一组鉴别阿胶及其制品中牛源性成分的多肽的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一组鉴别阿胶及其制品中牛源性成分的多肽，以及使用所述多肽通过质谱法鉴定阿胶及其制品中牛源性成分的方法，所述的多肽组中的多肽具有特定的序列结构及特定m/z值(包括特定的母离子和一对子离子)，其序列如SEQ ID NO.1～50所示，所述肽段及其m/z为牛源阿胶特有，在驴源阿胶中未见存在。
【专利说明】
一组鉴别阿胶及其制品中牛源性成分的多肽
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一组鉴别阿胶及其制品中牛源性成分 的多肽及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 阿胶为马科动物驴的皮，经煎煮、浓缩制成的固体胶，原产自山东省东阿县，至今 已有近三千年历史。阿胶是传统的滋补上品、补血圣药，味甘平，入肺、肝、肾经，具有补血止 血、滋阴润燥等功效，药食两用，长期服用可补血养血、美白养颜、抗衰老、抗疲劳、提高免疫 力，适用人群广泛。李时珍著《本草纲目》载："阿胶《本经》上品。弘景曰：'出东阿，故名阿 胶'"。阿胶是中药材中典型的最讲究"地道性"的药材，道地阿胶必汲取东阿之水，得传承人 之奇秘技艺炼制而成。道地阿胶表面平整，无油气孔，质硬而脆，断面光亮细腻，碎片对光照 视呈棕色半透明状，李时珍赞其〃黄透如琥珀色，光黑如璧漆"。
[0003] 早在1996年就曾曝光过假阿胶事件。时隔多年之后，阿胶造假不仅没有得到遏制， 而且越演越烈。这些不法企业利用牛皮、马皮下脚料等劣质材料冒充驴皮制作伪劣阿胶，并 以次充好向市场销售。
[0004] 导致阿胶造假事件屡禁不止的一部分原因是缺少鉴定的技术支持，动物皮经过熬 制溶解之后，破坏了本身的特性，很难鉴别出动物皮的来源。目前国家也没有有效鉴别阿胶 成分的方法，只能靠从生产源头进行控制，以上情况导致了许多不法企业钻空子。
[0005] 迫切需要一种高效准确鉴定阿胶及其制品真伪的方法。随着代谢组学技术的发 展，利用肽组学直接鉴定动物源成分成为可能。
【发明内容】
[0006] 本发明对阿胶和牛皮胶中的多肽进行了研究，建立了从多肽水平对阿胶及其制品 中牛源性成分进行鉴别的技术，填补了国内外阿胶及其制品鉴别的空白。
[0007] 本发明首先涉及一组用于单独或组合检测阿胶及其制品中牛源性成分的多肽，所 述的阿胶制品包括但不限于阿胶糕、阿胶膏、阿胶浆、阿胶口服液、阿胶糖、阿胶补血颗粒， 所述的多妝的序列为：
[0008] SEQ ID N0.1：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
[0009] SEQ ID N0.2：GPPGPQGPR；
[0010] SEQ ID N0.3：PGEVGPPGPPGPAGEK；
[0011] SEQ ID N0.4：NGLPGGPGLR；
[0012] SEQ ID N0.5：DGASGHPGPIGPPGPR；
[0013] SEQ ID N0.6：GDGGPPGATGFPGAAGR；
[0014] SEQ ID N0.7：IGQPGAVGPAGIR；
[0015] SEQ ID N0.8：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
[0016] SEQ ID N0.9：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0017] SEQ ID N0.10：GSTGEIGPAGPPGPPGLR；
[0018] SEQ ID NO.IKDIGSPGR;
[0019] SEQ ID N0.12：GEAGSPGIAGPK；
[0020] SEQ ID N0.13：GEPGPAGAVGPAGAVGPR；
[0021] SEQ ID N0.14：GETGTAGDAGPIGPVGAR；
[0022] SEQ ID NO.15：GETGMAGAVGPAGAVGPR；
[0023] SEQ ID NO.16：GGPGPAGPR；
[0024] SEQ ID NO.17：IGQPGAVGPAGIR；
[0025] SEQ ID NO.18：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0026] SEQ ID NO.19：TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK；
[0027] SEQ ID N0.20：SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR；
[0028] SEQ ID NO.21：GDGGPPGATGFPGAAGR；
[0029] SEQ ID N0.22：VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK；
[0030] SEQ ID N0.23：NGLPGGPGLR；
[0031] SEQ ID N0.24：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0032] SEQ ID N0.25：GIPGPVGAAGATGAR；
[0033] SEQ ID N0.26：GEAGPAGPAGPAGPR；
[0034] SEQ ID NO.27：IGYAVGPAAVLDAAR；
[0035] SEQ ID N0.28：GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR；
[0036] SEQ ID N0.29：AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK；
[0037] SEQ ID N0.30：AGPPGPPGPAGK；
