Taq DNA聚合酶、PCR反应液及其应用
【专利摘要】本发明涉及Taq DNA聚合酶、PCR反应液及其应用，具体地，提供了一种Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相比，具有以下突变：p.E641K；p.Q698E；以及p.E708Q或p.E708D。本发明所述Taq DNA聚合酶对血液抗性和PCR抑制剂明显提高，并且所述Taq DNA聚合酶能够直接利用血液样品和土壤样品进行PCR检测。由此，不但可以大大节约实验人员的实验时间和成本，而且能够避免因多步操作而造成的样本间交叉污染，使得PCR的检测结果更加的可信；并且为珍贵微量样品的PCR检测提供了一种可供选择的方法。
【专利说明】
Taq DNA聚合酶、PCR反应液及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及Taq DNA聚合酶、PCR反应液及其应 用。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应(PCR)是现代分子生物学领域中基本和重要的实验技术。随着PCR 技术的发展，PCR技术被越来越多的应用到分子诊断和鉴定方面，尤其在基因疾病诊断，病 原微生物鉴定，血液分型，血库建立，环境监测，土壤微生物分析和法医学鉴定等方面的应 用非常广泛。
[0003] 然而，现有PCR技术仍然需要改进。
【发明内容】
[0004] 本发明是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
[0005] PCR反应的模板DNA主要来自于血液样品和土壤样品，由于血液样品和土壤样品中 含有血红蛋白，抗凝剂和腐植酸等对PCR反应具有抑制作用的物质，所以在进行PCR反应之 前实验人员往往需要对血液样品和土壤样品中的基因组DNA进行制备和纯化。虽然增加的 基因组DNA制备步骤能够将大部分的PCR反应抑制剂去除而保证PCR反应的正常进行，但是 基因组DNA的制备步骤通常是非常繁琐的，不但耗时费力，容易造成样品间的交叉污染，而 且在一些情况下并不能将PCR反应抑制剂完全去除，从而影响了后续PCR鉴定结果的准确性 和可靠性。另外，对于珍贵的微量样品而言，比如血滴，血斑等，是不适合进行基因组提取 的。
[0006] 本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
[0007] 根据本发明的第一个方面，本发明提出一种Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶 的氨基酸序列与SEQ ID N0:1相比，具有以下突变：p.E641K;p.Q698E;以及P.E708Q或 P.E708D。
[0008] MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEA YGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIH VLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTCDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREK ILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVG FVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNT TPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLE VAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELT KLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLCCCDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIEL RVLAHLS⑶ENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFI ERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFP RLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID NO：1)〇 [0009]本发明所述Taq DNA聚合酶对血液抗性和PCR抑制剂的抗性明显提高，利用所述 Taq DNA聚合酶能够直接利用血液样品和土壤样品进行PCR，需要说明的是，血液抗性主要 是指对血液中PCR抑制剂的抗性，也就是说，此种PCR方法可以直接使用原始材料为模板，血 液样品和土壤样品不需要经过复杂的基因组DNA的提取和纯化处理，并且此种PCR方法实验 效果和稳定性良好，可以进行进一步的推广。由此，不但可以大大节约实验人员的实验时间 和成本，而且能够避免因多步操作而造成的样本间交叉污染，使得PCR的检测结果更加的可 信;并且为不适合进行基因组DNA提取的珍贵微量样品的PCR检测提供了一种可供选择的方 法。
[0010]根据本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸，具有编码上述Taq DNA聚合酶的 核苷酸序列。利用所述核酸可以表达获得高质量高产量的上述Taq DNA聚合酶。
[0011]根据本发明的一些实施例，所述核酸具有SEQ ID N0:2或3所示的核苷酸序列。利 用所述核酸可以表达获得高质量高产量的上述Taq DNA聚合酶。
