一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法
【专利摘要】一种测定大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b毒性的分子方法，包括以下步骤：将待检测大豆疫霉菌接种于大豆叶片上，12小时后提取待检测大豆疫霉菌的总RNA；以提取的总RNA为模版进行逆转录，得到cDNA反应液；采用毒性检测引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R，以所得cDNA反应液为模版进行实时荧光定量PCR，如果在实时荧光定量PCR扩增过程中能够检测到无毒基因Avr1b?1的转录，则对应的待检测大豆疫霉菌为无毒菌株，否则为毒性菌株。本发明能够快速准确的测定出待检测大豆疫霉菌对抗病基因Rps1b的毒性，并为大量、快速和准确鉴定大豆疫霉菌的生理小种或致病型提供有力支持。
【专利说明】
_种测定大S·疫霉菌对抗病基因 Rps1 b毒性的分子方法
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一种分子测定方法，尤其涉及一种测定大豆疫霉菌对抗病基因 Rpslb 毒性的分子方法。
【背景技术】
[0002] 大豆疫霉菌是一种大豆上的重要病原菌，属于茸鞭生物界卵菌门卵菌纲霜霉目腐 霉科疫霉属，该菌能够侵染大豆引起大豆苗期的猝倒和成株期的根腐，称为大豆疫霉根腐 病。利用抗病品种、药剂拌种和土壤排水3种方法是控制大豆疫霉根腐病病害的发生的有效 措施，其中利用抗病品种防治该病害是最重要也是最基本的一种方法，而监测大豆疫霉菌 的毒力结构或小种组成是有效利用抗病品种进行防治的关键。大豆疫霉菌生理小种的测定 通常采用国际通用的鉴别寄主通过下胚轴创伤接种法来进行。目前，已鉴定并命名55个生 理小种，但更多的未被命名的新生理小种不断出现，使监测大豆疫霉菌群体的生理小种组 成变化显得尤为重要。
[0003] 目前大豆疫霉菌对抗病基因的毒性主要采用下胚轴创伤接种法来进行测定。这种 生物测定方法简单易行，但也存在着一些缺点，首先是这种方法需要使用大量的鉴别寄主 大豆种子，因此鉴别寄主大豆每年都必须进行大量的扩繁;其次是需要一个能够严格控制 温度、湿度和光照的温室，如果实验条件控制不严将会导致鉴别寄主大豆抗感反应不清楚 而出现大量的中间类型，甚至出现错误的实验结果；另外，生物测定方法的实验周期较长， 从种植鉴别寄主、接种大豆疫霉菌到出现清晰的抗感反应，一个实验流程完成需要约2周时 间，如果大量出现中间类型，还需要不断的重复实验，则需要更长的时间。
[0004] 2006年大豆疫霉菌的全基因组测序工作圆满完成，这大大促进了大豆疫霉菌无毒 基因的定位和克隆。目前已有Avrlb-1、Avrla、Avr3a、Avr3c、Avr4/6、Avr3b、Avrlk^PAv;rld 等8个无毒基因被克隆出来，这些无毒基因的克隆为采用分子生物学的方法来鉴定大豆疫 霉菌的生理小种提供了可能。研究发现，病原菌的无毒基因在抗病基因的选择压力下可以 通过不转录无毒基因的方式来逃避抗病基因的识别，从而成功侵染宿主植物。Avrlb-Ι是大 豆疫霉菌中克隆出来的第一个无毒基因，该基因在中国群体中的序列多态性和转录情况已 被详细研究，序列多态性研究共发现4种不同类型的序列和1种片段替换的情况，转录分析 显示:在侵染过程中不转录无毒基因 Avrlb-Ι的菌株均为毒性菌株;在侵染过程中转录无毒 基因 Avrlb-Ι的菌株中，仅有无毒基因 Avrlb-Ι碱基序列为第Π 种类型的菌株为毒性菌株。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种测定大豆疫霉菌对抗病基因 Rpslb毒性的分子方法， 该方法能够快速准确的测定出待检测大豆疫霉菌对抗病基因 Rps lb的毒性，并为大量、快速 和准确鉴定大豆疫霉菌的生理小种或致病型提供有力支持。