源于骨髓神经嵴细胞的施旺氏祖细胞及其在促进神经再生中的应用

源于骨髓神经嵴细胞的施旺氏祖细胞及其在促进神经再生中的应用【专利摘要】本发明涉及组织工程
技术领域：
，具体涉及一种源于骨髓神经嵴细胞的施旺氏祖细胞及其在促进神经再生中的应用。本发明提供了一种大鼠骨髓源神经嵴祖细胞N1，保藏号为CCTCCNO：C201647，即BM?NCC克隆N1，具备施旺氏祖细胞(SCP)的性能。本发明还提供了BM?NCC克隆N1的传代培养方法，以及向施旺氏细胞(SC)定向诱导分化的方法。本发明的BM?NCC克隆N1有望应用于细胞为基础的促神经再生治疗。CCTCCNO：C20164720160416【专利说明】源于骨髓神经嵴细胞的施旺氏祖细胞及其在促进神经再生中的应用
技术领域：
[0001]本发明涉及组织工程
技术领域：
，具体涉及一种源于骨髓神经嵴细胞的施旺氏祖细胞及其在促进神经再生中的应用。【
背景技术：
】[0002]在神经系统中，施旺氏细胞(Schwanncell，SC)是周围神经系统的胶质细胞，在轴突成髓鞘、周围神经元的组织化、神经元正常功能的维持、突触的形成以及对神经损伤和神经痛的反应等方面起着关键的作用。在周围神经损伤后的WalIerian变性阶段，SC去分化为未成熟SC或前体样SC，参与髓磷脂和轴突碎片的清除，产生多种生长因子和细胞因子，增殖并迀移形成利于轴突再生长的Bungner带，最后又重新分化为成熟的成髓鞘SC支持轴突重新形成髓鞘。目前，基于SC的神经组织工程具有很多应用目标，包括周围神经疾病或损伤的治疗，中枢神经系统(CNS)疾病的治疗潜能，以及SC相关疾病体外模型阶段的治疗。然而SC的来源和纯度仍然限制着其在细胞治疗方面的应用。[0003]施旺氏祖细胞(Schwanncellprecursor，SCP)代表着施旺氏细胞的早期阶段。在脊椎动物的发育过程中，SCP和未成熟的SC起源于迀移的神经嵴细胞(neuralcrestcell，NCC)，到成体阶段神经嵴组织就消失了。将从胚胎周围神经富集的SCP和成熟的SC移植到CNS后，前者比后者具有更好的生存和迀移能力。SCP也可以分化为成髓鞘的中枢胶质细胞修复大脑损伤。此外，在肠神经系统的出生后神经发生中还发现有SCP向神经元的分化。[0004]目前，已经有多种不同的外源性干细胞类型被用来衍生SC，包括胚胎干细胞和诱导多能干细胞[MaMS,BoddekeE,CoprayS.PluripotentstemcellsforSchwanncellengineering.StemCellRev.2015；11:205-18.][Liff,HuangL,Linff,KeQ1ChenR,LaiXjetal.EngraftableneuralcreststemcelIsderivedfromcynomolgusmonkeyembryonicstemcells.B1materials.2015；39:75-84.][LiuQjSpustaSC,MiR，LassiterRNjStarkMRjHokeA,eta1.HumanneuralcreststemcellsderivedfromhumanESCsandinducedpluripotentstemcells:1nduct1n,maintenance,anddifferentiat1nintofunct1nalschwanncells.StemCellsTranslMed.2012；1:266-78.][RenYJ,ZhangSjMiRjLiuQjZengXjRaoM,etal.Enhanceddifferentiat1nofhumanneuralcreststemcellstowardstheSchwanncelllineagebyalignedelectrospunfibermatrix.ActaB1mater.2013；9:7727-36.][WangAjTangZjParkIHjZhuYjPatelSjDaleyGQ,etal.1nducedpluripotentstemcellsforneuraltissueengineering.B1materials.2011;32:5023_32.]，均显不出它们对受损神经元的修复作用。事实上，成体干细胞在体外具有多系分化潜能，而且它们能从自体获得，可避免免疫排斥作用和伦理问题的困扰，因此成体干细胞看来是更具前景的可替代SC来源的细胞类型，包括间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)和迀移后NCC[NeirinckxV,CosteCjRogisterB,Wislet-GendebienS.Concisereview:adultmesenchymalstemcells,adultneuralcreststemcells,andtherapyofneurologicalpathologies:astateofplay.StemCellsTranslMed.2013；2:284-96.]o[0005]已有报道，迀移后NCC和衍生的SC可从背根神经节(DRG)获得[NagoshiNjShibataS,KubotaY,NakamuraMjNagaiY,SatohE，etal.0ntogenyandmultipotencyofneuralcrest-derivedstemcellsinmousebonemarrow,dorsalrootganglia,andwhiskerpad.CellStemCell.2008;2:392-403][LiHY,SayEHjZhouXF.1solat1nandcharacterizat1nofneuralcrestprogenitorsfromadultdorsalrootganglia.StemCells.2007；25:2053-65.][VidalMjManiglierMjDebouxCjBachelinC，ZujovicVjBaron-VanEvercoorenA.AdultDRGStem/ProgenitorCellsGeneratePericytesinthePresenceofCentralNervousSystem(CNS)DevelopmentalCues,andSchwannCellsinResponsetoCNSDemyelinat1n.StemCells.2015；33:2011-24.][ZujovicV,ThibaudJ,BachelinC,VidalM,CoulpierF,CharnayP,etal.BoundarycapcellsarehighlycompetitiveforCNSremyelinat1n:fastmigrat1nandefficientdifferentiat1ninPNSandCNSmyelin-formingcells.StemCells.2010;28:470-9.]