[0038] SEQ ID NO.31：GEPGPAGLPGPPGER；
[0039] SEQ ID N0.32：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
[0040] SEQ ID N0.33：GETGHAGPAGPIGPVGAR；
[0041] SEQ ID N0.34：GPPGSAGAPGK；
[0042] SEQ ID N0.35：GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR；
[0043] SEQ ID N0.36：GETGPAGPAGPIGPVGAR；
[0044] SEQ ID N0.37：SGETGASGPPGFVGEK；
[0045] SEQ ID N0.38：GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR；
[0046] SEQ ID N0.39：GPPGAGGPPGPR；
[0047] SEQ ID NO.40：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
[0048] SEQ ID N0.41：DGASGHPGPIGPPGPR；
[0049] SEQ ID N0.42：GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER；
[0050] SEQ ID N0.43：GPPGESGAAGPTGPIGSR；
[0051] SEQ ID N0.44：GPPGAGGPPGPR；
[0052] SEQ ID N0.45：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
[0053] SEQ ID N0.46：GESGAPGVPGIAGPR；
[0054] SEQ ID N0.47：GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR；
[0055] SEQ ID NO.48：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
[0056] SEQ ID N0.49：PGEVGPPGPPGPAGEK；
[0057] SEQ ID N0.50:GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
[0058] 其m/z分别为：
[0059] 肽段 1:694.7;
[0060] 肽段 2:440.2;
[0061] 肽段 3:737.9;
[0062] 肽段4:477.8;
[0063] 肽段 5:495.6;
[0064] 肽段6:729.3;
[0065] 肽段7:596.8;
[0066] 肽段8:565.3;
[0067] 肽段 9:611.6;
[0068] 肽段 10:816.9;
[0069] 肽段11:387.7;
[0070] 肽段 12:528.8;
[0071] 肽段 13:511.6;
[0072] 肽段 14:791.9;
[0073] 肽段 15:777.9;
[0074] 肽段 16:391.2;
[0075] 肽段 17:604.8;
[0076] 肽段 18:908.9;
[0077] 肽段 19:923.5;
[0078] 肽段 20:659.3;
[0079] 肽段 21:737.3;
[0080] 肽段 22:605.3;
[0081] 肽段 23:485.7;
[0082] 肽段 24:601.0;
[0083] 肽段 25:634.3;
[0084] 肽段 26:631.3;
[0085] 肽段 27:722.4;
[0086] 肽段 28:1066.1;
[0087] 肽段 29:879.0;
[0088] 肽段 30:517.8;
[0089] 肽段 31:718.3;
[0090] 肽段 32:705.4;
[0091] 肽段 33:791.9;
[0092] 肽段 34:464.3;
[0093] 肽段 35:711.0;
[0094] 肽段 36:780.9;
[0095] 肽段 37:746.9;
[0096] 肽段 38:700.0;
[0097] 肽段 39:516.8;
[0098] 肽段40:1169.1;
[0099] 肽段41:500.9;
[0100] 肽段42:727.3;
[0101] 肽段43:790.9;
[0102] 肽段 44:516.8;
[0103] 肽段45:570.6;
[0104] 肽段46:677.3;
[0105] 肽段47:691.7;
[0106] 肽段48:779.7;
[0107] 肽段49:745.9;
[0108] 肽段 50:824.9。
[0109] 50条多肽对应的母离子、子离子见下表1，
[0110] 表1牛源性多肽序列及其对应的母离子、子离子
[0111]
[0112]
[0113]
[0114] 本发明所涉及前处理方法包括如下步骤：
[0115] (1)对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肽滤液：
[0116] (2)通过质谱法检测待测样本的多肽成分，分析样本中的动物皮来源成分。
[0117] 所述的质谱前处理步骤如下：
[0118] (1)将待测样品均质成粉末状态，称取〇. lg~〇. 5g阿胶样品或1.0-2.0g阿胶制品， 加入1 %NH4HC〇3溶液，超声处理10~30min使样品完全溶解，定容至50mL;
[0119] (2)溶液过 0·22μπι 滤膜；
[0120] (3)取 10 ~20yLTrypsin 酶溶液（1μg/μL 的 Trypsin 酶溶液）加入到 100yL ~200yL 上 述滤液中，37°C酶解16-18小时，待上机检测。
[0121] 本发明还涉及两种检测阿胶及其制品的质谱方法，所述的质谱法检测为，