[0012] MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEA YGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIH VLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTCDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREK ILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVG FVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNT TPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLE VAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELT KLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLCCCDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIEL RVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTKTASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFI ERYFESFPKVRAWIQKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFP RLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID N0：2)〇
[0013] MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEA YGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIH VLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTCDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREK ILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVG FVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNT TPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLE VAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELT KLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLCCCDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIEL RVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTKTASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFI ERYFESFPKVRAWIDKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFP RLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID N0：3)〇
[0014] 根据本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体，携带上述核酸。所述表达载 体能够高表达其携带的核酸序列，从而可以大量获得本发明所述Taq DNA聚合酶。
[0015] 根据本发明的一些实施例，所述表达载体为pET30a质粒。利用所述表达载体，可以 进一步地提高其携带的核酸序列的表达，从而可以大量获得本发明所述Taq DNA聚合酶。
[0016] 根据本发明的第四方面，本发明提出一种重组细胞，所述重组细胞携带上述核酸。 所述重组细胞能够高表达其携带的核酸，从而大量获得本发明所述Taq DNA聚合酶，从而获 得高产量和高质量的Taq DNA聚合酶。
[0017] 根据本发明的一些实施例，所述重组细胞为大肠杆菌细胞或其衍生细胞。利用所 述重组细胞，可以进一步地提高其携带的核酸序列的表达，从而可以大量获得本发明所述 Taq DNA聚合酶。
[0018] 根据本发明的一些实施例，所述重组细胞含有上述表达载体。利用含有上述表达 载体的重组细胞，可以进一步地提高其携带的核酸序列的表达，从而可以大量获得本发明 所述Taq DNA聚合酶。
[0019] 根据本发明的第五方面，本发明提出一种制备上述重组细胞的方法，包括:将上述 核酸或者上述表达载体引入宿主细胞中。本发明所提出的制备重组细胞的方法能够大量获 得高活性的本发明所提出的重组细胞，进而可以大量获得本发明所述Taq DNA聚合酶，从而 获得高产量和高质量的Taq DNA聚合酶。
[0020] 根据本发明的一些实施例，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或其衍生细胞。进而可 以进一步获得高活性的本发明所提出的重组细胞，进而可以大量获得本发明所述Taq DNA 聚合酶，从而获得高产量和高质量的Taq DNA聚合酶。
[0021] 根据本发明的第六方面，本发明提出一种制备上述Taq DNA聚合酶的方法，包括： 在适于所述Taq DNA聚合酶表达的条件下，培养上述重组细胞或者上述方法获得的所述重 组细胞；以及从培养后的重组细胞中分离获得所述Taq DNA聚合酶。利用该制备方法可以获 得高质量高产量的Taq DNA聚合酶。
[0022]根据本发明的第七方面，本发明提出上述Taq DNA聚合酶在扩增DNA样本中的用 途。利用所述Taq DNA聚合酶能够直接对血液样品和土壤样品中的DNA样本进行扩增，也就 是说，血液样品和土壤样品不需要经过基因组DNA制备步骤。由此，不但可以大大节约实验 人员的实验时间和成本，而且能够避免因多步操作而造成的样本间交叉污染，使得PCR的检 测结果更加的可信;并且为珍贵微量样品的PCR检测提供了一种可供选择的方法。
[0023]根据本发明的一些实施例，所述DNA样本包含在血液样品或者土壤样品中。需要说 明的是，所述血液样本不受限制，可以来自人类，常用模式哺乳动物和模式禽类，土壤样品 也不受限制，可以来自多种类型的土壤。