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种测定大豆疫霉菌对抗病 基因 Rpslb毒性的分子方法，包括以下步骤:将待检测大豆疫霉菌接种于大豆叶片，12小时 后提取待检测大豆疫霉菌的总RNA;以提取的总RNA为模版进行逆转录，得到cDNA反应液;采 用毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R，以所得cDNA反应液为模版进行实时荧光定量PCR，如 果在实时荧光定量PCR扩增过程中能够检测到无毒基因 Avrlb-Ι的转录，则对应的待检测大 豆疫霉菌为无毒菌株，否则为毒性菌株;所述毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R的核苷酸序 列如下： AVR1BR2F: 5z-GAGCTCATGAAGAGGACGAT-3z (如序列表中的序列 1); AVR1BR2R: 5 z-TCTTATCCAGGCTGTACCCC-3 z (如序列表中的序列2)。
[0007] 进一步地，所述提取待检测大豆疫霉菌的总RNA的步骤为:将待检测大豆疫霉菌在 10%V8液体培养基上培养5天；用灭菌双层纱布过滤收集培养5天的大豆疫霉菌丝体，用蒸 馏水冲洗3次后紧贴在大豆叶片的正反面，保湿培养12h，然后用滤纸吸干水份放入研钵中 加液氮研碎，采用总RNA提取试剂盒提取待检测大豆疫霉菌的总RNA;所述的10 % V8液体培 养基通过以下方式制得:在每100mL用纱布过滤后的V8蔬菜汁中加入0.2g碳酸钙，加蒸馏水 补足至lOOOmL，分装在三角瓶中，121°C灭菌20min。
[0008] 进一步地，所述逆转录的反应体系及操作程序为:在PCR管中加入提取的总RNA2y 1，逆转录引物01ig〇dT( 18) ΙμL，浓度为10mmol/L的dNTP ΙμL，重蒸水8μ1，通过离心使总 RNA、逆转录引物01igodT(18)、dNTP和重蒸水充分混匀，65°C加热5min后冰置5min;继续向 PCR管中加入5XFirst Strand Buffer 4yl，0.1mol/L的二硫苏糖醇2yl，RNA酶抑制剂ΙμL， 混匀后37°C反应2min，迅速加入ΙμL逆转录酶在50°C条件下反应50min;最后在70°C加热 5min终止反应;冷却后得到cDNA反应液，置于-20°C保存备用。
[0009] 进一步地，以大豆疫霉菌的ActinA为内标基因进行实时荧光定量PCR，内标基因特 异性引物ACTAF/ACTAR的核苷酸序列分别为： ACTAF: 5 z -ACTGCACCTTCCAGACCATC-3 z (如序列表中的序列 3) ACTAR: 5 z-CCACCACCTTGATCTTCATG-3 z (如序列表中的序列4)。
[0010] 进一步地，所述实时荧光定量PCR的反应体系和条件为： 反应体系:PCR反应混合液1 OyL，1 Ομπιο 1 /L毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R各0.4yL， cDNA反应液2yL，双蒸馏水7 · 2yL; 反应条件:95 °C预热2min;然后95 °C变性15s，60 °C退火30s，40个循环。
[0011]检测原理及有益效果： 在侵染过程中不能正常转录无毒基因 Avrlb-Ι的菌株，经提取侵染过程中的待检测大 豆疫霉菌的总RNA并逆转录，得到的cDNA反应液中必然不含无毒基因 Avrlb-Ι，因此在后续 实时荧光定量PCR过程中也检测不到无毒基因 Avrlb-Ι的转录;在侵染过程中能正常转录无 毒基因 Avrlb-Ι的菌株，经提取侵染过程中的待检测大豆疫霉菌的总RNA并逆转录，得到的 cDNA反应液中必然含有无毒基因 Avrlb-Ι，采用毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R进行实时 荧光定量PCR，毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R能够与第I种和第IV种类型的无毒基因 Avrlb-Ι相结合而不能与第Π 种类型的无毒基因 Avrlb-Ι相结合，从而使携带第Π 种类型无 毒基因 Avrlb-Ι的菌株在实时荧光定量PCR检测不到无毒基因 Avrlb-Ι的转录;本发明通过 提取侵染过程中的待检测大豆疫霉菌的总RNA、逆转录、实时荧光定量PCR等步骤，并根据实 时荧光定量PCR过程中能否检测到无毒基因 Avrlb-Ι的转录来间接判断大豆疫霉菌对抗病 基因 Rpslb的毒性，因此，本发明提供的分子方法仅需要少量的感病大豆，检测时间较短(一 般5天左右即可完成），测定过程中不出现中间类型，从而避免进行不断的重复实验来消除 中间类型，而且具有很高的准确性，适合大量、快速、准确的大豆疫霉菌毒性测定。