，还可从受损的或完好的周围神经富集培养出多潜能的Schwann细胞球[TakagiTjIshiiK,ShibataS,YasudaA,SatoMjNagoshiN,etal.Schwann-spheresderivedfrominjuredperipheralnervesinadultmice—theirinvitrocharacterizat1nandtherapeuticpotential.PLoSOne.2011；6:e21497.][MartinI,NguyenTD,KrelIVjGreinerJF,MulIerJ,HauserS,etal.Generat1nofSchwanncell-derivedmultipotentneurospheresisolatedfromintactsciaticnerve.StemCellRev.2012;8:1178-87.]，具有着NCC的身份和向SC定向分化的潜能，这些Schwann细胞球可为神经再生提供自体细胞来源，但相应的活检手段对供体神经所导致的损伤，事实上对于转化医学来说是不现实的。所以，学者们旨在寻找到可获取成体NCC和衍生SC的非神经组织来源。有最新报道[Mendez-Fe^erSjMichurinaTVjFerraroF,MazloomAR,MacarthurBDjLiraSA，etal.Mesenchymalandhaematopoieticstemcellsformauniquebonemarrowniche.Nature.2010；466:829-34.][IsernJ,Martin-Anton1BjGhazanfariRjMartinAMjLopezJA，delToroR，etal.Self-renewinghumanbonemarrowmesenspherespromotehematopoieticstemcellexpans1n.CellRep.2013;3:1714-24.][IsernJjGarcia-GarciaAjMartinAM，ArranzL,Martin-PerezD,TorrojaC,etal.Theneuralcrestisasourceofmesenchymalstemcellswithspecializedhematopoieticstemcellnichefunct1n.Elife.2014;3:e03696.]，发现Nestin阳性的骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcell，BMSC)与神经嵴来源的SCP具有共同的神经-上皮发育起源，而且这两种细胞可能同时居留在长骨骨髓，共同建立了造血干细胞的微环境；体外培养时，这些Nestin阳性，血小板源生长因子受体(PDGFR)阴性的BMSC可形成具有自我更新能力和多分化潜能的细胞球，而且这些间充质球(Mesensphere)中包含有神经嵴干细胞(neuralcreststemcell，NCSC)和神经嵴祖细胞(neuralcrestprecursor，NCP)，并由此进一步推断骨髓中有着SCP细胞群的居留。[0006]尽管BMSC是众所周知的高异质性细胞群，本发明人所在的课题组前期研究工作已表明[ShiH,ZhangT1QiangL,ManL,ShenY,DingF.Mesenspheresofneuralcrest-derivedcellsenrichedfrombonemarrowstromalcellsubpopulat1n.NeurosciLett.2013;532:70-5.],通过条件培养，可以从骨髓中应答表皮生长因子/成纤维细胞生长因子的BMSC(EGF/FGF2-responsiveBMSC，E/Fr_BMSC)亚群募集到悬浮生长的间充质细胞球(Mesensphere)，即居留于骨髓的迀移后NCC，关键在于，骨髓源神经嵴细胞(bonemarrowderivedneuralcrestcell，BM_NCC)具有自我更新能力和定向分化为神经元和胶质细胞的潜能。【
发明内容】[0007]本发明的目的在于提供一种BM-NCC克隆NI，以及BM-NCC克隆NI的传代培养方法、向SC诱导分化的方法，以及BM-NCC克隆NI在制备促进神经再生药物中的应用。[0008]本发明旨在探究如何从BM-NCC衍生SCP。于是，我们在获得大鼠BM-NCC后，分离出多个可以冻存和复苏的细胞克隆，然后通过实验表明BM-NCC克隆可被诱导分化为SlOOi^H性的SC，而其中的NI克隆的细胞所衍生的SC纯度高于其它细胞克隆，无须基因调控或进一步纯化，NI细胞衍生的SC还具有体外成髓鞘潜能。[0009]检测结果还表明，在蛋白水平和mRNA水平，NCC标志在NI细胞高表达，而在衍生的SC表达下调;在衍生的SC，与SC分化状态有关的SC标志则上调。我们进一步用NI细胞的条件培养基(Nl-CM)，即细胞培养液上清处理氧糖剥夺(O⑶)损伤后的DRG神经元，神经元的存活和轴突的生长均得到改善;另外，我们将NI细胞注射入挤压损伤后的大鼠坐骨神经，结果显示NI细胞比NI细胞衍生的SC(NlderivedSchwanncell，Nl-d_SC)具有更好的促神经再生和功能修复作用，表明NI细胞在体内外均可促进受损神经元的修复。本发明表明NI细胞可被认定为SCP身份(或未分化的SCP样状态)，源于BM-NCC的SCP有望将来应用于细胞为基础的促神经再生治疗。[0010]本发明的第一方面，提供了一种大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI，保藏号为CCTCCNO:C201647。[0011]本发明所述的大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI，即BM-NCC克隆NI，具备施旺氏祖细胞(SCP)的性能。[0012]本发明实验结果表明:N1克隆相比于同时获得的其它BM-NCC克隆(如N3、N4和N13)，具有最强的向SC分化的潜能，定向诱导分化后S100即日性的SC比率达到95%以上，不需要后续的细胞分选步骤；同时，显示具有胶质细胞分化潜能的NCC标志CD44、HES1和S0X10，其mRNA表达水平在NI克隆高于其它的BM-NCC克隆(如N4);而显示具有神经元分化潜能的NCC标志WNTl、ID2、p75NTR和CXCR4，其mRNA表达水平在NI克隆则低于其它的BM-NCC克隆(如N4)。