[0024]根据本发明的第八方面，本发明提出一种PCR反应液，基于1毫升所述PCR反应液， 所述PCR反应液包含：三羟甲基氨基甲烷0.01~0.013克；硫酸铵0.003~0.005克；氯化镁 0.0002~0.0004克；甜菜碱0.2~0.35克；吐温-20 0.05%~0.2% (W/V);DMS0 1 %~5%; 明胶0 · 0001 %~0 · 0005% ;以及丙三醇0 · 05%~2% ;所述PCR反应液的pH值为:8 · 8~9 · 5。 利用上述PCR反应液可以为前述Taq DNA聚合酶提供一个最适反应环境，从而使得上述Taq DNA聚合酶在此反应环境中具有较高的酶活性，从而提高Taq DNA聚合酶对血液抗性和PCR 抑制剂的抗性，从而实现以血液样品和土壤样品为模板直接进行PCR的目的，并且使得血液 和土壤提取物模板的加入量最高可达PCR反应体系的20%。由此，不但可以大大节约实验人 员的实验时间和成本，而且能够避免因多步操作而造成的样本间交叉污染，使得PCR的检测 结果更加的可信;并且为珍贵微量样品的PCR检测提供了一种可供选择的方法。
[0025] 根据本发明的一些实施例，所述PCR反应液进一步包括dNTPs和上述Taq DNA聚合 酶，其中，dNTPs的浓度为200微摩尔/升，所述Taq DNA聚合酶的浓度为0.05~0.25单位/微 升。所述PCR反应液中含有PCR反应所必需的Taq DNA聚合酶和dNTPs，由此可以使得PCR反应 的加样过程更加简便，即进一步缩短了实验人员的时间，又降低了因 PCR加样错误而造成 PCR鉴定不准确的可能性
[0026]根据本发明的第九方面，本发明提出上述PCR反应液在DNA样本扩增中的用途。 [0027]根据本发明的一些实施例，所述DNA样本包含在血液或者土壤样品中。需要说明的 是，所述血液样本不受限制，可以来自人类，常用模式哺乳动物和模式禽类，土壤样品也不 受限制，可以来自多种类型的土壤。
[0028]根据本发明的第十方面，本发明提出一种扩增DNA样本的方法，包括:采用上述PCR 反应液、引物和含有所述DNA样本的样品，进行PCR反应，以便获得经过扩增的所述DNA样本。 所述扩增DNA样本的方法可以直接使用原始材料为模板，血液样品和土壤样品不需要经过 复杂的基因组DNA的提取和纯化处理，并且所述扩增DNA样本的方法实验效果和稳定性良 好，可以进行进一步的推广。由此，不但可以大大节约实验人员的实验时间和成本，而且能 够避免因多步操作而造成的样本间交叉污染，使得PCR的检测结果更加的可信;并且为不适 合进行基因组DNA提取的珍贵微量样品的PCR检测提供了一种可供选择的方法。并且所述扩 增DNA样本的方法中结合前述Taq DNA聚合酶和前述PCR反应液，从而利用前述PCR反应液可 以为所述Taq DNA聚合酶提供一个最适反应环境，从而使得所述Taq DNA聚合酶在此反应环 境中具有较高的酶活性，明显提高Taq DNA聚合酶对血液抗性和PCR抑制剂的抗性，从而实 现以血液样品和土壤样品为模板直接进行PCR的目的，并且使得血液和土壤提取物模板的 加入量最高可达PCR反应体系的20%。
[0029]根据本发明的一些实施例，所述含有所述DNA样本的样品包括:抗凝剂处理过的抗 凝血、液化血凝块、干血斑、土壤样品。需要说明的是，所述血液样本不受限制，可以来自人 类，常用模式哺乳动物和模式禽类，土壤样品也不受限制，可以来自多种类型的土壤。
【附图说明】
[0030] 图1是根据本发明的实施例1所获得的PCR扩增的电泳检测图；
[0031] 图2是根据本发明方法的实施例2所获得的PCR扩增的电泳检测图；
[0032] 图3是根据本发明方法的实施例3所获得的PCR扩增的电泳检测图；
[0033] 图4是根据本发明方法的实施例4所获得的PCR扩增的电泳检测图；
[0034] 图5是根据本发明方法的实施例5所获得的PCR扩增的电泳检测图；
[0035] 图6是根据本发明方法的实施例6所获得的PCR扩增的电泳检测图；
[0036] 图7是根据本发明方法的实施例7所获得的PCR扩增的电泳检测图。
【具体实施方式】
[0037] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0038]本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本 发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条 件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社） 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的 常规广品。
[0039] 实施例
[0040] 实施例1:
[00411构建Taq DNA聚合酶的突变体文库，并筛选正突变体。具体过程如下：
[0042] (l)Taq DNA聚合酶突变体文库的构建。
[0043]发明人首先通过易错PCR技术构建了Taq DNA聚合酶的突变体文库-1，得到克隆子 5062个，通过血液直接PCR实验对所有克隆子的粗提突变酶进行筛选，并最终得到一个以血 液为模板扩增效果最佳的突变体，并将其命名为TaqR-Ι。经测序发现，TaqR-Ι与野生型Taq DNA聚合酶相比，在氨基酸层面有三个氨基酸位点发生了突变，突变情况分别为：E641K， Q698E和E708Q。
[0044]早期研究表明Taq DNA聚合酶的706-708位点是影响其活性的关键位点。而在 TaqR-Ι的三个突变位点中恰好包含708位点，这一点是与之前的相关报道相吻合的。因此， 我们又对TaqR-Ι的708位点进行了饱和突变，通过对TaqR-1 708位点的另外19种氨基酸突 变情况的检测，发明人发现，当TaqR-1 708位点的突变情况为:E708D时，其耐受PCR反应体 系中血液含量的程度越高。并将该突变体命名为TianRTaq，该酶与野生型Taq DNA聚合酶在 氨基酸层面主要有3个位点的突变，分别为:E641K，Q698E和E708D。由上可知，发明人通过易 错PCR和单点饱和突变的方式得到了对血液抗性增加的Taq DNA聚合酶TianRTaq，其氨基酸 位点突变情况为E641K，Q698E和E708D。
[0045] (2)、正向突变体的筛选
[0046]①、在200微升的离心管中分别配制三组(每组4个PCR反应)共12个PCR反应体系， 每个反应的PCR体系的加入组分包括：1微升质粒DNA模板，0-4微升人源EDTA-2K抗凝血样 品，1微升浓度为5微摩尔/升的上游引物(Pls-F:CCATAGCTGGCATAATGCCTGAC)，1微升浓度为 5微摩尔/升的下游引物(Pls-R:TCGAGTATCTGCAGGCTGTGTCATT)，10微升的PCR反应液和不同 的待测DNA聚合酶0.4微升，最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