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明涉及的四种类型无毒基因 Rpslb的核苷酸序列及特异性引物结合位 点示意图；图中四种类型无毒基因 Rpslb的核苷酸序列按I、n、m、IV依次对应序列表中的 序列5、序列6、序列7、序列8;图中的点表示与第I种序列对应的核苷酸相同； 图2是本发明具体实施例18株大豆疫霉菌实时荧光定量PCR分析结果示意图；横坐标表 示不同的菌株，纵坐标表示相对表达量，其中将菌株PS0301对应的表达量标定为1; 图3是本发明试验二6株大豆疫霉菌使用毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R进行试验得 到的实时荧光定量PCR分析结果示意图；横坐标表示不同菌株，纵坐标表示相对表达量，其 中将菌株PS0702的表达量标定为1;图中A表示对应的菌株为无毒菌株，V表示对应的菌株为 毒性菌株； 图4是是本发明试验二6株大豆疫霉菌使用通用转录分析引物AVR1BR1F/AVR1BR1R进行 试验得到的实时荧光定量PCR分析结果示意图；横坐标表示不同菌株，纵坐标表示相对表达 量，其中将菌株PS0702的表达量标定为1;图中A表示对应的菌株为无毒菌株，V表示对应的 菌株为毒性菌株。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0014] 实施例 待检测大豆疫霉菌:18株菌株(其菌株分离年份及碱基序列的类型如表1);这些菌株均 为采用大豆叶碟诱捕法从中国大豆田土壤中分离，然后经过单孢分离进行纯化，转接于 10 % V8斜面培养基上12 °C下保存的菌株;所述的10 % V8斜面培养基通过以下方式制得，在 每100mL用纱布过滤后的V8蔬菜汁中，加入0.2g碳酸钙和15g琼脂粉，加蒸馏水补足至 1000mL，加热使琼脂完全融化，然后分装在三角瓶中，121°C灭菌20min; 一种测定大豆疫霉菌对抗病基因 Rpslb毒性的分子方法，分别对18株待检测大豆疫霉 菌菌株进行测定，具体测定方法包括以下步骤： 步骤一、提取待检测大豆疫霉菌的总RNA 将待检测大豆疫霉菌在10%V8液体培养基上培养5天;用灭菌双层纱布过滤收集培养5 天的大豆疫霉菌丝体，用蒸馏水冲洗3次后紧贴在大豆叶片（大豆品种为Williams)的正反 面，保湿培养12h，然用滤纸吸干水份放入研钵中加液氮研碎，采用TRNzol总RNA提取试剂盒 提取待检测大豆疫霉菌的总RNA;所述的10%V8液体培养基通过以下方式制得:在每100mL 用纱布过滤后的V8蔬菜汁中加入0.2g碳酸钙，加蒸馏水补足至1000mL，分装在三角瓶中， 121°C 灭菌 20min; 步骤二、逆转录 在PCR管中加入提取的总RNA2yl，逆转录引物01igodT(18)lyl (逆转录引物OligodT (18)为逆转录PCR常用的市场常见的引物溶液），浓度为1 Ommo 1 /L的dNTP 1 μ 1，重蒸水8μ 1， 通过离心使总RNA、逆转录引物01igodT(18)、dNTP和重蒸水充分混匀，65°C加热5min后迅速 冰置5min;继续向PCR管中加入5XFirst Strand Buffer 4yl，0.1mol/L的二硫苏糖醇 (DTT)2yl，RNA酶抑制剂(RNasin)lyl，混匀后37°C反应2min，迅速加入ΙμL逆转录酶(M-MLV) 在50 °C条件下反应50min;最后在70 °C加热5min终止反应;冷却后得到cDNA反应液，置于-20 °C保存备用；OligodT 18、5XFirst Strand Buffer和二硫苏糖醇均购自上海索莱宝生物 科技有限公司，dNTP和RNA酶抑制剂购自宝生物工程(大连)有限公司； 步骤三、实时荧光定量PCR 