[0013]本发明的第二方面，还提供了BM-NCC克隆NI的传代培养方法。[0014]所述的传代培养方法，是将保藏号为CCTCCN0:C201647的细胞复苏后，培养至大多数细胞球增大而球中心细胞开始发暗时，用accutase酶将细胞球消化为单细胞悬液，然后细胞按<14个/ml的密度接种到细胞培养板，进行成球传代培养，每周半量换液2次;每7?14d传代I次，或根据需要传代。[0015]本发明的第三方面，还提供了BM-NCC克隆NI向施旺氏细胞(SC)定向诱导分化的方法。[0016]所述的定向诱导分化方法，是将保藏号为CCTCCN0:C201647的细胞复苏后，培养至对数生长期，分离为单个细胞，并接种到层黏连蛋白/多聚赖氨酸(laminin/PLL)包被的培养板上，用SC定向诱导分化液孵育培养，即含5%胎牛血清(FBS)、35ng/ml全反式视黄酸(tRA)、5yMforskolin、200ng/mlHRG-Ιβ、10ng/mlFGF2、10ng/mlPDGF-AA和I%N2的DMEM/F12(v/v，l:1)培养液，每2?3d换液I次。[0017]本发明提供了一种简单高效的方法，此诱导分化方案对BM-NCC克隆在2d内即开始起效，最长不超过I周。[0018]本发明的第四方面，还提供了BM-NCC克隆NI在制备促进神经再生药物中的应用。[0019]所述的应用具体为细胞为基础的治疗，本发明的BM-NCC克隆NI为促进受损神经再生的研究提供了无限的细胞来源。[0020]所述的细胞为基础的治疗采用方式可以为局部注射入受损组织、静脉注射或用于制备组织工程神经移植物行局部植入等。[0021]所述的药物可以为细胞悬液、细胞的条件培养基、细胞分泌的因子、细胞分泌的囊泡(外泌体等)或细胞分泌的囊泡(外泌体等)提取物等。[0022]本发明的具体技术方案如下:[0023]我们培养了BM-NCC和分离获取了BM-NCC单细胞克隆，检测了它们的NCC标志的表达和自我更新能力。根据各个BM-NCC克隆向SC分化的效率，我们选择了NI克隆作为进一步研究的细胞亚群。NI细胞与胚胎DRG神经元共培养，以检测NI细胞的成髓鞘潜能，结果表明NI细胞可衍生SC并在体外促进轴突的成髓鞘。Nl-CM用来处理O⑶损伤的DRG神经元，结果表明可改善DRG神经元的存活和轴突生长状况。此外，NI细胞或Nl-d-SC分别被移植入夹伤的大鼠坐骨神经，结果表明可促进坐骨神经的再生和功能的恢复。[0024]已有研究者分析了来源于成年小鼠骨髓的MSC和NCC的相似与差别。还有研究者通过Wntl和BMP2的作用，从成人BMSC富集到NCC单细胞克隆，尽管实验表明Nestin/SOXlO/P75NTR阳性的骨髓细胞，可能是具有向神经元和胶质细胞分化潜能的NCC，但是从不同的克隆分化的细胞中GFAP或Tujl阳性细胞的百分比各不相同，一些克隆倾向于衍生胶质细胞(GFAP阳性细胞)，而另一些克隆倾向于衍生神经元细胞(Tujl阳性细胞)。与此类似，本发明中我们分离获取了多个BM-NCC单细胞克隆，并且发现4个克隆的细胞分化为SC的比率各不相同。结果表明NI克隆具有最强的向SC分化的能力，显示SC分化潜能的NCC标志⑶44、HES1和S0X10的mRNA表达水平在NI高于其它的BM-NCC克隆(如N4)，而显示神经元分化潜能的NCC标志WNTl、ID2、p75NTR和CXCR4的mRNA表达水平在NI则低于其它的BM-NCC克隆(如N4)。[0025]为诱导NI细胞向SC分化，运用了laminin/PLL基质表面和明确的一组细胞因子。分化过程中，我们并未观察到之前有文献报道的短暂呈现的扁平上皮样细胞形态[LobsigerCS,SmithPMjBuchstallerJjSchweitzerBjFranklinRJjSuterU,etal.SpL201:acondit1nalIyimmortalizedSchwanncellprecursorlinethatgeneratesmyelin.Glia.2001;36:31-47.][XuYjX1ngF,LiuL,ZhangC.RatbonemarrowstromalcellscouldbeinducedintoSchwanncellprecursor-likecellsinvitr0.NeurosciLett.2011；488:229-33.]这种形态的差异可能是由于不同的诱导条件和不同的细胞来源。相比之下，本发明中的NI细胞在向SC诱导分化过程中，Oh、12h、24h和48h分别检测的基因表达模式与已有的文献报道是基本一致的[ZieglerL,GrigoryanS，YangIHjThakorNVjGoldsteinRS.Efficientgenerat1nofschwanncellsfromhumanembryonicstemcell-derivedneurospheres.StemCellRev.2011；7:394-403.][LiuZjJinYQjChenLjWangYjYangXjChengJjetal.Specificmarkerexpress1nandcellstateofSchwanncellsduringcultureinvitr0.PLoSOne.2015；10:e0123278.][FinzschM,SchreinerS,KichkoT,ReehP,TammERjBoslMR,etal.SoxlOisrequiredforSchwanncellidentityandprogress1nbeyondtheimmatureSchwanncellstage.JCellB1l.2010;189:701-12.]。非常有趣的是，1?黏连蛋白19(Cadherin19)作为SCP特有的细胞标志，随着NI细胞向SC的分化呈现倒U形变化，在诱导12h明显高于Oh，却在诱导24h和48h明显低于Olu这些时间依赖的变化好比模拟了NCC向成熟SC分化的动态过程[JessenKRjMirskyRjLloydAC.SchwannCells!DevelopmentandRoleinNerveRepair.ColdSpringHarbPerspectB1l.2015;7:a020487.][ffoodhooAjSommerL.DevelopmentoftheSchwanncelllineage:fromtheneuralcresttothemyelinatednerve.Glia.2008;56:1481-90.][TakahashiM,OsumiN.1dentificat1nofanoveltype11classicalcadherin:ratcadherinl9isexpressedinthecranialgangliaandSchwanncellprecursorsduringdevelopment.DevDyn.2005;232:200-8.]