[0047]其中所述的质粒DNA模板为pLB质粒，浓度为10纳克/微升。
[0048]其中所述的0-4微升EDTA-2K抗凝血的加入方法为:针对于每个待测DNA聚合酶分 四个梯度加入EDTA-2K抗凝血，分别为:0微升，1微升，2微升和4微升，所对应的抗凝血在PCR 反应体系中所占的比例分别为:〇%，5%，10%和20%。
[0049] 其中所述的Pls-F和Pls-R引物的扩增产物长度为740碱基对(bp)。
[0050] 其中所述的PCR反应液的配方为：三羟甲基氨基甲烷（Tr i s) : 0.012克，硫酸铵： 0.004克，氯化镁:0.0003克，甜菜碱:0.3克，吐温20:0.1 % (W/V)，DMS0:3% (体积比），明胶： 0.0002% (W/V)，丙三醇：1 % (体积比）和dNTPs : 200微摩尔/升，调节PCR反应液的pH值为： 9.2，并最终用去离子水定容溶液至1毫升。
[0051 ] 其中所述的待测DNA聚合酶分为三种:一种为野生型Taq DNA聚合酶;一种为TaqR- 1，其突变情况为：E641K，Q698E和E708Q;另外一种为TianRTaq，其突变情况为：E641K，Q698E 和E708D。三种待测DNA聚合酶的浓度均为5单位/微升。
[0052]②、将12个PCR反应体系放入PCR仪中，PCR预变性条件为:95摄氏度，3分钟。PCR循 环条件为:94摄氏度，20秒;58摄氏度，30秒;72摄氏度，40秒;循环35次。PCR补充延伸条件 为:72摄氏度，5分钟。最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度）。
[0053]③、步骤②的反应结束后，取10微升反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果 详见图1。其中，图1显示通过野生Taq酶，TaqR-Ι和TianRTaq在12个人源的EDTA-2I^jt凝血环 境下对质粒DNA进行PCR扩增的电泳检测图，其中，泳道M:脱氧核糖核酸分子量标准 (TIANGEN，Markerm)。泳道1~4:对应4种不同人源的EDTA-2K抗凝血浓度，具体为：泳道1: PCR体系中抗凝血含量为0 % ;泳道2: PCR体系中抗凝血含量为5 % ;泳道3: PCR体系中抗凝血 含量为1 〇 % ;泳道4: PCR体系中抗凝血含量为20 %。
[0054] 通过上述实施例结果可知，与野生型Taq DNA聚合酶相比，TaqR-Ι和TianRTaq的血 液抗性和PCR抑制剂的抗性明显提高。
[0055] 实施例2:
[0056] TianRTaq反应Buffer的优化。利用本发明中的TianRTaq检测调整前、后的PCR反应 液对血液直接扩增的效果，具体的操作步骤如下：
[0057] (1)、在200微升的离心管中分别配制两组(每组4个待测PCR反应)共8个PCR反应体 系，每个待测反应的PCR体系的加入组分包括：1微升质粒DNA模板，0-4微升人源EDTA-2K抗 凝血样品，1微升浓度为5微摩尔/升的上游引物(Pls-F:CCATAGCTGGCATAATGCCTGAC)，1微升 浓度为5微摩尔/升的下游引物(P1 s-R: TCGAGTATCTGCAGGCTGTGTCATT)，10微升的PCR反应液 和DNA聚合酶0.4微升，最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。
[0058]其中所述的质粒DNA模板为pLB质粒，浓度为10纳克/微升。
[0059] 其中所述的0-4微升EDTA-2K抗凝血的加入方法为:针对于每种待测PCR反应液分 四个梯度加入EDTA-2K抗凝血，分别为:0微升，1微升，2微升和4微升，所对应的抗凝血在PCR 反应体系中所占的比例分别为:〇%，5%，10%和20%。
[0060] 其中所述的Pls-F和Pls-R引物的扩增产物长度为740碱基对(bp)。
[00611 其中调整前的PCR反应液的配方为:三羟甲基氨基甲烷(Tri s): 0.012克，硫酸铵： 0.004克，氯化镁:0.0003克，明胶:0.0002% (W/V)，丙三醇：1 %和dNTPs: 200微摩尔/升，调 节PCR反应液的pH值为:8.8，并最终用去离子水定容溶液至1毫升。
[0062] 其中调整后的PCR反应液的配方为:三羟甲基氨基甲烷(Tris): 0.012克，硫酸铵： 0.004克，氯化镁:0.0003克，甜菜碱:0.3克，吐温20:0.1% (W/V)，DMS0:3%，明胶:0.0002% (W/V)，丙三醇：1 %和dNTPs: 200微摩尔/升，调节PCR反应液的pH值为:9.2，并最终用去离子 水定容溶液至1毫升。
[0063] 其中所述的待测DNA聚合酶为TianRTaq，其突变情况为：E641K，Q698E和E708D。浓 度为5单位/微升。
[0064] (2)、将8个PCR反应体系放入PCR仪中，PCR预变性条件为:95摄氏度，3分钟。PCR循 环条件为:94摄氏度，20秒;58摄氏度，30秒;72摄氏度，40秒;循环35次。PCR补充延伸条件 为:72摄氏度，5分钟。最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度）。
[0065] (3)、步骤(2)的反应结束后，取10微升反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结 果详见图2。其中，图2显示TianRTaq与调整前后PCR反应液在8个人源的EDTA-2K抗凝血环境 下对质粒DNA进行PCR扩增的电泳检测图，其中，泳道Μ:脱氧核糖核酸分子量标准(TIANGEN， MarkerΙΠ )。泳道1~4:对应4种不同人源的EDTA-2K抗凝血浓度，具体为:泳道1: PCR体系中 抗凝血含量为0% ;泳道2:PCR体系中抗凝血含量为5% :;泳道3:PCR体系中抗凝血含量为 10 % ;泳道4: PCR体系中抗凝血含量为20 %。
[0066]通过上述实施例结果可知，调整PCR反应液的pH值，并添加有助于保护和增加 DNA 聚合酶活性的甜菜碱、DMS0和吐温是可以进一步提升TianRTaq对血液环境的抗性和PCR抑 制剂的抗性，从而获得较高含量和质量的PCR扩增产物。
[0067] 实施例3:
[0068]本发明方法对常用血液抗凝剂的抗性检测。检测本发明方法对乙二胺四乙酸二钾 (EDTA-2K)，肝素钠和柠檬酸钠抗凝血的直接扩增效果，具体的操作步骤如下：