[0122] 采用AB SCIEXTnpl:eTQF?5600质谱检测，
[0123] 流动相A: 0.05~0.2 %甲酸-乙腈溶液，流动相B: 0.05~0.2 %甲酸-水，
[0124] 流速:0· 1~0.5mL/min，
[0125] T0F扫描范围：100-3000Da，
[0126] 正离子反应模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0127] 采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测，
[0128] 流动相A: 0.05~0.2%甲酸-乙腈，流动相B: 0.05~0.2%甲酸-水，
[0129] 流速:0· 1~0.5mL/min，
[0130] 电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式:MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温 度:475°C;鞘气压力:40;辅助气压力:6。
[0131]所述的分析样本中的牛源性成分为，将待测样品的质谱结果对比SEQ ID NO. 1~ 50的各条特异性多肽的质谱谱图，出现SEQ ID NO. 1~50的各条特异性多肽的质谱检测谱 图时，即可判断该组织样本存在牛源性成分。
【附图说明】
[0132] 图 1，GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR 色谱图
[0133] 图 2，GPPGPQGPR 色谱图
[0134] 图 3，PGEVGPPGPPGPAGEK 色谱图
[0135] 图4，NGLPGGPGLR 色谱图
[0136] 图 5，DGASGHPGPIGPPGPR 色谱图
[0137] 图 6，GDGGPPGATGFPGAAGR 色谱图
[0138] 图7，IGQPGAVGPAGIR 色谱图
[0139] 图 8，GVAGEPGRNGLPGGPGLR 色谱图
[0140] 图 9，GPPGPMGPPGLAGPPGESGR 色谱图
[0141] 图 10，GSTGEIGPAGPPGPPGLR 色谱图
[0142] 图 11，GDIGSPGR 色谱图
[0143] 图 12，GEAGSPGIAGPK 色谱图
[0144] 图 13，GEPGPAGAVGPAGAVGPR 色谱图
[0145] 图 14，GETGTAGDAGPIGPVGAR 色谱图
[0146] 图 15，GETGMAGAVGPAGAVGPR 色谱图
[0147] 图 16，GGPGPAGPR 色谱图
[0148] 图 17，IGQPGAVGPAGIR 色谱图
[0149] 图 18，GPPGPMGPPGLAGPPGESGR 色谱图
[0150] 图 19，TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK色谱图
[0151] 图 20，SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR 色谱图
[0152] 图 21，GDGGPPGATGFPGAAGR 色谱图
[0153] 图 22，VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK 色谱图
[0154] 图 23，NGLPGGPGLR 色谱图
[0155] 图 24，GPPGPMGPPGLAGPPGESGR色谱图
[0156] 图 25，GIPGPVGAAGATGAR 色谱图
[0157] 图 26，GEAGPAGPAGPAGPR 色谱图
[0158] 图 27，IGYAVGPAAVLDAAR 色谱图
[0159] 图 28，GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR 色谱图
[0160] 图 29，AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK 色谱图
[0161] 图 30，AGPPGPPGPAGK 色谱图
[0162] 图 31，GEPGPAGLPGPPGER 色谱图
[0163] 图 32，GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR 色谱图
[0164] 图 33，GETGHAGPAGPIGPVGAR 色谱图
[0165] 图 34，GPPGSAGAPGK 色谱图
[0166] 图 35，GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR 色谱图
[0167] 图 36，GETGPAGPAGPIGPVGAR色谱图
[0168] 图 37，SGETGASGPPGFVGEK 色谱图
[0169] 图 38，GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR色谱图
[0170] 图 39，GPPGAGGPPGPR 色谱图
[0171] 图 40，GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK 色谱图
[0172] 图 41，DGASGHPGPIGPPGPR 色谱图
[0173] 图 42，GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER 色谱图
[0174] 图 43，GPPGESGAAGPTGPIGSR 色谱图
[0175] 图 44，GPPGAGGPPGPR 色谱图
[0176] 图 45，GVAGEPGRNGLPGGPGLR 色谱图
[0177] 图 46，GESGAPGVPGIAGPR 色谱图
[0178] 图 47，GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR 色谱图
