健康志愿者；受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve,简称 ROC 曲线）分析结果表明，CDlc 有望 成为菌阴肺结核诊断新革巴点。
[0012] 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。
[0013] 实施例1感染MTB的DC中⑶Ic的表达下调 分离健康志愿者的PBMC，免疫磁珠分选⑶14+单核细胞，用GM-CSF和IL-4诱导诱导单 核细胞向DC分化，将所得的DC感染MTB。72h后，实时荧光定量PCR检测DC中⑶Ic的表 达水平。 检测结果如图1所示，从中可以看出，MTB感染后的DC的CDlc的表达水平明显降低， 说明MTB感染抑制了⑶Ic的表达。
[0014] 实施例2菌阴肺结核患者DC中⑶Ic的表达下调 分离菌阴肺结核患者与健康志愿者的PBMC，免疫磁珠分选CDH+单核细胞，用GM-CSF 和IL-4诱导单核细胞向DC分化，72h后，实时荧光定量PCR检测CDlc的表达。
[0015] 检测结果如图2所示，从中可以看出，菌阴肺结核患者DC中⑶Ic的表达水平显著 低于健康志愿者（代〇. 05)。
[0016] 实施例3菌阴肺结核患者PBMC中⑶Ic的表达下调 分离119例菌阴肺结核患者与健康志愿者的PBMC，流式细胞术检测细胞表面CDlc的表 达。
[0017] 检测结果如图3所示，从中可以看出，菌阴肺结核患者细胞表面表达⑶Ic的PBMC 为0. 9%，明显低于健康志愿者（9. 2%)，如图3A所示；平均荧光强度检测结果也显示，菌阴肺 结核患者PBMC中⑶Ic表达的荧光强度显著低于健康志愿者（K0. 001)，如图3B所示；说明 菌阴肺结核患者PBMC中CDlc的表达水平显著低于健康志愿者。
[0018] 实施例4实时荧光定量PCR检测菌阴肺结核患者PBMC中⑶Ic的表达情况 提取菌阴肺结核患者与健康志愿者PBMC的RNA，实时荧光定量PCR检测CDlc mRNA的 表达。
[0019] 检测结果如图4所示，从中可以看出，菌阴肺结核患者PBMC中⑶Ic表达呈现极显 著下调趋势（K0. 001)。
[0020] 实施例5 CDlc作为菌阴肺结核诊断的新靶点 ROC曲线分析结果表明，CDlc可作为菌阴肺结核诊断新靶点（图5,表1)。
[0021] 本发明前期结果研究发现，与健康人相比，⑶Ic分子在结核患者PBMC中表达呈现 极显著下调趋势（代〇. 001)。为了 了解⑶Ic在PBMC的表达变化是否可以用于区分健康人 与结核患者，我们使用ROC曲线分析CDlc在PBMC中的表达变化是否用于结核病的诊断。 根据CDlc在健康人以及结核患者PBMC中的相对表达量，采用统计分析软件，建立横坐标为 1-特异性、纵坐标为灵敏度的ROC曲线。结果显示，ROC曲线下面积AUC (A)=O. 9475,说明 ⑶Ic用于结核病人诊断具有较高的准确性（图5)。ROC曲线中A值意义说明：在A>0. 5的 情况下，A越接近于1，说明诊断效果越好。A在0. 5~0. 7时有较低准确性，在0. 7~0. 9 时有一定准确性，在〇. 9以上时有较高准确性。
[0022] 对累积频数分布表(表1)进行分析发现，当⑶Ic的转录水平Cut-off值(域值)取 1. 059时，约登指数（Youden' S indx，YI)最大，此时检测灵敏度可以达到86. 7%，而特异性 达到95. 2%。将CDlc用于结核病的诊断是可行的，对于提高结核病的诊断率具有重要意义。
[0023] 表1 ROC曲线分析结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限 制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均 应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种菌阴肺结核诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有能够对CDlc的表达量进行 定量的试剂。2. 能够对CDlc的表达量进行定量检测的试剂在制备肺结核诊断试剂盒中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述定量检测的试剂含有为能够实时荧 光定量检测⑶lcmRNA的引物序列。4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肺结核为菌阴肺结核。5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述CDlc的表达量为CDlcmRNA的表达 量。
【专利摘要】本发明公开了CD1c在菌阴肺结核诊断中的应用。本发明发现MTB感染DC后导致CD1c表达下调；菌阴肺结核患者PBMC来源的DC中，CD1c的表达水平与健康志愿者相比显著下调；对119例菌阴肺结核患者PBMC的检测结果也显示，其CD1c的表达水平显著低于健康志愿者；受试者工作特征曲线分析结果表明，CD1c有望成为菌阴肺结核诊断新靶点。通过检测CD1c？mRNA的表达水平，能够有效区分未感染人群与菌阴肺结核患者。
【IPC分类】C12Q1/04, C12R1/01, C12Q1/68
【公开号】CN105400870
【申请号】CN201510766058
【发明人】马骊, 温茜
【申请人】南方医科大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年11月11日