[0069] (1)、在200微升的离心管中分别配制三组(每组8个待测PCR反应)共24个待测PCR 反应体系和一个阴性对照PCR反应体系，每个待测样品的PCR体系的加入组分包括:2微升人 源抗凝血样品，1微升浓度为5微摩尔/升的上游引物(？印4刃046460461^47^了660644〇，1 微升浓度为5微摩尔/升的下游引物(Prp-R: CCCACTATCAGGAAGATGAGGAAA)和10微升的PCR反 应液，最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。阴性对照样品的PCR体系基本与待测 样品相同，只是模板用1微升去离子水代替抗凝血。
[0070] 其中所述的人源抗凝血分为三种，分别为:EDTA-2K抗凝血，肝素钠抗凝血和柠檬 酸钠抗凝血。
[0071] 其中所述的Prp-F和Prp-R引物的扩增产物长度为750碱基对(bp)。
[0072] 其中的PCR反应液的配方为：三羟甲基氨基甲烷(Tr is): 0.012克，硫酸铵：0.004 克，氯化镁：0.0003克，甜菜碱：0.3克，吐温20:0.1 % (W/V)，DMS0:3%，明胶：0.0002% (W/ V)，丙三醇：1 %和dNTPs: 200微摩尔/升和TianRTaq DNA聚合酶:0 · 2单位/微升，调节PCR反 应液的pH值为:9.2，并最终用去离子水定容溶液至1毫升。
[0073] 其中所述的待测DNA聚合酶为TianRTaq，其突变情况为:E641K，Q698E和E708D。 [0074] (2)、将25个PCR反应体系放入PCR仪中，PCR预变性条件为:95摄氏度，3分钟。PCR循 环条件为:94摄氏度，20秒;58摄氏度，30秒;72摄氏度，40秒;循环35次。PCR补充延伸条件 为:72摄氏度，5分钟。最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度）。
[0075] (3)、步骤(2)的反应结束后，取10微升反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结 果详见图3。其中，图3显示利用实施例3的方法对三种常用抗凝剂抗凝的人源血液进行直接 PCR扩增的电泳检测图。其中，泳道M:脱氧核糖核酸分子量标准(TIANGEN，Markerm)。泳道1 ~8:8种不同人源的EDTA-2K抗凝血，泳道9~16:8种不同人源的肝素钠抗凝血，泳道17~ 24:8种不同人源的柠檬酸钠抗凝血，泳道NTC:阴性对照。
[0076] 通过上述实施例结果可知，本发明方法适用于三种常用抗凝剂抗凝的血液的直接 PCR扩增，具有较好的样本普适性和抗凝剂的普适性。
[0077] 实施例4:
[0078] 通过本发明方法以带有干血斑的滤纸为模板直接进行PCR扩增，并通过后续的琼 脂糖凝胶电泳检测PCR效果。具体的操作步骤如下：
[0079] (1)在200微升的离心管中分别配制待测样品和对照样品的PCR反应体系，每个待 测样品的PCR体系的加入组分包括:适量的带有干血斑的滤纸，1微升浓度为5微摩尔/升的 上游引物(Prp-F: GCAGAGCAGTCATTATGGCGAAC)，1微升浓度为5微摩尔/升的下游引物(Prp-R: CCCACTATCAGGAAGATGAGGAAA)和10微升的PCR反应液，最后用去离子水将PCR反应体系补 足至20微升。对照样品的PCR体系基本与待测样品相同，只是模板用1微升去离子水代替带 有干血斑的滤纸。
[0080] 其中所述的干血斑的载体为滤纸。
[0081] 其中所述干血斑的制备过程如下：利用直径为3毫米的圆形打孔器对干血斑进行 打孔，并将其平均分成四份，以份为单位向PCR体系中添加以做为PCR的模板。
[0082 ]其中所述的干血斑的加入量为1份~4份。
[0083]其中所述的Prp-F和Prp-R引物的扩增产物长度为750碱基对(bp)。
[0084] 其中的PCR反应液的配方为：三羟甲基氨基甲烷(Tris) :0.012克，硫酸铵：0.004 克，氯化镁：0.0003克，甜菜碱：0.3克，吐温20:0.1 % (W/V)，DMS0:3%，明胶：0.0002% (W/ V)，丙三醇：1 %和dNTPs: 200微摩尔/升和TianRTaq DNA聚合酶:0 · 2单位/微升，调节PCR反 应液的pH值为:9.2，并最终用去离子水定容溶液至1毫升。
[0085] 其中所述的待测DNA聚合酶为TianRTaq，其突变情况为:E641K，Q698E和E708D。
[0086] (2)将PCR反应体系放入PCR仪中，PCR预变性条件为:95摄氏度，3分钟。PCR循环条 件为:94摄氏度，20秒;58摄氏度，30秒;72摄氏度，40秒;循环35次。PCR补充延伸条件为：72 摄氏度，5分钟。最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度）。
[0087] (3)步骤(2)的反应结束后，取10微升反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结 果详见图4。其中，图4显示通过本发明以带有干血斑的滤纸为模板直接进行PCR扩增的电泳 检测图。其中，泳道M:脱氧核糖核酸分子量标准(TIANGEN，Markerm)。泳道1~4:模板干血 斑的加入量分别为1份~4份，PCR扩增的电泳检测结果。具体为:泳道1:模板干血斑的加入 量为1份;泳道2:模板干血斑的加入量为2份;泳道3:模板干血斑的加入量为3份;泳道4:模 板干血斑的加入量为4份;泳道NTC:对照样品PCR扩增的电泳检测图。
[0088] 通过上述实施例结果我们可知，本发明方法适合干血斑实验材料的直接扩增。 [0089] 实施例5:
[0090] 通过本发明方法对液化的人源血凝块直接进行PCR扩增，并通过后续的琼脂糖凝 胶电泳检测PCR效果。具体的操作步骤如下：
[0091] (1)在200微升的离心管中分别配制待测样品和对照样品的PCR反应体系，每个待 测样品的PCR体系的加入组分包括：1~4微升液化的人源血凝块，1微升浓度为5微摩尔/升 的上游引物（Prp-F:GCAGAGCAGTCATTATGGCGAAC)，1微升浓度为5微摩尔/升的下游引物 (Prp-R: CCCACTATCAGGAAGATGAGGAAA)和10微升的PCR反应液，最后用去离子水将PCR反应体 系补足至20微升。对照样品的PCR体系基本与待测样品相同，只是模板用1微升去离子水代 替液化的人源血凝块。