[0179] 图 48，GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK 色谱图
[0180] 图 49，PGEVGPPGPPGPAGEK 色谱图
[0181] 图 50，GSTGEIGPAGPPGPPGLR 色谱图
[0182] 图51，在纯品驴阿胶胶原中检测SEQ ID NO. 1~50所示多肽的色谱特征图 图52,样品1的检测结果图 图53,样品2的检测结果图 图54,驴阿胶对照品检测结果图
【具体实施方式】
[0183] 实施例1，筛选牛阿胶胶原特异性多肽
[0184] 通过质谱分析纯品牛胶原样本和驴胶原样本，利用ProteinPilot软件对质谱结果 进行检索比对分析，从而确定最优选的牛胶原专属多肽序列。
[0185] 首先，对选取的纯品胶原样本进行质谱分析，步骤包括：
[0186] ( - )样本前处理步骤：
[0187] (1)称取0. lg~0.5g均质成粉末状态的纯品样品，加入1 %NH4HC03溶液，超声处理 10~30min使样品完全溶解，定容至50mL;
[0188] (2)溶液过 0·22μπι 滤膜；
[0189] (3)取 10 ~20yLTrypsin 酶溶液（1μg/μL 的 Trypsin 酶溶液）加入到 100yL ~200yL 上 述滤液中，37°C酶解16-18小时，待上机检测。
[0190] (二)上机检测，
[0191] (1)采用AB SCIEXTripieTOF?5600质谱检测方法如下，
[0192] 流动相A: 0.05~0.2 %甲酸-乙腈溶液，流动相B: 0.05~0.2 %甲酸-水，
[0193] 流速:0· 1~0.5mL/min，
[0194] T0F扫描范围：100-3000Da，
[0195] 正离子反应模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0196] (2)采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测方法如下，
[0197] 流动相A: 0.05~0.2%甲酸-乙腈，流动相B: 0.05~0.2%甲酸-水，
[0198] 流速:0· 1~0.5mL/min，
[0199] 电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式:MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温 度:475°C;鞘气压力:40;辅助气压力:6。
[0200] 其次，依据纯品胶原样本的质谱结果，利用ProteinPilot软件对质谱结果进行检 索比对分析，筛选得到在牛胶原中确实存在的专属多肽组，组中的各条多肽序列信息如下：
[0201] SEQ ID N0.1：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
[0202] SEQ ID NO.2：GPPGPQGPR；
[0203] SEQ ID NO.3：PGEVGPPGPPGPAGEK；
[0204] SEQ ID NO.4：NGLPGGPGLR；
[0205] SEQ ID N0.5：DGASGHPGPIGPPGPR；
[0206] SEQ ID N0.6：GDGGPPGATGFPGAAGR；
[0207] SEQ ID NO.7：IGQPGAVGPAGIR；
[0208] SEQ ID NO.8：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
[0209] SEQ ID N0.9：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0210] SEQ ID N0.10：GSTGEIGPAGPPGPPGLR；
[0211] SEQ ID N0.11：GDIGSPGR；
[0212] SEQ ID NO.12：GEAGSPGIAGPK；
[0213] SEQ ID NO.13：GEPGPAGAVGPAGAVGPR；
[0214] SEQ ID NO.14：GETGTAGDAGPIGPVGAR；
[0215] SEQ ID NO.15：GETGMAGAVGPAGAVGPR；
[0216] SEQ ID N0.16：GGPGPAGPR；
[0217] SEQ ID NO.17：IGQPGAVGPAGIR；
[0218] SEQ ID NO.18：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0219] SEQ ID NO.19：TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK；
[0220] SEQ ID N0.20：SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR；
[0221] SEQ ID NO.21：GDGGPPGATGFPGAAGR；
[0222] SEQ ID N0.22：VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK；
[0223] SEQ ID NO.23：NGLPGGPGLR；
[0224] SEQ ID NO.24：GPPGPMGPPGLAGPPGESGR；
[0225] SEQ ID N0.25：GIPGPVGAAGATGAR；
[0226] SEQ ID N0.26：GEAGPAGPAGPAGPR；
[0227] SEQ ID NO.27：IGYAVGPAAVLDAAR；
[0228] SEQ ID N0.28：GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR；