以大豆疫霉菌的ActinA为内标基因，内标基因引物ACTAF/ACTAR的核苷酸序列分别为： ACTAF: 5 z-ACTGCACCTTCCAGACCATC-3 z (如序列表的序列3)， ACTAR: 5z-CCACCACCTTGATCTTCATG-3z (如序列表的序列4); 实时荧光定量PCR的反应体系:PCR反应混合液(SYBR Green PCR Master Mix，宝生物 工程有限公司）10yL，ΙΟμ mol/L毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R各0.4yL，cDNA反应液2yL， 双蒸馏水7.2yL; 实时荧光定量PCR的反应条件:95°C预热2min;然后95°C变性15s，60°C退火30s，40个循 环;所用试剂为SYBR Premix Ex Taq(宝生物工程（大连)有限公司）；所述毒性检测引物 AVR1BR2F和AVR1BR2R的碱基序列分别如序列表的序列1和序列2所示； 实时焚光定量PCR完成后使用ABI 7300Sequence Detection System软件进行分析，分 析结果如图2所示； 从图2中可以看出：菌株？80301、？80701、？80702、？80705、？80708和？80704对应的实时 荧光定量PCR检测结果中，能够检测到无毒基因 Avrlb-Ι的转录，因此这些菌株为无毒菌株 (即菌株能够引起抗病基因 Rpslb的抗病反应，对携带抗病基因 Rpslb的寄主植物L77-1863 表现为不致病）；菌株Ps0403、Ps0303、Ps0716、Ps0710、Ps0302、Ps0404、Ps0405、Ps0719、 Ps0709、Ps0712、Ps0714和Ps0720对应的实时荧光定量PCR检测结果中，不能够检测到无毒 基因 Avrlb-Ι的转录，因此这些菌株为毒性菌株（即菌株不能够引起抗病基因 Rpslb的抗病 反应，对携带抗病基因 Rpslb的寄主植物L77-1863表现为致病）。
[0015]试验一 采用下胚轴创伤接种法测定实施例中18株大豆疫霉菌株对鉴别寄主L77-1863(仅带有 抗病基因 Rpslb)的致病性(即对抗病基因 Rpslb的毒性），其实验步骤包括:将在V8培养基平 板上培养7天的大豆疫霉菌株切成2mmX 3mm的小块作为接种体;用解剖刀在种植7天的大豆 幼苗子叶下lcm处向下划约0.5cm长的伤口，然后将接种体菌丝面朝内贴在伤口处。接种后 保湿12h，然后放入24-28°C、14h光照/10h黑暗的温室中，5天后调查结果；以Williams(不带 任何抗病基因）为感病对照，每个鉴别寄主接种10株，以植株死亡率作为抗感的分类标准， 植株死亡率<30 %，记为抗病；植株死亡率多70 %，记为感病；植株死亡率在30 %-70 %之 间，记为中间类型，试验重复2次，各菌株的抗病反应见表1; 表1本试验所用18株大豆疫霉菌菌株
比较本试验与实施例中两种测定大豆疫霉菌对抗病基因 Rpslb毒性的方法测定的结 果，结果表明上述两种测定方法测定大豆疫霉菌对抗病基因 Rpslb毒性的结果完全相同，说 明本发明提供的分子测定方法是准确可靠的。
[0016]试验二 分别对 6 株大豆疫霉菌（菌株？80702、？80708、？80709、？80403、？80405、？80404，分离年 份及碱基序列类型见表1，分离方法与实施例中的分离方法相同）进行如实施例中的步骤： 提取浸染过程中的待检测大豆疫霉菌的总RNA、逆转录、实时荧光定量PCR;实验组的步骤与 实施例中的步骤完全相同，在逆转录PCR中使用毒性检测引物AVR1BR2F/AVR1BR2R，其实时 荧光定量PCR结果如图3所示;对照组的步骤与实施例中的步骤区别仅在于，在逆转录PCR中 使用通用转录分析引物AVR1BR1F(如序列表的序列9)/AVRlBRlR(如序列表的序列10)，其实 时荧光定量PCR结果如图4所示;本试验中使用的引物如表2; 表2实时荧光定量PCR所用引物