，结果表明NI细胞的SCP特征可能逐步削弱，而Nl-d-SC可能随着诱导时间的延长逐步由未成熟状态向成熟状态过渡。[0026]已有的研究报道，应用Laminin/PLL基质和HRG10诱导皮肤祖细胞(skinprecursor?SKP)向SC分化后，接着再运用不同的手段纯化SC，可以用一种圆柱筒(cylinder)选择SC集落，进行消化并收集细胞后传代培养[BiernaskieJAjMcKenzieIA，TomaJG,Mi11erFD.1solat1nofskin-derivedprecursors(SKPs)anddifferentiat1nandenrichmentoftheirSchwanncellprogeny.NatProtoc.2006；1:2803-12.]，也可以进行p75NTR免疫荧光染色为基础的流式活细胞分选[KhuongHT，KumarR,SenjayaF,GrochmalJ,IvanovicA,ShakhbazauA，etal.SkinderivedprecursorSchwanncellsimprovebehav1ralrecoveryforacuteanddelayednerverepair.ExpNeurol.2014;254:168-79.]。相比之下，本发明提供了一种简单高效的方法，运用此方法，本发明中的4个克隆亚群可有40%到95%的细胞被诱导分化为SC，其中NI克隆有95%之多，诱导NI细胞分化为SC后不需要后续的细胞分选步骤。许多已有的研究报道成体干细胞可被诱导分化为SC，比如从骨髓[CaddickJjKinghamPJjGardinerNJjffibergMjTerenghiG.Phenotypicandfunct1nalcharacteristicsofmesenchymalstemcellsdifferentiatedalongaSchwanncellIineage.Glia.2006；54:840-9.][ParkHffjLimMJjJungHjLeeSPjPaikKSjChangMS.Humanmesenchymalstemcell-derivedSchwanncell-likecellsexhibitneurotrophiceffects,viadistinctgrowthfactorproduct1n，inamodelofspinalcordinjury.Glia.2010；58:1118-32.]或脐带血[PengJjWangYjZhangLjZhaoBjZhaoZjChenJ,eta1.HumanumbilicalcordWharton’sjelly-derivedmesenchymalstemcellsdifferentiateintoaSchwann-cellphenotypeandpromoteneuriteoutgrowthinvitr0.BrainResBull.2011;84:235-43.][LeeJHjChungWHjKangEHjChungDJjChoiCBjChangHS，eta1.Schwanncel1-1ikeremyelinat1nfollowingtransplantat1nofhumanumbilicalcordblood(hUCB)-derivedmesenchymalstemcellsindogswithacutespinalcordinjury.JNeurolSci.2011;300:86-96.]来源的MSC[PanYjCaiS.CurrentstateofthedevelopmentofmesenchymalstemcellsintoclinicallyapplicableSchwanncelltransplants.MolCellB1chem.2012;368:127-35.]，脂肪来源的干细胞[KinghamPJjKalbermattenDFjMahayDjArmstrongSJjWibergMjTerenghiG.Adipose-derivedstemcellsdifferentiateintoaSchwanncellphenotypeandpromoteneuriteoutgrowthinvitr0.ExpNeurol.2007；207:267-74.][KaewkhawRjScuttAM，HaycockJff.Anatomicalsiteinfluencesthedifferentiat1nofadipose-derivedstemcellsforSchwann-cellphenotypeandfunct1n.Glia.2011；59:734-49.]的NCSC[Sieber_BlumMjGrimMjHuYF,SzederV.Pluripotentneuralcreststemcellsintheadulthairfollicle.DevDyn.2004;231:258-69.]和牙髓NCSC[Al_ZerHjApelCjHeilandMjFriedrichRE，JungOjKroegerN，etal.EnrichmentandSchwannCellDifferentiat1nofNeuralCrest-derivedDentalPulpStemCelIs.1nViv0.2015;29:319-26.]等，然而这些研究中分化为SC的比率仅低于40%或者未报道分化率。本方案不仅可获取更多的SC，分化速度也比已有文献报道的(>1周)快，获得如此高效的分化可能归因于衍生的SC是源于NCP克隆而不是NCSC或MSC。特别一提的是，具有SCP的特征NI克隆将有利于建立一个体外的SC分化体系，并且，此体系包括未成熟SC向成髓鞘SC的分化。[0027]成髓鞘是SC功能成熟的标志，成髓鞘的SC不同于其它SC亚型，比如未成熟SC和非成髓鞘SC。本发明中，NI细胞和DRG神经元共培养体系中形成了成髓鞘SC，并且，MBP和MG阳性的髓鞘结构证实其具有典型的SC功能。