[0229] SEQ ID N0.29：AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK；
[0230] SEQ ID N0.30：AGPPGPPGPAGK；
[0231] SEQ ID NO.31：GEPGPAGLPGPPGER；
[0232] SEQ ID N0.32：GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR；
[0233] SEQ ID N0.33：GETGHAGPAGPIGPVGAR；
[0234] SEQ ID NO.34：GPPGSAGAPGK；
[0235] SEQ ID N0.35：GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR；
[0236] SEQ ID N0.36：GETGPAGPAGPIGPVGAR；
[0237] SEQ ID NO.37：SGETGASGPPGFVGEK；
[0238] SEQ ID N0.38：GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR；
[0239] SEQ ID N0.39：GPPGAGGPPGPR；
[0240] SEQ ID NO.40：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
[0241] SEQ ID N0.41：DGASGHPGPIGPPGPR；
[0242] SEQ ID N0.42：GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER；
[0243] SEQ ID N0.43：GPPGESGAAGPTGPIGSR；
[0244] SEQ ID NO.44：GPPGAGGPPGPR；
[0245] SEQ ID N0.45：GVAGEPGRNGLPGGPGLR；
[0246] SEQ ID N0.46：GESGAPGVPGIAGPR；
[0247] SEQ ID N0.47：GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR；
[0248] SEQ ID NO.48：GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK；
[0249] SEQ ID NO.49：PGEVGPPGPPGPAGEK；
[0250] SEQ ID N0.50:GSTGEIGPAGPPGPPGLR。
[0251] 上述50条多肽的质谱谱图和m/z的数值如下：
[0252] 图1是多肽64?6?〇6??64?6?1^1461^六1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为694.7。
[0253] 图2是多肽6??6?〇6?1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为440.2。
[0254] 图3是多肽PGEVGPPGPPGPAGEK在牛胶原中的色谱图，其m/z为737.9。
[0255] 图4是多肽呢1^66?61^在牛胶原中的色谱图，其111/2为477.8。
[0256] 图5是多肽06六36即6?16??6?1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为495.6。
[0257] 图6是多肽6066??6416??64六61?在牛胶原中的色谱图，其111/2为729.3。
[0258] 图7是多肽16〇?64￥6?六611?在牛胶原中的色谱图，其111/2为596.8。
[0259] 图8是多肽GVAGEPGRNGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为565.3。
[0260] 图9是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为611.6。
[0261] 图10是多肽GSTGEIGPAGPPGPPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为816.9。
[0262] 图11是多肽⑶IGSPGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为387.7。
[0263] 图12是多肽GEAGSPGIAGPK在牛胶原中的色谱图，其m/z为528.8。
[0264] 图13是多肽GEPGPAGAVGPAGAVGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为511.6。
[0265] 图14是多肽GETGTAGDAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为791.9。
[0266] 图15是多肽GETGMAGAVGPAGAVGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为777.9。
[0267] 图16是多肽66?6?六6?1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为391.2。
[0268] 图17是多肽16〇?64￥6?六611?在牛胶原中的色谱图，其111/2为604.8。
[0269] 图18是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为908.9。
[0270] 图19是多肽了60?6?36136??6??6?六61(在牛胶原中的色谱图，其111/2为923.5。
[0271] 图20是多肽5601^^了6?46?46?16?￥641?在牛胶原中的色谱图，其111/2为659.3。