[0092] 其中所述的液化血凝块为人类来源，分4个梯度加入，分别为1微升，2微升，3微升 和4微升，对应4种液化血凝块浓度，分别为:5 %，10 %，15 %和20 %。
[0093]其中所述的Prp-F和Prp-R引物的扩增产物长度为750碱基对(bp)。
[0094] 其中的PCR反应液的配方为：三羟甲基氨基甲烷(Tris) :0.012克，硫酸铵：0.004 克，氯化镁：0.0003克，甜菜碱：0.3克，吐温20:0.1 % (W/V)，DMS0:3%，明胶：0.0002% (W/ V)，丙三醇：1 %和dNTPs: 200微摩尔/升和TianRTaq DNA聚合酶:0 · 2单位/微升，调节PCR反 应液的pH值为:9.2，并最终用去离子水定容溶液至1毫升。
[0095] 其中所述的待测DNA聚合酶为TianRTaq，其突变情况为:E641K，Q698E和E708D。
[0096] (2)将PCR反应体系放入PCR仪中，PCR预变性条件为:95摄氏度，3分钟。PCR循环条 件为:94摄氏度，20秒;58摄氏度，30秒;72摄氏度，40秒;循环35次。PCR补充延伸条件为：72 摄氏度，5分钟。最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度）。
[0097] (3)步骤(2)的反应结束后，取10微升反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结 果详见图5。其中，图5是通过本发明以液化的人源血凝块为模板直接进行PCR扩增的电泳检 测图。其中，泳道M:脱氧核糖核酸分子量标准(TIANGEN，Markerm)。泳道1~4:模板液化血 凝块的加入量不同，具体为:泳道1:PCR体系中血凝块模板占比为5%;泳道2:PCR体系中血 凝块模板占比为1 〇 % ;泳道3: PCR体系中血凝块模板占比为15 % ;泳道4: PCR体系中血凝块 模板占比为20 % ;泳道NTC:对照样品PCR扩增的电泳检测图。
[0098] 通过上述实施例结果我们可知，本发明方法适合血凝块实验材料的直接PCR扩增。 [0099] 实施例6
[0100] 通过本发明方法分别对鸡来源和大鼠来源的抗凝血直接进行PCR扩增，并通过后 续的琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。具体的操作步骤如下：
[0101] (1)鸡血模板的PCR反应体系配制。在200微升的离心管中分别配制待测样品和对 照样品的PCR反应体系，每个待测样品的PCR体系的加入组分包括:1~4微升鸡来源的EDTA-21(抗凝血，1微升浓度为5微摩尔/升的上游引物(Ch-F: ATGATATTGCTGCGCTCGTT)，1微升浓度 为5微摩尔/升的下游引物(Ch-R: ACAAAGGCCAAGAAACTACGG)和10微升的PCR反应液，最后用 去离子水将PCR反应体系补足至20微升。对照样品的PCR体系基本与待测样品相同，只是模 板用1微升去离子水代替鸡血。
[0102] (2)大鼠血模板的PCR反应体系配制。在200微升的离心管中分别配制待测样品和 对照样品的PCR反应体系，每个待测样品的PCR体系的加入组分包括：1~4微升大鼠来源的 EDTA-2K抗凝血，l微升浓度为5微摩尔/升的上游引物(Ra-F:AGTTCGCCATGGATGACGATATC)，l 微升浓度为5微摩尔/升的下游引物(Ra-R: GATAGAGCCACCAATCCACA)和10微升的PCR反应液， 最后用去离子水将PCR反应体系补足至20微升。对照样品的PCR体系基本与待测样品相同， 只是模板用1微升去离子水代替大鼠血。
[0103] 其中所述的EDTA-2K抗凝血分为鸡来源和大鼠来源两组，两组均4个梯度加入，分 别为1微升，2微升，3微升和4微升，对应4种液化血凝块浓度，分别为：5%，10%，15%和 20% 〇
[0104] 其中所述的Ch-F和Ch-R引物的扩增产物长度为966碱基对(bp)。
[0105]其中所述的Ra-F和Ra-R引物的扩增产物长度为1066碱基对(bp)。
[0106] 其中的PCR反应液的配方为：三羟甲基氨基甲烷(Tris) :0.012克，硫酸铵：0.004 克，氯化镁：0.0003克，甜菜碱：0.3克，吐温20:0.1 % (W/V)，DMS0:3%，明胶：0.0002% (W/ V)，丙三醇：1 %和dNTPs: 200微摩尔/升和TianRTaq DNA聚合酶:0 · 2单位/微升，调节PCR反 应液的pH值为:9.2，并最终用去离子水定容溶液至1毫升。
[0107] 其中所述的待测DNA聚合酶为TianRTaq，其突变情况为:E641K，Q698E和E708D。
[0108] (3)将PCR反应体系放入PCR仪中，PCR预变性条件为:95摄氏度，3分钟。PCR循环条 件为:94摄氏度，20秒;58摄氏度，30秒;72摄氏度，40秒;循环35次。PCR补充延伸条件为：72 摄氏度，5分钟。最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度）。
[0109] (4)步骤(3)的反应结束后，取10微升反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结 果详见图6。其中，图6是通过本发明分别以鸡来源抗凝血和大鼠来源抗凝血为模板直接进 行PCR扩增的电泳检测图。其中，泳道Μ:脱氧核糖核酸分子量标准(TIANGEN，MarkerΙΠ )。泳 道1~4代表鸡来源抗凝血的加入量不同，具体为:泳道1:PCR体系中鸡血模板占比为5%;泳 道2: PCR体系中鸡血模板占比为10 % ;泳道3: PCR体系中鸡血模板占比为15 % ;泳道4: PCR体 系中鸡血模板占比为20%;泳道5~8代表大鼠来源抗凝血的加入量不同，具体为泳道5:PCR 体系中大鼠血模板占比为5 % ;泳道6: PCR体系中大鼠血模板占比为10 % ;泳道7: PCR体系中 大鼠血模板占比为15 % ;泳道8: PCR体系中大鼠血模板占比为20 % ;泳道NTC:阴性对照样 品。
[0110] 通过上述实施例结果我们可知，本发明方法适合鸡血和大鼠血实验材料的直接 PCR扩增。
[0111] 实施例7:
[0112] 通过本发明方法以土壤样品提取物为模板直接进行PCR扩增，并通过后续的琼脂 糖凝胶电泳检测PCR效果。具体的操作步骤如下：