结果表明，SCP定向分化为的成髓鞘SC，除了需要旁分泌信号以外还需要可溶性因子，而与轴突的亲密接触也是有帮助的[JosephNMjMukouyamaYSjMosherJT,JaegleMjCroneSAjDormandEL，etal.Neuralcreststemcellsundergomultilineagedifferentiat1nindevelopingperipheralnervestogenerateendoneurialfibroblastsinaddit1ntoSchwanncells.Development.2004；131:5599-612.]。[0028]本发明中所选择的永生的BM-NCC克隆NI，具有SCP的身份特征，能够反复冻存和复苏，因此可为细胞治疗提供一个无限的细胞来源，尤其能促进神经的再生。此外，这些克隆细胞还可避免原代细胞制备中不同批次之间细胞差异的不良影响。已有学者报道从大鼠胚胎坐骨神经取出SC，然后运用逆转录病毒编码的EGFR/neu融合蛋白建立了一个条件依赖的永生的SCP细胞系(SpL201)[LobsigerCS,SmithPMjBuchstallerJ,SchweitzerB，FranklinRJjSuterU,etal.SpL201:acondit1nallyimmortalizedSchwanncellprecursorlinethatgeneratesmyelin.Glia.2001;36:31-47.]。本发明从成年大鼠迁移后BM-NCC分离获取了BM-NCC克隆细胞系，克服了伦理问题，且避免了神经损伤和基因改造，也不需像SpL201那样依赖环境中的EGF才能得以存活。另外，还有学者应用不同的调控因子，从小鼠表皮建立了永生的出生后NCSC细胞系[SviderskayaEVjEastyDJjLawrenceMA,SanchezDPjNegulyaevYAjPatelRH，etal.Funct1nalneuronsandmelanocytesinducedfromimmortallinesofpostnatalneuralcrest-likestemcells.FASEBJ.2009；23:3179-92.]，但是需要调控Wnt、shh和TGF0信号通路，表皮NCSC可作为SC的一种细胞来源[SakaueM,Sieber-BlumM.HumanepidermalneuralcreststemcellsasasourceofSchwanncells.Development.2015;142:3188-97.]。相比之下，本发明第一次报道从成年大鼠骨髓可获取并建立永生的NCC系，并且此NCC系能够作为生物学相关的细胞来源提供SCP和进一步衍生SC。[0029]本发明中，N1_CM在体外可修复O⑶损伤的DRG神经元，体内移植NI可修复坐骨神经夹伤，表明NI可发挥细胞为基础的治疗作用。Nl-CM中所含有的神经营养因子在细胞培养中促进了O⑶损伤的DRG神经元的存活和轴突的生长，而NI细胞注射入夹伤的大鼠坐骨神经后，所起的修复作用优于Nl-d-SC。为了更好地应用细胞移植治疗神经损伤，注射的细胞在体内的存活情况是需要考虑的一个重要方面，另外也需要考虑注射前细胞的分化状态，从而与周围组织共建良好的再生微环境[WalshS,MidhaR.Practicalconsiderat1nsconcerningtheuseofstemcellsforperipheralnerverepair.NeurosurgFocus.2009;26:E2.]。[0030]本发明的BM-NCC克隆NI有望应用于细胞为基础的促神经再生治疗。【附图说明】[0031]图1是BMSC和衍生的Mesensphere的形态图(A)与免疫细胞化学染色图(B)。[0032]图2是E/Fr-BMSC和衍生的Mesensphere的流式细胞仪(FCM)分析图。[0033]图3是BM-NCC单细胞克隆形态图(A)和增殖曲线(B)及生长曲线图(C)。[0034]图4是MSC和NCC标志在N1、N4和E/Fr-BMSC的mRNA表达水平:表达水平在NI和N4高于E/Fr-BMSC的NCC标志(A)，表达水平在NI和N4低于E/Fr-BMSC的MSC标志(B)，表达水平在N1、N4和E/Fr-BMSC无明显差异的标志(C)。[0035]图5是BM-NCC克隆向SC的分化:BM-NCC克隆NI向SC分化12h和48h的形态图(A和B)，各BM-NCC克隆衍生SC(S100即日性)的比率比较(C)，BM-NCC克隆NI衍生的SC的免疫细胞化学染色图(D)。[0036]图6是SC和NCC标志在NI衍生SC诱导分化Oh、12h、24h和48h的mRNA表达水平:SC标志的表达变化(A)，NCC标志的表达变化(B)，SCP标志的表达变化(C)，SC和NCC共有标志的表达变化(D)。[0037]图7是NI细胞与DRG神经元体外共培养成髓鞘的检测图:共培养0(1、1(1、14(1和21(1的形态图和免疫细胞化学染色图(A)，共培养28d的髓鞘形态图(B)，共培养28d的髓鞘免疫细胞化学染色图(C)，成髓鞘标志在共培养7d与28d的mRNA表达水平(D)。[0038]图8是Nl-CM体外修复O⑶损伤的DRG神经元CTubulinIII免疫细胞化学染色图。[0039]图9是细胞注射修复夹伤的大鼠坐骨神经形态与功能检测图:细胞注射后3周内不同时间点的各实验组坐骨神经功能指数(SFI)比较(A)，细胞注射3周后各实验组复合肌肉动作电位(CMAP)波幅比较(B)，细胞注射3周后各实验组再生神经的免疫组织化学染色图(C)。[0040]保藏信息:本发明的细胞系，命名为大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址:中国武汉大学，保藏日期2016年4月16日，保藏编号CCTCCN0:C201647o[0041]在CCTCC保藏的大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI为第50和51代细胞。【具体实施方式】[0042]下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。[0043]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。[0044]实施例1.骨髓神经嵴细胞(BM-NCC)的培养和鉴定[0045]BM-NCC的培养，应用以下重复的两步条件培养程序来培养获得BM-NCC:[0046]第一步，成体Wistar大鼠(8周龄)被处死后，立即从胫骨和股骨冲洗出骨髓，将骨髓细胞接种培养于含10%FBS的頂DM培养液，利用BMSC贴附塑料培养皿生长的特性，反复换液去除漂浮的造血干细胞，分离培养出原代大鼠BMSC;[0047]第二步，用含有20ng/mlEGF，20ng/mlFGF2，I%N2(v/v)，2%B27(v/v))，2mM谷氨酰胺，lOOU/ml青霉素，0.lmg/ml链霉素的DMEM/F12(v/v，1:1)成球培养液，对原代BMSC进行成球培养，接种细胞密度为2?3X15个/ml，形成原代细胞球(Sphere)。