[0272] 图21是多肽6066??64了6??64六61?在牛胶原中的色谱图，其111/2为737.3。
[0273] 图22是多肽￥6??6?56熟6??6??6?六61(在牛胶原中的色谱图，其111/2为605.3。
[0274] 图23是多肽呢1^66?61^在牛胶原中的色谱图，其111/2为485.7。
[0275] 图24是多肽GPPGPMGPPGLAGPPGESGR在牛胶原中的色谱图，其m/z为601.0。
[0276] 图25是多肽61?6?￥64464了6六1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为634.3。
[0277] 图26是多肽GEAGPAGPAGPAGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为631.3。
[0278] 图27是多肽16￥4￥6?44￥1^六1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为722.4。
[0279] 图28是多肽GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为1066.1。
[0280] 图29是多肽AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为879.0。
[0281] 图30是多肽六6??6??6?六61(在牛胶原中的色谱图，其111/2为517.8。
[0282] 图31是多肽GEPGPAGLPGPPGER在牛胶原中的色谱图，其m/z为718.3。
[0283] 图32是多肽64?6?06??64?6?1^1461^六1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为705.4。
[0284] 图33是多肽GETGHAGPAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为791.9。
[0285] 图34是多肽6??6346六?61(在牛胶原中的色谱图，其111/2为464.3。
[0286] 图35是多肽GLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为711.0。
[0287] 图36是多肽GETGPAGPAGPIGPVGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为780.9。
[0288] 图37是多肽SGETGASGPPGFVGEK在牛胶原中的色谱图，其m/z为746.9。
[0289] 图38是多肽GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR在牛胶原中的色谱图，其m/z为700.0。
[0290] 图39是多肽6??6六66??6?1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为516.8。
[0291] 图40是多肽GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为1169.1。
[0292] 图41是多肽06436即6?16??6?1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为500.9。
[0293] 图42是多肽GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER在牛胶原中的色谱图，其m/z为727.3。
[0294] 图43是多肽GPPGESGAAGPTGPIGSR在牛胶原中的色谱图，其m/z为790.9。
[0295] 图44是多肽6??6六66??6?1?在牛胶原中的色谱图，其111/2为516.8。
[0296] 图45是多肽GVAGEPGRNGLPGGPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为570.6。
[0297] 图46是多肽GESGAPGVPGIAGPR在牛胶原中的色谱图，其m/z为677.3。
[0298] 图47是多肽GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR在牛胶原中的色谱图，其m/z为691.7。
[0299] 图48是多肽GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK在牛胶原中的色谱图，其m/z为779.7。 [0300] 图49是多肽PGEVGPPGPPGPAGEK在牛胶原中的色谱图，其m/z为745.9。
[0301] 图50是多肽GSTGEIGPAGPPGPPGLR在牛胶原中的色谱图，其m/z为824.9。
[0302]最后，用相同的方法处理并检测驴胶原样本，质谱检测结果进行匹配，结果显示， SEQ ID NO. 1~50所示的各条多肽样本，在驴胶原中不存在。
[0303]图51是在驴胶原中检测上述多肽SEQ ID NO. 1~50的色谱特征图，可见谱图中未 检出SEQ ID NO. 1~50所述的色谱峰。
[0304]实施例2,检测不特定阿胶样本，判断是否为牛胶原冒充产品
[0305]对某市公安局送检的动物皮熬制的阿胶及其制品样本及市售阿胶产品进行质谱 分析，确定是否为纯品驴胶原阿胶。
[0306]对待测样品的处理和检测方法同实施例1中的处理和检测方法 [0307]步骤(一)样本前处理步骤：
[0308] (1)将待测样品均质成粉末状态，称取0.1的阿胶样品或称取2.0g阿胶制品，加入 1 %NH4HC〇3溶液，超声处理10-30min使样品完全溶解，定容至50mL;
[0309] (2)溶液过 0·22μπι 滤膜；