[0113] (1)在200微升的离心管中分别配制待测样品和对照样品的PCR反应体系，每个待 测样品的PCR体系的加入组分包括:适量的土壤样品提取物，1微升浓度为5微摩尔/升的上 游引物（16S-F:TAGCTGGTCTGAGAGGATGA)，1微升浓度为5微摩尔/升的下游引物（16S-R: CTTGCCAGTATCAGATGCAGT)和10微升的PCR反应液，最后用去离子水将PCR反应体系补足至20 微升。对照样品的PCR体系基本与待测样品相同，只是模板用1微升去离子水代替土壤提取 物。
[0114]其中所述的土壤样品分别为:农田土，山林土和花坛土。
[0115]其中所述的土壤样品提取物为:将三种来源的土壤样品按照质量体积比(W/V)为 1:10的比例与缓冲液TE(三羟甲基氨基甲烷：10毫摩尔/升，乙二胺四乙酸二钠：10毫摩尔/ 升，pH值8.0)混合。震荡混匀后于75摄氏度下处理30分钟。12000转/分钟下离心分离20分 钟，收集的上清液即为土壤样品提取物。
[0116] 其中所述的土壤提取物的加入量为:1~4微升。
[0117] 其中所述的16S-F和16S-R引物的扩增产物长度为700碱基对(bp)。
[0118] 其中的PCR反应液的配方为：三羟甲基氨基甲烷(Tris) :0.012克，硫酸铵：0.004 克，氯化镁：0.0003克，甜菜碱：0.3克，吐温20:0.1 % (W/V)，DMS0:3%，明胶：0.0002% (W/ V)，丙三醇：1 %和dNTPs: 200微摩尔/升和TianRTaq DNA聚合酶:0 · 2单位/微升，调节PCR反 应液的pH值为:9.2，并最终用去离子水定容溶液至1毫升。
[0119] 其中所述的待测DNA聚合酶为TianRTaq，其突变情况为:E641K，Q698E和E708D。
[0120] (2)将PCR反应体系放入PCR仪中，PCR预变性条件为:95摄氏度，3分钟。PCR循环条 件为:94摄氏度，20秒;58摄氏度，30秒;72摄氏度，40秒;循环35次。PCR补充延伸条件为：72 摄氏度，5分钟。最后将反应体系冷却至室温(25摄氏度）。
[0121] (3)步骤(2)的反应结束后，取10微升反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结 果详见图7。图7是通过本发明以土壤提取物为模板直接进行PCR扩增的电泳检测图。其中， 泳道Μ:脱氧核糖核酸分子量标准(TIANGEN，MarkerΙΠ )。泳道1~4: 土壤提取物的加入量分 别为1微升~4微升，PCR扩增的电泳检测结果。具体为：泳道1: 土壤提取物的加入量为1微 升;泳道2: 土壤提取物的加入量为2微升;泳道3: 土壤提取物的加入量为3微升;泳道4: 土壤 提取物的加入量为4微升;泳道NTC:对照样品PCR扩增的电泳检测图。
[0122] 通过上述实施例的结果可知，本发明方法不但可以对血液环境有抗性，同时对多 种土壤环境仍具有抗性，因此，使得本发明方法的应用领域进一步拓宽了。
[0123] 野生型Taq酶氨基酸序列如下：
[0124] MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEA YGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIH VLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTCDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREK ILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVG FVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNT TPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLE VAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELT KLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLCCCDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIEL RVLAHLS⑶ENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFI ERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFP RLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID NO：1)
[0125] TaqR-1酶氨基酸序列如下：
[0126] MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEA YGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIH VLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTCDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREK ILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVG FVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNT TPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLE VAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELT KLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLCCCDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIEL RVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTKTASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFI ERYFESFPKVRAWIQKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFP RLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDffLSAKE(SEQ ID NO：2)