成球培养液也就是NCC的培养液。[0048]接着，重复第一步，即收集悬浮的原代细胞球再次接种培养于含10%FBS的頂DM培养液，利用BMSC贴附塑料培养皿生长的特性，获得E/Fr-BMSC；[0049]重复第二步，用DMEM/F12成球培养液，对E/Fr-BMSC亚群进行成球培养，形成的细胞球也称为间充质细胞球(Mesensphere)。[0050]以上培养过程中的细胞或细胞球用相差显微镜观察并采集图片；用免疫细胞化学(ICC)染色方法检测MSC和NCC标志蛋白；用流式细胞仪(FCM)分析细胞标志蛋白的表达。[0051]原代BMSC和E/Fr-BMSC显示贴壁生长的成纤维样细胞形态;BMSC衍生的Sphere和E/Fr-BMSC衍生的Mesensphere悬浮成球生长(图1A)。[0052]分离获取Mesensphere的过程:(I)从原代BMSC(al)分离原代BMSC细胞球(a2)；(2)从原代BMSC细胞球(a2)衍生E/Fr-BMSC(a3)；(3)从E/Fr_BMSC(a3)分离Mesensphere(a4)。ICC染色结果显示E/Fr-BMSC表达MSC标志蛋白CD90，而Mesensphere表达NCC标志蛋白CD29、CD133和p75NTR。E/Fr-BMSC和Mesensphere均表达干细胞标志蛋白Vimentin和Nestin(图1B)。[0053]FCM分析结果显示，E/Fr-BMSC高表达MSC标志蛋白CD90和CD73，而Mesensphere高表达NCC标志蛋白CDISSJ/Fr-BMSC和Mesensphere均高表达CD44、CD29和Nestin(图2)。[0054]实施例2.BM-NCC克隆的分离与增殖及细胞标志检测[0055]应用有限稀释法培养获取BM-NCC克隆[GlejzerA,LaudetE,LeprinceP,HennuyB,PouletC,ShakhovaO,etal.WntlandBMP2:twofactorsrecruitingmultipotentneuralcrestprogenitorsisolatedfromadultbonemarrow.CelIMolLifeSc1.2011;68:2101-14.]。细胞球传代培养到第4代以上后，用accutase酶将细胞球消化为单个细胞悬液，将细胞按0.7个/孔的密度接种到96孔细胞培养板进行单细胞成球培养(每孔细胞数随机为O个、I个或2个等)，每周半量换液2次。显微镜观察每孔细胞，当单个细胞增殖形成的单个细胞球所含有的细胞数达到100个以上时，就用accutase酶将这个细胞球消化为单细胞悬液，再继续进行传代的成球培养。单细胞悬液以<5X14个/ml的细胞密度接种，每7?14d传代I次，或根据需要传代。[0056]所得到的细胞克隆亚群常规传代，其中的细胞克隆N1、N3、N4和N13长期增殖，为绘制上述4个细胞克隆的长期增殖曲线，每一个细胞克隆在每一代(P)的累计细胞总数用以下公式计算获得:Cn=Cn—1XT1VSn,Cn=第η代累计细胞总数，C"—1=第η-l代累计细胞总数，Tn=第η代累计细胞总数，Sn=第η代接种细胞数。[0057]为检测细胞生长速度，传代至Ρ31、Ρ32和Ρ33的NI和Ν4克隆细胞被分别接种在6孔培养板的2ml培养液中，接种密度为IX14个/ml。培养时间每隔24h，收集细胞I次并计数细胞总数，共培养10d，用10个时间点计数的平均细胞数绘制出生长曲线。[0058]结果显示，获得4个长期增殖的BM-NCC单细胞克隆亚群N1、N3、N4和N13(图3A)，并在体外连续传代至少8代，NI和N4传代超过37代达16个月以上(图3B)。此外，P31、P32及P33代的NI和N4细胞的1d生长曲线(图3C)表明单细胞克隆NI和N4在传代到30代以上还仍然保持很好的自我更新能力。[0059]定量实时PCR(qRT-PCR)结果显示有统计学差异:NCC标志在NI和N4的mRNA表达水平均明显高于在E/Fr-BMSCs的mRNA表达水平，包括Nestin、Musashil、CD133、TFAP2a、HNKl、0)49(1、'^1'1、102475见1?丄044、冊51和50)(10(图44);然而，]\^(:标志在附和财的1111?嫩表达水平均明显低于在E/Fr-BMSC的mRNA表达水平，包括CD90、CD73、Vimentin、N_Cadherin和CXCR4(图4B)。此外，CD29、S0X2和Snail在NI或N4的mRNA表达水平均类似于在E/Fr-BMSCs的mRNA表达水平(图4C)。实验结果表明了NI和N4细胞克隆保持了BM-NCC身份。[0060]实施例3.BM-NCC向施旺氏细胞(SC)的定向诱导分化[0061]应用特定分化液诱导BM-NCC单克隆细胞(N1、N3、N4和N13)向SC分化。[0062]分离获得的各细胞克隆在P5?P7代时被分离为单个细胞，并接种到PLL/laminin包被的小圆玻片上，用含5%FBS、35ng/mltRA、5yMforskolin、200ng/mlHRG-Ιβ、10ng/mlFGF2、IOng/mlPDGF-AA和I%N2的DMEM/F12(v/v，1:1)培养液(即SC定向诱导分化液)孵育培养，每3d换液I次。[0063]NI细胞在诱导分化12h后，贴壁的细胞开始伸长，细胞形态从圆形变为纺锤形(图5A);48h后，纺锤形细胞呈现肩并肩样排列(图5B);60h后，细胞逐渐衰老和死亡。选择诱导48h的细胞进行S100f3的ICC染色以证实BM-NCC单克隆细胞向SC的分化，并计数SlOO即日性表达的细胞百分比，比较N1、N3、N4和N13这4个BM-NCC单克隆的分化效率，结果显示有统计学差异，NI克隆定向分化为S100I3阳性的SC的比率明显高于其它3个BM-NCC克隆(图5C)。此外，ICC染色结果还显示SlOO即日性的Nl-d-SC共表达GFAP、CNPase和p75NTR(图?)。[0064]qRT-PCR分析48h内的不同诱导分化时间点(Oh、12h、24h和48h)，SC和NCC标志在Nl-d-SC的mRNA表达水平变化。