一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法
【专利摘要】本发明公开一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，是一种利用细胞培养反应器悬浮培养霍山石斛细胞来生产霍山石斛生物碱的方法。包括以下步骤：(1)单细胞制备(2)单细胞系培养(3)细胞群放大培养(4)提取霍山石斛生物碱：当细胞密度达到60000?80000个/ml收集霍山石斛细胞，降低培养温度至7?10℃，继续培养5?7天，提取霍山石斛生物碱。本发明能够大幅度缩短细胞培养周期，提高霍山石斛生物碱产品收率，且工艺简单、稳定，适合工业化生产。
【专利说明】
一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法
技术领域
[0001]本发明涉及霍山石斛技术领域，尤其涉及一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法。
【背景技术】
[0002]霍山石斛生物碱类是霍山石斛的主要成分之一，生物碱的药理作用主要表现在抗肿瘤、对心血管、胃肠道抑制作用及止痛退热等作用。随着社会发展，人们对健康的关注越来越高，其需求量也会越来越大，但传统霍山石斛生物碱类的提取方法是用霍山石斛的根、茎、叶等植物体提取所得，这种工艺所得的产品已经不能满足未来市场对霍山石斛精深加工的需求。
[0003]随着植物细胞工程技术的发展，用细胞进行人工培养扩增提取植物的代谢产物，可以不受土地面积、气候环境、地域、病虫害等限制影响，适于工业化生产。利用细胞工程技术生产石斛生物碱类的技术，在国内外早有研究，也取得了诸多成果，但在生产过程中存在很多难题问题，如工艺复杂、生物量增速低、目标产物收率低、生产周期长等。关于利用气升搅拌罐悬浮培养霍山石斛细胞生产霍山石斛生物碱的研究还没有报道，因此开发一种高效生产霍山石斛中生物碱类天然产物的方法是十分有意义的。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术的不足，提供一种工艺简单、稳定，适合工业化生产悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法。
[0005]本发明通过以下技术手段去解决上述技术问题的:一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，包括以下步骤:
[0006](I)单细胞制备:取霍山石斛蒴果消毒后用固体培养基进行无菌播种，待萌发成原球茎后取出，采用酶解法分离制备单细胞，并离心过滤除杂，收集单细胞；
[0007](2)单细胞系培养:将收集到的单细胞接种到第一 MS液体培养基中培养；
[0008](3)细胞群放大培养:将培养好的单细胞系接种于第二 MS液体培养基中培养;所述第二 MS液体培养基中的P元素含量为MS液体培养基的2-3倍，所述第二 MS液体培养基中还添加有l-2mg//L的锗元素、0.02-0.lmg/L砸元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值为5.8 土0.4。
[0009]使用本发明的第二MS液体培养基，相对于MS液体培养基能延长分批培养细胞生长时间2倍以上，提高细胞密度2倍以上。锗元素、砸元素、酸水解酪蛋白能够显著增加霍山石斛悬浮细胞的鲜重、提高蛋白质和叶绿素的含量，使细胞抗氧化活性明显升高。
[0010](4)提取霍山石斛生物碱:当细胞密度达到60000-80000个/ml，降低培养温度至7-1O0C，继续培养5-7天，采用离心收集霍山石斛细胞;再提取霍山石斛生物碱。
[0011 ]由于生物碱是次级代谢产物，与细胞生长不偶联，降低培养温度至该温度范围内，使细胞不增长，能促使生物碱产物的产生。
[0012]优选地，所述步骤(I)播种采用的培养基为适合兰科植物生长的固体培养基。
[0013]优选地，所述固体培养基为1/2MS培养基。1/2MS培养基中大量元素减半，适合兰科植物种子萌发。
[0014]优选地，所述步骤(2)中单细胞接种量为25 土 2g/L，光强度为2000-4000lux，色温为4000-6000K，震荡培养，温度22 ± 2 °C，当细胞密度达到10000-20000个/mL，即可放大培养。该光强度范围有助于细胞的形态建成和活力提升，过高则浪费，过低则达不到效果。该色温为暖光，蓝紫光较为均衡，有利于代谢产物的合成。该温度范围为霍山石斛生长和代谢最为均衡的温度。该密度下，细胞的群体生长处于指对数时期，即活力最旺盛的时期。
[0015]优选地，所述步骤(3)中单细胞系接种量为30 土 2g/L，光强度为2000-40001ux，色温为4000-6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30 %。
[0016]优选地，所述第二MS液体培养基中还添加有0.1-2mg/L ΝΑΑ、0.l_2mg/L 6_BA、50_lOOmg/L果胶酶、10-50mg/L纤维素酶，pH值为5.8 ± 0.4。添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块，保证营养和溶氧和二氧化碳供应均勾、充分。
[0017]优选地，所述锗元素来源于GeO2或有机锗。