[0127] TianRTaq酶氨基酸序列如下：
[0128] MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEA YGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIH VLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTCDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREK ILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVG FVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNT TPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLE VAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELT KLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLCCCDPNLQNIPVRTPLGQRIRRGFIAEEGWLLVALDYSQIEL RVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTKTASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFI ERYFESFPKVRAWIDKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFP RLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDffLSAKE(SEQ ID NO：3) [0129]在本说明书的描述中，参考术语"一个实施例"、"一些实施例"、"示例"、"具体示 例"、或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特 点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不 必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任 一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技 术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结 合和组合。
[0130] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例 性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述 实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1. 一种Taq DNA聚合酶，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1 相比，具有以下突变： P.E641K; P.Q698E;以及 p.E708Q或p.E708D。2. -种核酸，其特征在于，具有编码权利要求1所述的Taq DNA聚合酶的核苷酸序列， 任选地，所述核酸具有SEQ ID NO:2或3所示的核苷酸序列。3. -种表达载体，其特征在于，携带权利要求2所述的核酸， 任选地，所述表达载体为pET30a质粒。4. 一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞携带权利要求2所述的核酸， 任选地，所述重组细胞为大肠杆菌细胞或其衍生细胞， 任选地，所述重组细胞含有权利要求3所述的表达载体。5. -种制备权利要求4所述的重组细胞的方法，其特征在于，包括： 将权利要求2所述的核酸或者权利要求3所述的表达载体引入宿主细胞中， 任选地，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞或其衍生细胞。6. -种制备权利要求1所述Taq DNA聚合酶的方法，其特征在于，包括： 在适于所述Taq DNA聚合酶表达的条件下，培养权利要求4所述重组细胞或者利用权利 要求5所述方法获得的所述重组细胞；以及 从培养后的重组细胞中分离获得所述Taq DNA聚合酶。7. 权利要求1所述Taq DNA聚合酶在扩增DNA样本中的用途， 任选地，所述DNA样本包含在血液样品或者土壤样品中。8. -种PCR反应液，其特征在于，基于1毫升所述PCR反应液，所述PCR反应液包含： 三羟甲基氨基甲烷0.01~0.013克； 硫酸铵0.003~0.005克； 氯化镁0.0002~0.0004克； 甜菜碱0.2~0.35克； 吐温-20 0.05%~0.2%; DMSO 1%~5%; 明胶0.0001%~0.0005%;以及 丙三醇0.05%~2%， 所述PCR反应液的pH值为:8.8~9.5， 任选地，所述PCR反应液进一步包括dNTPs和权利要求1中所述Taq DNA聚合酶，其中， dNTPs的浓度为200微摩尔/升，所述Taq DNA聚合酶的浓度为0.05~0.25单位/微升。9. 权利要求8所述PCR反应液在DNA样本扩增中的用途， 任选地，所述DNA样本包含在血液或者土壤样品中。10. -种扩增DNA样本的方法，其特征在于，包括： 采用权利要求1所述Taq DNA聚合酶、权利要求8所述PCR反应液、dNTPs、引物和含有所 述DNA样本的样品，进行PCR反应，以便获得经过扩增的所述DNA样本， 任选地，所述含有所述DNA样本的样品包括:抗凝剂处理过的抗凝血、液化血凝块、干血 斑、土壤样品。
【文档编号】C12N15/10GK105907734SQ201610262797
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年4月25日
【发明人】张双宇, 刘玉方, 李晓晨, 孙克非
【申请人】天根生化科技（北京）有限公司