结果显示有统计学差异:SC标志，包括S1OO0、GFAP、CNPase、04和ErbB3随着诱导时间的延长表达水平逐渐增高(图6A);而NCC标志，包括⑶44、CD29、0)49(1、0乂0?4、'^1'1、他8乜11、]\11183811丨1、0)133、順1(1、5(?2、102和冊51，则随着诱导时间的延长mRNA表达水平逐渐降低(图6B);此外，SCP标志Cadherinl9在诱导12h的mRNA表达水平比在Oh显著增高，但在诱导24h和48h比在Oh明显降低，值得注意的是，在诱导12h显著高于在诱导24h和48h(图6C)；另外，S0X10和p75NTR作为SC和NCC的共有标志，p75NTR随着诱导时间的延长mRNA表达水平逐渐增高，S0X10则是在诱导12h后mRNA表达水平即显著增高且始终保持高水平至48h(图6D)。[0065]实施例4.DRG神经元的培养和DRG神经元与NI细胞共培养形成髓鞘[0066](I)DRG神经元的原代培养如已有文献所述[SheaGK1TsuiAY1ChanYS，ShumDK.Bonemarrow-derivedSchwanncellsachievefatecommitment—aprerequisiteforremyelinat1ntherapy.ExpNeurol.2010；224:448-58.][GuY,ffangJ,DingF,HuN,ffangY,GuX.Neurotrophicact1nsofbonemarrowstromalcellsonprimarycultureofdorsalrootgangl1ntissuesandneurons.JMolNeurosc1.2010；40:332-41.]o[0067]从胚胎大鼠(胚胎14.5?15.5)或新生大鼠脊柱背部两侧椎孔处取到DRG，依次应用3mg/ml胶原酶和0.25%胰酶分别消化30分钟后，吸弃酶液，加入含5%FBS的DMEM培养液，轻轻机械吹打以获得单细胞悬液，接着应用差速贴壁法去除贴壁较快的神经胶质细胞和成纤维细胞，再应用含有抗有丝分裂药物ΙΟμΜ氟脱氧尿苷和ΙΟμΜ尿苷的神经元培养液处理，抑制非神经元细胞的生长以进一步纯化神经元。细胞以5X14个/cm2的密度接种于PLL包被的培养皿，24孔板每孔约IX15个神经元，神经元培养液为含l%B27(v/v)、50ng/mlNGF和2mM的谷氨酰胺的Neurobasal培养液，每2?3d换液I次，至少培养7d。[0068]当细胞形成致密的神经突网络时，胚胎大鼠DRG神经元用于成髓鞘实验。出生后大鼠DRG神经元用于神经元损伤模型实验，见实施例5。[0069](2)DRG神经元与NI细胞共培养形成髓鞘[0070]体外成髓鞘实验参照已有文献报道进行[SheaGK1TsuiAY1ChanYS1ShumDK.Bonemarrow-derivedSchwanncellsachievefatecommitment—aprerequisiteforremyelinat1ntherapy.ExpNeurol.2010；224:448-58.]0[0071]用NCC培养液将NI细胞接种于PLL/laminin包被的培养皿中培养6h后，换为SC定向分化液孵育12h，诱导后的NI细胞由圆形细胞分化为伸展的短梭形细胞，将NI细胞收集后接种到上述24孔板每孔的DRG神经元神经突形成的网络中，每孔接种约5X14个NI细胞。共培养条件为:不含谷氨酰胺的DMEM/F12和Neurobasal培养基(1:1，v/v)，添加全部的SC诱导分化因子和全部的DRG神经元生长因子(见上文)，每2?3d半量换液I次。[0072]共培养I周后，可观察到NI细胞衍生为长梭形SC，并沿着神经元的轴突排列，接着开始添加L-抗坏血酸(50yg/ml))和葡萄糖(4mg/ml)，撤除tRA、H)GF-AA、FGF2和HRG-Ιβ，以刺激轴突髓鞘的形成。共培养继续维持3周，每2?3d换液I次。[0073]DRG神经元与NI细胞按照上文所述的步骤共培养。Nl-d-SC与DRG神经元保持接触，逐渐呈现伸长的双极形态，在共培养14d和21d后，很多细胞开始形成DRG神经元的髓鞘，21d时更加显著(图7A);共培养28d后，DRG神经元轴突形成的髓鞘呈现竹节样的形态结构(图7B);ICC染色显示髓鞘竹节样结构共表达成髓鞘标志蛋白MBP和MAG(图7C);qRT-PCR进一步分析显示有统计学差异，冊？、]\^6、？0、？]\0322、？1^和&(?20在共培养28(1的1111?嫩表达水平明显高于共培养7d时(图7D)。[0074]实施例5.Nl-CM体外修复OGD损伤的DRG神经元[0075]以Neurobasal培养基培养对数生长期的NI细胞，不添加生长因子，细胞密度为2X15个/ml，24h后收集培养基，S卩N1-CM，保存于-20°C。[0076]以无糖Neurobasal培养基培养纯化的新生大鼠DRG神经元，培养条件为37°C，5%CO2浓度和0.1%O2浓度，即O⑶损伤。8h后以Nl-CM换液处理，培养条件为37°C,5%CO2浓度和21%02浓度，培养24h，即OGD损伤后的Nl-CM修复处理。[0077]ICC染色检测Nl-CM修复前后的OGD损伤DRG神经元OTubulinIII的表达。结果显示，与常规培养基处理的DRG神经元相比，Nl-CM处理的DRG神经元在存活和神经突起生长这两方面均有所改善(图8)。[0078]实施例6.坐骨神经夹伤后移植NI细胞或Nl-d-SC进行细胞治疗[0079](I)坐骨神经夹伤后细胞移植手术[0080]腹腔注射复合麻醉药(10mg/kg甲苯噻嘆，95mg/kg氯胺酮，0.7mg/kg乙酰丙嘆)以麻醉大鼠；在后肢大腿中部侧面做手术切口，暴露左侧坐骨神经;在坐骨神经分出胫神经和腓总神经的部位近端，以止血钳夹伤坐骨神经3次，每次持续10秒，每次间隔10秒，注意不要阻断周围组织的血液循环；用I根不可吸收的9/0号丝线穿在水平于夹伤部位的肌肉上做好标记；然后立即在夹伤部位的远端处沿神经平行进针给夹伤神经注入IX16个NI细胞或Nl-d-SC(诱导NI分化48h);最后缝合好手术切口。[0081]大鼠分为注入生理盐水(NS)组，NI细胞移植组，Nl-d-SC细胞移植组，每组10只。[0082](2)足迹实验测试大鼠的功能恢复情况[0083]分别在手术前和手术后8d、12d、16d和20d进行大鼠足迹实验，方法参考已有文献[YuanY,ShenH,YaoJ,HuN,DingF,GuX.TheprotectiveeffectsofAchyranthesbidentatapolypeptidesinanexperimentalmodelofmousesciaticnervecrushinjury.BrainResBull.2010；81:25-32.]。