[0310] (3)取lOyLTrypsin酶溶液（1μg/μL的Trypsin酶溶液）加入到100yL上述滤液中，37 °C酶解16-18小时，待上机检测。
[0311]步骤(二)上机检测，
[0312] 采用AB SCIEXTripteT〇F#5600质谱检测，
[0313] 流动相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流动相B: 0.1 %甲酸-水，
[0314] 流速:0.25mL/min，
[0315] T0F扫描范围：350-1500Da，
[0316] 正离子反应模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100， CE：10〇
[0317]采用AB SCIEX三重四级杆质谱检测，
[0318] 流动相A: 0.1 %甲酸-乙腈，流动相B: 0.1 %甲酸-水，
[0319] 流速:0.3mL/min，
[0320] 电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式:MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管温 度:475°C;鞘气压力:40;辅助气压力:6。
[0321] 检测结果对比实施例1中的各条牛胶原特异性多肽的质谱谱图，出现实施例1所述 质谱检测谱图时，即可判断该组织样本含有牛源性成分。
[0322] 经检测:某市公安局送检的样品中，
[0323] 样品1为仅检出牛源性成分，未检出驴源性成分：
[0324] 选取实施例1中的两条牛胶原多肽和已知两条驴胶原特异性多肽作为参考，相同 的检测条件下，样品1中仅检出选取的两条牛胶原多肽的色谱峰(见图52左上、右上），未见 驴胶原特异性多肽色谱峰(见图52左下、右下）；
[0325] 样品2既检出驴源性成分也检出牛源性成分：
[0326] 选取实施例1中的两条牛胶原多肽和已知两条驴胶原特异性多肽作为参考，相同 的检测条件下，样品2中既检出选取的两条牛胶原多肽的色谱峰（见图53左上、右上），也可 见驴胶原特异性多肽色谱峰(见图53左下、右下）；
[0327] 对照品东阿阿胶出产的桃花姬制品仅检出驴源性成分：
[0328] 选取实施例1中的两条牛胶原多肽和已知两条驴胶原特异性多肽作为参考，相同 的检测条件下，对照中未检出选取的两条牛胶原多肽的色谱峰(见图54左上、右上），仅检出 驴胶原特异性多肽色谱峰(见图54左下、右下）；
[0329]最后需要说明的是，以上实施例仅用作帮助本领域技术人员理解本发明的实质， 不用作的本发明保护范围的限定。
【主权项】
1. 一组用于单独或任意组合检测阿胶及其制品中牛源性成分的多肤，所述的阿胶制品 包括但不限于阿胶糕、阿胶膏、阿胶浆、阿胶口服液、阿胶糖、阿胶补血颗粒，所述的多肤的 序列为： 肤段 1:沈Q ID N0.1:GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR; 肤段2:沈Q ID N0.2:GPPGPQGPR; 肤段3:沈Q ID N0.3:PGEVGPPGPPGPAGEK; 肤段4:沈Q ID N0.4:NGLPGGPGLR; 肤段5:沈Q ID N0.5:DGASGHPGPIGPPGPR; 肤段6:沈Q ID N0.6:GDGGPPGATGFPGAAGR; 肤段7:沈Q ID N0.7:IGQPGAVGPAGIR; 肤段8:沈Q ID N0.8:GVAGEPGRNGLPGGPGLR; 肤段9:沈Q ID N0.9:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR; 肤段 10:沈Q ID N0.10:GSTGEIGPAGPPGPPGLR; 肤段 11:SEQ ID N0.11:GDIGSPGR; 肤段12:沈Q ID N0.12:GEAGSPGIAGPK; 肤段13:沈Q ID N0.13:GEPGPAGAVGPAGAVGPR; 肤段 14:沈Q ID N0.14:GETGTAGDAGPIGPVGAR; 肤段15:沈Q ID N0.15:GETGMAGAVGPAGAVGPR; 肤段 16:沈Q ID N0.16:GGPGPAGPR; 肤段 17:沈Q ID N0.17:IGQPGAVGPAGIR; 肤段 18:沈Q ID N0.18:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR; 肤段 19:沈Q ID N0.19:TGQPGPSGISGPPGPPGPAGK; 肤段20:沈Q ID N0.20:SGDRGETGPAGPAGPIGPVGAR; 肤段21:SEQ ID N0.21:GDGGPPGATGFPGAAGR; 肤段22:沈Q ID N0.22:VGPPGPSGNAGPPGPPGPAGK; 肤段23:沈Q ID N0.23:NGLPGGPGLR; 肤段24:沈Q ID N0.24:GPPGPMGPPGLAGPPGESGR; 肤段25:沈Q ID N0.25:GIPGPVGAAGATGAR; 肤段26:SEQ ID N0.26:GEAGPAGPAGPAGPR; 肤段27:SEQ ID N0.27:IGYAVGPAAVLDAAR; 肤段28:沈Q ID N0.28:GIPGVSGSVGEPGPIGISGPPGAR; 肤段29:沈Q ID N0.29:AGPVGAAGAPGPQGPVGPVGK; 肤段30:沈Q ID N0.30:AGPPGPPGPAGK; 肤段31:沈Q ID N0.31:GEPGPAGLPGPPGER; 肤段32:沈Q ID N0.32:GAPGPQGPPGAPGPLGIAGLTGAR; 肤段33:SEQ ID N0.33:GETGHAGPAGPIGPVGAR; 肤段：M:沈Q ID N0.34:GPPGSAGAPGK; 肤段35:沈Q ID N0.35:(iLPGVAGSVGEPGPLGIAGPPGAR; 