[0018]优选地，所述砸元素来源于Na2SeO3或有机砸。
[0019]本发明的优点在于:本发明首先对霍山石斛种子无菌播种萌发形成的原球茎，利用酶解法分离出高活力原球茎中的单细胞，进一步培养成单细胞系，最后进行细胞群放大培养，在放大培养中，添加植物生长调节剂和生物酶制剂到培养基中，能激活细胞分裂生长，并防止细胞聚集结块，保证营养和溶氧和二氧化碳供应均匀、充分。本发明能够大幅度缩短细胞培养周期，提高产品收率，且工艺简单、稳定，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0020]本发明生物碱含量的检测方法
[0021]1、对实施例提取的生物碱进行分析，具体分析方法如下。标准品配制:精密称取石斛碱标准品1.0Omg置10mL量瓶中加氯仿至刻度。标准曲线的绘制:精密量取1.0，2.0，3.0，4.0,5.0mL分别置分液漏斗中，用氯仿准确稀释至10.0mL，加入pH 4.5缓冲液5.0mL和0.04%溴甲酚绿溶液1.0mL，剧烈振摇3min，静置30min，氯仿层经氯仿浸泡处理并干燥后的药棉滤过，取续滤液5.0mLjJP0.0 lmolL—1氢氧化钠无水乙醇液1.0mL摇匀，以氯仿10.0mL为空白，同法操作，于波长620nm处测得吸收度。由吸光度X对浓度Y(ug/ml)进行回归计算，得到标准曲线方程:Υ = 0.6321X-0.0132，r = 0.99914。
[0022]2、样品的测定:称取本实验制得的霍山石斛生物碱样品50mg，稀释至溶液吸光值在标准曲线范围内(10-100倍)稀释后，按上述方法进行测定。每个样品测试10次，取线性范围内的值求均值。
[0023]实施例1
[0024]本实施例公开一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，包括以下步骤:
[0025]1、培养阶段
[0026](I)单细胞制备
[0027]取霍山石斛蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为固体I/2MS培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
[0028](2)单细胞系培养
[0029]将收集到的单细胞接种到含有第一MS液体培养基的挡板摇瓶中，单细胞接种量为23g/L，光强度为20001ux，色温为4000K，震荡培养，调pH值为5.4，温度20°C，当细胞密度达到10000个/mL，即可放大培养；
[0030](3)细胞群放大培养:
[0031]将培养好的单细胞系接种于含有第二MS(该MS液体培养基中的P元素为常规MS液体培养基的2倍)+0.lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.lmg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-节氨基嘌呤)+50mg/L中性果胶酶+10mg/L中性纤维素酶+lmg/L的锗元素(来源于Ge02)+0.02mg/L砸元素(来源于Na2Se03)+0.1g/L的酸水解酪蛋白的液体培养基的30L气升式搅拌发酵罐中，鲜细胞接种量为28g/L，光强度为20001ux，色温为4000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶O2在30%，溶0)2在3%，调节补料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.4;补料液为2倍浓度的第二 MS液体培养基;
[0032](4)当细胞密度达到60000个/ml，经测定每毫升培养液中细胞鲜重0.53g/mL、每克鲜细胞中蛋白质含量11.9mg/g、每克鲜细胞中叶绿素含量0.18mg/g，每克鲜细胞中SOD活性312U/g，降低培养温度至70C，继续培养5天，采用100rpm低速离心，1min，收集霍山石斛细胞，将收集到的霍山石斛细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用。
[0033]2、提取阶段:
[0034](I)脱脂:称取过20目筛的干燥的霍山石斛粉末30g于洁净烧瓶中，加入约50ml石油醚回流脱脂0.5h，抽滤；
[0035](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，过滤，滤渣再用90 %的乙醇浸提两次，每次0.5h，过滤，合并滤液，旋转蒸发，回收乙醇；
[0036](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取两次，合并萃取液后蒸馏回收氯仿得总石斛生物碱，为浅黄色粉末的粗石斛生物碱，重0.153g;
[0037](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物碱与甲醇的重量体积比g:ml为1:10)，超声加速其溶解，超声功率为300w，时间为15min，最终形成悬池液，将悬池液离心，离心转速为5000r/min，15min，将离心之后的上清液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅使甲醇溶液蒸干，按生物碱含量的检测方法得到精制霍山石斛生物碱中总生物碱的含量为0.171 g，收率为0.34%。