结合表1和表2,比较图3和图4,可以看出采用通用转录分析引物AVR1BR1F/AVR1BR1R进 行实时荧光定量RT-PCR时，毒性菌株Ps0405正常转录无毒基因 Avrlb-Ι;而采用毒性检测引 物AVR1BR2F/AVR1BR2R时，毒性菌株Ps0405表现为不转录无毒基因 Avrlb-Ι，从而使2种类型 的无毒菌株Ps0702(I)和Ps0708〇V)表现为正常转录无毒基因 Avrlb-Ι，而4种类型的毒性 菌株Ps0709(I)、Ps0403(IV)、Ps0405( Π )和Ps0404(III)均表现为不转录无毒基因 Avrlb-1， 进而成功将毒性菌株与无毒菌株区分开。
【主权项】
1. 一种测定大豆疫霉菌对抗病基因沿Λ5Μ毒性的分子方法，其特征在于：包括以下步 骤:将待检测大?疫霉囷接种于大?叶片上，12小时后提取待检测大?疫霉囷的总RNA;以 提取的总R N A为模版进行逆转录，得到c D N A反应液；采用毒性检测引物A V RIB R 2 F / AVR1BR2R，以所得cDNA反应液为模版进行实时荧光定量PCR，如果在实时荧光定量PCR扩增 过程中能够检测到无毒基因的转录，则对应的待检测大豆疫霉菌为无毒菌株，否则 为毒性菌株;所述毒性检测引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R的核苷酸序列如下： AVR1BR2F:5 z-GAGCTCATGAAGAGGACGAT-3 ζ; AVR1BR2R:5Z-TCTTATCCAGGCTGTACCCC-3Z。2. 根据权利要求1所述的一种测定大豆疫霉菌对抗病基因你 W/;毒性的分子方法，其特 征在于:所述提取待检测大豆疫霉菌的总RNA的步骤为： 将待检测大豆疫霉菌在10%V8液体培养基上培养5天；用灭菌双层纱布过滤收集培养5 天的大豆疫霉菌丝体，用蒸馏水冲洗3次后紧贴在大豆叶片的正反面，保湿培养12小时，然 后用滤纸吸干水份放入研钵中加液氮研碎，采用总RNA提取试剂盒提取待检测大豆疫霉菌 的总RNA;所述的10%V8液体培养基通过以下方式制得:在每IOOmL用纱布过滤后的V8蔬菜汁 中加入〇.2g碳酸f丐，加蒸馏水补足至1000 mU分装在三角瓶中，121°C灭菌20 min。3. 根据权利要求1所述的一种测定大豆疫霉菌对抗病基因你毒性的分子方法，其特 征在于:所述逆转录的反应体系及操作程序为： 在PCR管中加入提取的总RNA 2μ1，逆转录引物OligodT(IS)IlIl，浓度为lOmmol/L的 dNTP ΙμL，重蒸水8μ1，通过离心使总RNA、逆转录引物01igodT(18)、dNTP和重蒸水充分混 勾，65°C 加热 5 min 后冰置 5 min;继续向 PCR 管中加入 5XFirst Strand Buffer 4 μL， 0. lmol/L的二硫苏糖醇2μ1，RNA酶抑制剂ΙμL，混勾后37°C反应2 min，迅速加入ΙμL逆转录 酶在50°C条件下反应50 min;最后在70°C加热5 min终止反应;冷却后得到cDNA反应液，置 于-20 °C保存备用。4. 根据权利要求1所述的一种测定大豆疫霉菌对抗病基因你 W/;毒性的分子方法，其特 征在于：以大?疫霉菌的ActinA为内标基因进彳丁实时焚光定量PCR，内标基因特异性引物 ACTAF/ ACTAR的核苷酸序列分别为： ACTAF:5 ζ-ACTGCACCTTCCAGACCATC-3 ζ; ACTAR:5 ζ-CCACCACCTTGATCTTCATG-3 ζ。5. 根据权利要求4所述的一种测定大豆疫霉菌对抗病基因你毒性的分子方法，其特 征在于:所述实时荧光定量PCR的反应体系和条件为： 反应体系：PCR反应混合液IOyL，ΙΟμ mol/L毒性检测引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R各0.4yL， cDNA反应液2yL,双蒸馏水7.2yL; 反应条件:95 °C预热2min;然后95 °C变性15s，60 °C退火30s，40个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK105907863SQ201610297980
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月6日
【发明人】王源超, 崔林开, 王晓莉, 董莎萌, 郑小波
【申请人】南京农业大学