肤段36:沈Q ID N0.36:GETGPAGPAGPIGPVGAR; 肤段37:沈Q ID N0.37:SGETGASGPPGFVGEK; 肤段38:沈Q ID N0.38:GPPGAQGPPGSPGPLGIAGLTGAR; 肤段39:沈Q ID N0.39:GPPGAGGPPGPR; 肤段40:沈Q ID N0.40:GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK; 肤段41:SEQ ID N0.41:DGASGHPGPIGPPGPR; 肤段42:沈Q ID N0.42:GAAGPPGPPGSAGTPGLQGMPGER; 肤段43:沈Q ID N0.43:GPPGESGAAGPTGPIGSR; 肤段44:沈Q ID N0.44:GPPGAGGPPGPR; 肤段45:沈Q ID N0.45:GVAGEPGRNGLPGGPGLR; 肤段46:沈Q ID N0.46:GESGAPGVPGIAGPR; 肤段47:沈Q ID N0.47:GSPGADGPAGAPGTPGPQGIAGQR; 肤段48:沈Q ID NO. 48: GEQGPAGPPGFQGLPGPAGTAGEAGK; 肤段49:沈Q ID N0.49:PGEVGPPGPPGPAGEK; 肤段50:沈Q ID N0.50:GSTGEIGPAGPPGPPGLR。2.根据权利要求1所述多肤，其特征在于，所述多肤对应的m/z值及子离子分别为： 肤段 1:694.7; 肤段2:440.2; 肤段3:737.9; 肤段4:477.8; 肤段5:495.6; 肤段6:729.3; 肤段7:596.8; 肤段8:565.3; 肤段 9:611.6; 肤段 10:816.9; 肤段 11:387.7; 肤段 12:528.8; 肤段 13:511.6; 肤段 14:791.9; 肤段 15:777.9; 肤段 16:391.2; 肤段 17:604.8; 肤段 18:908.9; 肤段 19:923.5; 肤段20:659.3; 肤段21:737.3; 肤段22:605.3; 肤段23:485.7; 肤段24:601.0; 肤段25:634.3; 肤段26:631.3; 肤段27:722.4; 肤段28:1066.1; 肤段29:879.0; 肤段 30:517.8; 肤段 31:718.3; 肤段32:705.4; 肤段33:791.9; 肤段34:464.3; 肤段 35:711.0; 肤段36:780.9; 肤段37:746.9; 肤段38:700.0; 肤段 39:516.8; 肤段40:1169.1; 肤段41:500.9; 肤段42:727.3; 肤段43:790.9; 肤段 44:516.8; 肤段45:570.6; 肤段46:677.3; 肤段47:691.7; 肤段48:779.7; 肤段49:745.9; 肤段50:824.9。3.-种检测阿胶及其制品中是否含有牛源性成分的检测方法，所述方法包括如下步 骤： 步骤(1)，对待测样本进行质谱前处理，获得待测多肤滤液： 步骤(2)，通过质谱法检测步骤（1)获得的多肤滤液，检测待测样本中是否含有权利要 求1或2所述肤段的质谱峰。4. 根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，步骤（1)所述的对待测样本进行质谱 前处理，获得待测多肤滤液的步骤如下： (1) 将待测样品均质成粉末状态，称取O.lg~〇.5g阿胶样品或1.0~2.0g阿胶制品，加 入1 %畑祖0)3溶液，超声处理10~30min使样品完全溶解，定容至50血； (2) 溶液过0.22μπι滤膜； (3) 取10~20化化ypsin酶溶液（lygAiL的化ypsin酶溶液)加入到上述10化L~2(Κ)化滤 液中，37°C酶解16-18小时，待上机检测。5. 根据权利要求3或4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)通过质谱法检验步骤（1) 获得的多肤滤液的方法是下述方法A或方法B: 方法A:采用AB SCIEX T「ipleTOF?5600质谱检测多肤滤液中是否含有权利要求1或2所 述的肤段的质谱峰， 上机参数为： 流动相A: 0.05~0.2 %甲酸-乙腊溶液，流动相B: 0.05~0.2 %甲酸-水， 流速:0.1 ~0.5mL/min， T0F扫描范围：100-3000Da， 正离子反应模式，GS1:35，GS2:45，Curtain Gas: 35，ISVF: 5500，TEM: 500，DP: 100，CE: 10; 方法B:采用AB SCIEXS重四级杆质谱检测多肤滤液中是否含有权利要求1或2所述的 肤段的质谱峰， 上机参数为： 流动相A: 0.05~0.2 %甲酸-乙腊，流动相B: 0.05~0.2 %甲酸-水， 流速:0.1 ~0.5mL/min， 电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式:MRM，喷雾电压：5500V，离子传输管溫度： 475 °C ;銷气压力:40;辅助气压力:6。6. 使用权利要求1所述的各个多肤或其任意组合W检测目标阿胶及其制品样本中是否 含有牛源性成分的方法，所述方法包括:质谱法、高效液相色谱法、核磁共振法等。7. 权利要求1所述的各个多肤或其任意组合在检测目标阿胶及其制品样本中是否含有 牛源性成分中的应用，所述的阿胶制品包括但不限于阿胶糕、阿胶膏、阿胶浆、阿胶口服液、 阿胶糖、阿胶补血颗粒。
【文档编号】C07K14/47GK105837676SQ201610158016
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月18日
【发明人】张晓梅, 张鸿伟, 鲍蕾, 梁成珠, 王境堂
【申请人】山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心