[0038]本发明消毒具体采用的方式是75%酒精消毒Imin，0.1 ^HgCl2消毒15min，无菌水洗涤3次。以下实施例均采用该方法进行消毒。
[0039]本发明的酶解法分离采用的是现有技术，具体是在20uM蔗糖，1uM MgCl2,20uMpH 7.8Tris—HCL缓冲液中，使用果胶酶、纤维素酶对细胞团室温处理4-8h。并在500rpm、1min条件下离心、清洗后收集单细胞。以下实施例均采用该方法进进行分离。
[0040]实施例2
[0041]1、培养阶段
[0042](I)单细胞制备
[0043]取霍山石斛蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为固体I/2MS培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
[0044](2)单细胞系培养
[0045]将收集到的单细胞接种到含有第一MS液体培养基的挡板摇瓶中，单细胞接种量为25g/L，光强度为30001ux，色温为5000K，震荡培养，调pH值为5.8，温度22 °C，当细胞密度达到15000个/mL，即可放大培养；
[0046](3)细胞群放大培养:
[0047]将培养好的单细胞系接种于含有第二MS(该MS液体培养基中的P元素为常规MS液体培养基的3倍)+ lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ lmg/L 6_BA(6_Benzylaminopurine，6_节氛基嘌吟)+70mg/L中性果胶酶+30mg/L中性纤维素酶+70mg/L中性果胶酶+30mg/L中性纤维素酶+1.5mg/L的锗元素(来源于Ge02)+0.05mg/L砸元素(来源于Na2Se03)+0.13g/L的酸水解酪蛋白的液体培养基的30L气升式搅拌发酵罐中，鲜细胞接种量为30g/L，光强度为30001uX，色温为5000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶O2在30 %，溶0)2在3 %，调节补料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;补料液为2倍浓度的第二 MS液体培养基；
[0048](4)当细胞密度达到70000个/ml，测定每毫升培养液中细胞鲜重0.54g/mL、每克鲜细胞中蛋白质含量12.lmg/g、每克鲜细胞中叶绿素含量0.19mg/g,每克鲜细胞中SOD活性327U/g，降低培养温度至80C，继续培养6天，采用100rpm低速离心，1min，收集霍山石斛细胞，经将收集到的霍山石斛细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用。
[0049]2、提取阶段:
[0050](I)脱脂:称取过20目筛的干燥的霍山石斛粉末30g于洁净烧瓶中，加入约50ml石油醚回流脱脂0.5h，抽滤；
[0051 ] (2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，过滤，滤渣再用90%的乙醇浸提两次，每次0.5h，过滤，合并滤液，旋转蒸发，回收乙醇；
[0052](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取两次，合并萃取液后蒸馏回收氯仿得总石斛生物碱，为浅黄色粉末的粗石斛生物碱，重0.153g;
[0053](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物碱与甲醇的重量体积比g:ml为1:10)，超声加速其溶解，超声功率为300w，时间为15min，最终形成悬池液，将悬池液离心，离心转速为5000r/min，15min，将离心之后的上清液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅使甲醇溶液蒸干，按生物碱含量的检测方法得到精制霍山石斛生物碱中总生物碱的含量为0.257g，收率为0.51%。
[0054]实施例3
[0055]1、培养阶段
[0056](I)单细胞制备
[0057]取霍山石斛蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为固体I/2MS培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
[0058](2)单细胞系培养
[0059]将收集到的单细胞接种到含有第一MS液体培养基的挡板摇瓶中，单细胞接种量为27g/L，光强度为40001ux，色温为6000K，震荡培养，调pH值为6.2，温度24°C，当细胞密度达到20000个/mL，即可放大培养；
[0060](3)细胞群放大培养:
[0061]将培养好的单细胞系接种于含有第二MS(该MS液体培养基中的P元素为常规MS液体培养基的2倍)+ 2mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 2mg/L 6_BA(6_Benzy laminopur ine，6-节氨基嘌呤) + 100mg/L中性果胶酶+50mg/L中性纤维素酶+2mg/L的锗元素(来源于有机锗)+0.lmg/L砸元素(来源于125603)+0.2g/L的酸水解酪蛋白的液体培养基的30L气升式搅拌发酵罐中，鲜细胞接种量为32g/L，光强度为40001ux，色温为6000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶O2在30%，溶0)2在3%，调节补料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在6.2;补料液为2倍浓度的第二MS液体培养基；
[0062](4)当细胞密度达到80000个/ml，经测定每毫升培养液中细胞鲜重0.58g/mL、每克鲜细胞中蛋白质含量12.2mg/g、每克鲜细胞中叶绿素含量0.19mg/g，每克鲜细胞中SOD活性317U/g，降低培养温度至10°C，继续培养7天，采用100rpm低速离心，lOmin，收集霍山石斛细胞，将收集到的霍山石斛细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用。细胞达到该密度后，就不能继续增加了密度了，达到30L气升式发酵罐的搅动极限。
[0063]2、提取阶段:
[0064](I)脱脂:称取过20目筛的干燥的霍山石斛粉末30g于洁净烧瓶中，加入约50ml石油醚回流脱脂0.5h，抽滤；
[0065](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，过滤，滤渣再用90 %的乙醇浸提两次，每次0.5h，过滤，合并滤液，旋转蒸发，回收乙醇；
[0066](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取两次，合并萃取液后蒸馏回收氯仿得总石斛生物碱，为浅黄色粉末的粗石斛生物碱，重0.153g;
[0067](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物碱与甲醇的重量体积比g:ml为1:10)，超声加速其溶解，超声功率为300w，时间为15min，最终形成悬池液，将悬池液离心，离心转速为5000r/min，15min，将离心之后的上清液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅使甲醇溶液蒸干，按生物碱含量的检测方法得到精制霍山石斛生物碱中总生物碱的含量为0.232g，收率为0.46%。
[0068]实施例4
[0069]丨、培养阶段
[0070](I)单细胞制备
[0071]取霍山石斛蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为固体I/2MS培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
[0072](2)单细胞系培养
[0073]将收集到的单细胞接种到含有第一MS液体培养基的挡板摇瓶中，单细胞接种量为24g/L，光强度为25001ux，色温为4500K，震荡培养，调pH值为5.6，温度21°C，当细胞密度达到12000个/mL，即可放大培养；
[0074](3)细胞群放大培养:
[0075]将培养好的单细胞系接种于含有第二MS(该MS液体培养基中的P元素为常规MS液体培养基的2倍)+0.5mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.7mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-节氨基嘌呤)+70mg/L中性果胶酶+20mg/L中性纤维素酶+1.8mg/L的锗元素(来源于有机锗)+0.06mg/L砸元素(来源于有机砸)+0.16g/L的酸水解酪蛋白的液体培养基的30L气升式搅拌发酵罐中，鲜细胞接种量为29g/L，光强度为25001UX，色温为4500K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶O2在30 %，溶⑶2在3 %，调节补料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.9;补料液为2倍浓度的第二MS液体培养基；
[0076](4)当细胞密度达到80000个/ml，经测定每毫升培养液中细胞鲜重0.57g/mL、每克鲜细胞中蛋白质含量12.4mg/g、每克鲜细胞中叶绿素含量0.2 lmg/g，每克鲜细胞中SOD活性313U/g。降低培养温度至90C，继续培养6天，采用100rpm低速离心，1min，收集霍山石斛细胞，将收集到的霍山石斛细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用。
[0077]2、提取阶段:
[0078](I)脱脂:称取过20目筛的干燥的霍山石斛粉末30g于洁净烧瓶中，加入约50ml石油醚回流脱脂0.5h，抽滤；
[0079](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，过滤，滤渣再用90 %的乙醇浸提两次，每次0.5h，过滤，合并滤液，旋转蒸发，回收乙醇；
[0080](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取两次，合并萃取液后蒸馏回收氯仿得总石斛生物碱，为浅黄色粉末的粗石斛生物碱，重0.153g;