简述如下文:大鼠双足后爪掌蘸红色印油，走过铺有白纸宣纸的狭长通道(宽15cm，高15cm，长80cm)，留下红色的足迹。查看并选取清晰的足迹，并测量正常和术侧足祉宽度(normaltoespread，NTS;experimentaltoespread，ETS)，足印长度(normalprintlength,NPL!experimentalprintlength,EPL),中间足足止宽度(normalintermediarytoespread，NIT;experimentalintermediarytoespread，EIT)，最后根据公式计算每只大鼠的坐骨神经功能指数(sciaticfunct1nindex，SFI)，SFI接近O表示神经功能正常，SFI接近-100表示神经功能完全损坏。Bain等给出的公式如下:[0084]SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8[0085]在足迹实验中，SFI值代表移步活动，用来指示夹伤坐骨神经后大鼠后肢感觉和运动的恢复情况。手术前SFI值为正常值0，手术后SFI值急剧下降为-100，然后随着坐骨神经的再生逐渐升高。比较NS处理组、Nl-d-SC处理组和NI细胞处理组的结果显示有统计学差异:Nl-d-SC处理组的SFI值在手术后20d明显高于NS处理组;NI细胞处理组的SFI值在手术后12d、16d和20d明显高于NS处理组;此外，NI细胞处理组的SFI值在手术后20d明显高于Nl-d-SC处理组(图9A)。[0086](3)电生理检测复合肌肉动作电位(CMAP)[0087]在手术后3周进行CMAP的电生理检测。麻醉大鼠后再次暴露左侧坐骨神经，在坐骨神经干近心端给予电刺激后，在同侧腓肠肌腹部记录CMAP，以对侧未手术后肢的CMAP作为正常对照，以注射NS组作为阴性对照。检测结果显示有统计学差异，NI细胞处理组的CMAP幅度峰值明显高于Nl-d-SC处理组；同时，两种细胞处理组电生理功能的恢复明显优于NS处理组(图9B)。[0088](4)坐骨神经的免疫组织化学(IHC)染色检测[0089]手术3周后取出各组再生的坐骨神经，对侧未手术神经作为正常对照。神经标本进行后固定，制备神经横断面冰冻切片，IHC检测S100i3和NF200的表达。结果显示，大鼠坐骨神经夹伤后经细胞注射处理而再生神经纤维，阳性表达NF200的轴突外面包裹着阳性表达S10e的髓鞘;并且，NI细胞处理组成髓鞘的轴突直径和髓鞘厚度均大于Nl-d-sc处理组；同时，两种细胞处理组的再生神经轴突直径和髓鞘厚度均大于NS处理组(图9C)。[0090]结论:[0091]迀移后BM-NCC是容易从骨髓组织获取的一种细胞来源。由于BMSC的高异质性，可分离获取多个BM-NCC单克隆细胞亚群，其中NI细胞克隆可以最有效地衍生大量高纯的SC，且不需要基因改造或进一步纯化。本研究的主要进展是从BM-NCC可衍生均质性高的SC后代，并根据Cadherinl9在NI细胞的高表达，NI细胞向SC的分化能力，NI细胞的成髓鞘能力，以及NI细胞对受损神经的修复作用，证实NI细胞克隆具有SCP(或未分化的SCP样状态)身份的推论。综上所述，源于BM-NCC的SCP(BM-NCC克隆NI)有望将来应用于细胞为基础的促神经再生治疗。[0092]本发明中“BM-NCC"来自哺乳动物，包括但不限为大鼠、小鼠、兔、猫、狗、猴、人。[0093]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。【主权项】1.一种大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI，保藏号为CCTCCN0:C201647。2.根据权利要求1所述的大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI，其特征在于，其具备施旺氏祖细胞的性能。3.如权利要求1所述的大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI的传代培养方法，其特征在于，所述的传代培养方法如下:将保藏号为CCTCCN0:C201647的细胞复苏后，培养至大多数细胞球增大而球中心细胞开始发暗时，用accutase酶将细胞球消化为单细胞悬液，然后细胞按SlO4个/ml的密度接种到细胞培养板，进行成球传代培养，每周半量换液2次;根据需要传代。4.如权利要求1所述的大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI向施旺氏细胞定向诱导分化的方法，其特征在于，所述的定向诱导分化方法如下:将保藏号为CCTCCN0:C201647的细胞复苏后，培养至对数生长期，分离为单个细胞，并接种到层黏连蛋白/多聚赖氨酸包被的培养板上，用施旺氏细胞定向诱导分化液孵育培养，每2?3d换液I次；所述的施旺氏细胞定向诱导分化液为:含5%胎牛血清、35ng/ml全反式视黄酸、5μΜforskolin、200ng/mlHRG-Ιβ、10ng/mlFGF2、10ng/mlI3DGF-AA和I%N2的DMEM/F12(v/v，1:1)培养液。5.如权利要求1所述的大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI在制备促进神经再生药物中的应用。6.根据权利要求5所述的大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI在制备促进神经再生药物中的应用，其特征在于，所述的应用为将大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI作为促进神经再生的细胞来源。7.根据权利要求5所述的大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI在制备促进神经再生药物中的应用，其特征在于，所述的应用是以细胞为基础的治疗，采用的方式为局部注射入受损组织、静脉注射或用于制备组织工程神经移植物行局部植入。8.根据权利要求5所述的大鼠骨髓源神经嵴祖细胞NI在制备促进神经再生药物中的应用，其特征在于，所述的药物为细胞悬液、细胞的条件培养基、细胞分泌的因子、细胞分泌的囊泡或细胞分泌的囊泡提取物。【文档编号】A61K35/30GK105925528SQ201610338493【公开日】2016年9月7日【申请日】2016年5月20日【发明人】施海燕,丁斐,强亮,余英奇,孙晓婷,胡静静,孙晓欢,何欢【申请人】南通大学