[0081 ] (4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物碱与甲醇的重量体积比g:ml为1:10)，超声加速其溶解，超声功率为300w，时间为15min，最终形成悬池液，将悬池液离心，离心转速为5000r/min，15min，将离心之后的上清液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅使甲醇溶液蒸干，按生物碱含量的检测方法得到精制霍山石斛生物碱中总生物碱的含量为0.18 2 g，收率为0.36%。
[0082]实施例5
[0083]丨、培养阶段
[0084](I)单细胞制备
[0085]取霍山石斛蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为固体I/2MS培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
[0086](2)单细胞系培养
[0087]将收集到的单细胞接种到含有第一MS液体培养基的挡板摇瓶中，单细胞接种量为25g/L，光强度为30001ux，色温为4400K，震荡培养，调pH值为5.7，温度22°C，当细胞密度达到18000个/mL，即可放大培养；
[0088](3)细胞群放大培养:
[0089]将培养好的单细胞系接种于含有第二MS(该MS液体培养基中的P元素为常规MS液体培养基的2倍)+ lmg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 1.2mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-节氨基嘌呤)+60mg/L中性果胶酶+25mg/L中性纤维素酶+1.8mg/L的锗元素(来源于Ge02)+0.08mg/L砸元素(来源于有机砸)+0.17g/L的酸水解酪蛋白的液体培养基的30L气升式搅拌发酵罐中，鲜细胞接种量为30g/L，光强度为20001ux，色温为5200K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶O2在30%，溶0)2在3%，调节补料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;补料液为2倍浓度的第二MS液体培养基；
[0090](4)当细胞密度达到60000个/ml，经测定每毫升培养液中细胞鲜重0.54g/mL、每克鲜细胞中蛋白质含量12.lmg/g、每克鲜细胞中叶绿素含量0.19mg/g，每克鲜细胞中SOD活性324U/g ο降低培养温度至7 0C，继续培养5天，采用100rpm低速离心，1min，收集霍山石斛细胞，将收集到的霍山石斛细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用。
[0091]2、提取阶段:
[0092](I)脱脂:称取过20目筛的干燥的霍山石斛粉末30g于洁净烧瓶中，加入约50ml石油醚回流脱脂0.5h，抽滤；
[0093](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，过滤，滤渣再用90 %的乙醇浸提两次，每次0.5h，过滤，合并滤液，旋转蒸发，回收乙醇；
[0094](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取两次，合并萃取液后蒸馏回收氯仿得总石斛生物碱，为浅黄色粉末的粗石斛生物碱，重0.153g;
[0095](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物碱与甲醇的重量体积比g:ml为1:10)，超声加速其溶解，超声功率为300w，时间为15min，最终形成悬池液，将悬池液离心，离心转速为5000r/min，15min，将离心之后的上清液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅使甲醇溶液蒸干，按生物碱含量的检测方法得到精制霍山石斛生物碱中总生物碱的含量为0.239g，收率为0.48%。
[0096]实施例6
[0097]1、培养阶段
[0098](I)单细胞制备
[0099]取霍山石斛蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为固体I/2MS培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
[0100](2)单细胞系培养
[0101 ]将收集到的单细胞接种到含有第一MS液体培养基的挡板摇瓶中，单细胞接种量为26g/L，光强度为30001ux，色温为5000K，震荡培养，调pH值为6.1，温度20°C，当细胞密度达到12000个/mL，即可放大培养；
[0102](3)细胞群放大培养:
[0103]将培养好的单细胞系接种于含有第二MS(该MS液体培养基中的P元素为常规MS液体培养基的3倍)+0.3mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+ 1.4mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-节氨基嘌呤)+6 Omg/L中性果胶酶+30mg/L中性纤维素酶+2mg/L的锗元素(来源于GeO2) +0.05mg/L砸元素(来源于有机砸)+0.18g/L的酸水解酪蛋白的液体培养基的30L气升式搅拌发酵罐中，鲜细胞接种量为30g/L，光强度为30001ux，色温为5000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶O2在30%，溶0)2在3%，调节补料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.8;补料液为2倍浓度的第二MS液体培养基;
[0104](4)当细胞密度达到70000个/ml，经测定每毫升培养液中细胞鲜重0.56g/mL、每克鲜细胞中蛋白质含量11.9mg/g、每克鲜细胞中叶绿素含量0.19mg/g，每克鲜细胞中SOD活性332U/g，降低培养温度至80C，继续培养6天，采用100rpm低速离心，1min，收集霍山石斛细胞，将收集到的霍山石斛细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用。
[0105]2、提取阶段:
[0106](I)脱脂:称取过20目筛的干燥的霍山石斛粉末30g于洁净烧瓶中，加入约50ml石油醚回流脱脂0.5h，抽滤；
[0107](2)浸提:加入90%乙醇50ml浸提0.5h，过滤，滤渣再用90%的乙醇浸提两次，每次0.5h，过滤，合并滤液，旋转蒸发，回收乙醇；
[0108](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取两次，合并萃取液后蒸馏回收氯仿得总石斛生物碱，为浅黄色粉末的粗石斛生物碱，重0.153g;
[0109](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物碱与甲醇的重量体积比g:ml为1:10)，超声加速其溶解，超声功率为300w，时间为15min，最终形成悬池液，将悬池液离心，离心转速为5000r/min，15min，将离心之后的上清液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅使甲醇溶液蒸干，按生物碱含量的检测方法得到精制霍山石斛生物碱中总生物碱的含量为0.171 g，收率为0.34%。
[0110]实施例7
[0111]1、培养阶段
[0112](I)单细胞制备
[0113]取霍山石斛蒴果，按照组培技术要求消毒后进行无菌播种，播种培养基为固体I/2MS培养基，待萌发成原球茎后取出，选择色泽鲜艳、个体硕大、活力旺盛的原球茎，采用酶解法分离制备单细胞，用80微米孔径的微孔滤器过滤，滤液经低速离心机分离，收集沉淀下的细胞；
[0114](2)单细胞系培养
[0115]将收集到的单细胞接种到含有第一MS液体培养基的挡板摇瓶中，单细胞接种量为26g/L，光强度为40001ux，色温为6000K，震荡培养，调pH值为6.2，温度23°C，当细胞密度达到13000个/mL，即可放大培养；
[0116](3)细胞群放大培养:
[0117]将培养好的单细胞系接种于含有第二MS(该MS液体培养基中的P元素为常规MS液体培养基的2倍)+ 1.3mg/LNAA( 1-Naphthaleneacetic acid，蔡乙酸)+0.8mg/L6_BA(6-Benzy laminopur ine，6-节氨基嘌呤)+70mg/L中性果胶酶+35mg/L中性纤维素酶+1.6mg/L的锗元素(来源于GeO2) +0.lmg/L砸元素(来源于有机砸)+0.17g/L的酸水解酪蛋白的液体培养基的30L气升式搅拌发酵罐中，鲜细胞接种量为30g/L，光强度为30001ux，色温为5000K，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶O2在30%，溶0)2在3%，调节补料液流加量保持糖含量在3 %和NaOH溶液流加量保持pH在5.6;补料液为2倍浓度的第二 MS液体培养基；
[0118](4)当细胞密度达到70000个/ml，经测定每毫升培养液中细胞鲜重0.56g/mL、每克鲜细胞中蛋白质含量12.2mg/g、每克鲜细胞中叶绿素含量0.19mg/g，每克鲜细胞中SOD活性331U/g，降低培养温度至9 0C，继续培养6天，采用100rpm低速离心，1min，收集霍山石斛细胞，将收集到的霍山石斛细胞杀青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用。
[0119]2、提取阶段:
[0120](I)脱脂:称取过20目筛的干燥的霍山石斛粉末30g于洁净烧瓶中，加入约50ml石油醚回流脱脂0.5h，抽滤；
[0121](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，过滤，滤渣再用90 %的乙醇浸提两次，每次0.5h，过滤，合并滤液，旋转蒸发，回收乙醇；
[0122](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取两次，合并萃取液后蒸馏回收氯仿得总石斛生物碱，为浅黄色粉末的粗石斛生物碱，重0.153g;
[0123](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物碱与甲醇的重量体积比g:ml为1:10)，超声加速其溶解，超声功率为300w，时间为15min，最终形成悬池液，将悬池液离心，离心转速为5000r/min，15min，将离心之后的上清液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅使甲醇溶液蒸干，按生物碱含量的检测方法得到精制霍山石斛生物碱中总生物碱的含量为0.223g，收率为
0.44%。
[0124]对比例I
[0125]选取播种生长8个月的霍山石斛组培苗，将组培苗洗净沥干后杀青，再70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常温封闭保存备用。
[0126]I)脱脂:称取过20目筛的干燥的霍山石斛粉末30g于洁净烧瓶中，加入约50ml石油醚回流脱脂0.5h，抽滤；
[0127](2)浸提:加入90 %乙醇50ml浸提0.5h，过滤，滤渣再用90 %的乙醇浸提两次，每次
0.5h，过滤，合并滤液，旋转蒸发，回收乙醇；
[0128](3)萃取:剩余液中加入氯仿50ml，萃取，再用一半量氯仿萃取两次，合并萃取液后蒸馏回收氯仿得总石斛生物碱，为浅黄色粉末的粗石斛生物碱，重0.153g;
[0129](4)精制:用甲醇溶解(粗霍山石斛生物碱与甲醇的重量体积比g:ml为1:10)，超声加速其溶解，超声功率为300w，时间为15min，最终形成悬池液，将悬池液离心，离心转速为5000r/min，15min，将离心之后的上清液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅使甲醇溶液蒸干，按生物碱含量的检测方法得到精制霍山石斛生物碱中总生物碱的含量为0.19 6 g，收率为
0.39%。
[0130]通过上述的培养和提取，可以很清楚的判定本发明所述的细胞培养法在细胞培养后生产的霍山石斛生物碱在收率上可以接近甚至超过同期播种生长8个月的组培苗生产的霍山石斛生物碱。
[0131]本发明的方法不限制霍山石斛生物碱的生产，还适用于其他食用或药用石斛属植物生物碱的生产。本发明的第一 MS液体培养基为常规MS液体培养基或者P元素为常规MS液体培养基P元素2-3倍的培养基。
[0132]以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。
【主权项】
1.一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)单细胞制备:取霍山石斛蒴果消毒后用固体培养基进行无菌播种，待萌发成原球茎后取出，采用酶解法分离制备单细胞，并离心过滤除杂，收集单细胞； (2)单细胞系培养:将收集到的单细胞接种到第一MS液体培养基中培养； (3)细胞群放大培养:将培养好的单细胞系接种于第二MS液体培养基中培养;所述第二MS液体培养基中的磷兀素含量为MS液体培养基的2-3倍，所述第二 MS液体培养基中还添加有l-2mg/L的锗元素、0.02-0.lmg/L砸元素和0.1-0.2g/L的酸水解酪蛋白，pH值为5.8 土0.4； (4)提取霍山石斛生物碱:当细胞密度达到60000-80000个/ml，降低培养温度至7-100C，继续培养5-7天，采用离心收集霍山石斛细胞;再提取霍山石斛生物碱。2.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述步骤(I)播种采用的培养基为适合兰科植物生长的固体培养基。3.根据权利要求2所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述固体培养基为1/2MS固体培养基。4.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述步骤(2)中单细胞接种量为25 土 2g/L，光强度为2000-40001ux，色温为4000-6000K，震荡培养，温度22 ± 2 °C，当细胞密度达到10000-20000个/mL，即可放大培养。5.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述步骤(3)中单细胞系接种量为30±2g/L，光强度为2000-40001ux，色温为4000-6000K，温度22±2°C，气升搅拌悬浮培养，调节通气速率和搅拌速率维持溶氧在30%。6.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述第二液体MS培养基中还添加有0.1-2mg/L NAA,0.1 -2mg/L6_BA、50-100mg/L果胶酶、10-50mg/L 纤维素酶，pH 值为 5.8 ±0.4。7.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述锗元素来源于GeO2或有机锗。8.根据权利要求1所述的一种悬浮培养细胞生产霍山石斛生物碱的方法，其特征在于，所述砸元素来源于Na2SeO3或有机砸。
【文档编号】C12N5/04GK105906641SQ201610353012
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】邓辉, 陈乃富, 陈存武, 韩邦兴, 何晓梅
【申请人】皖西学院