长链非编码rnaenst00000520431的应用
【专利摘要】本发明公开了一种长链非编码RNA(long no?coding RNA,LncRNA)ENST00000520431的应用，即用于制备预测人脐带来源的间充质干细胞向成骨细胞分化的检测试剂，特别是制备出实时荧光定量分析法预测人脐带来源的间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂盒。通过研究证实LncRNA ENST00000520431在成骨诱导培养处理后，ENST00000520431表达显著降低，因此，将ENST00000520431的表达用于间充质干细胞向成骨细胞分化的预测，具有深远的临床意义和推广性。
【专利说明】
长链非编码RNAENST00000520431的应用
技术领域
[0001] 本发明设及干细胞分子生物学领域，具体设及长链非编码RNAENST00000520431在 制备预测人厮带来源的间充质干细胞向成骨细胞分化制剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一种具有自我复制能力和多向 分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、 软骨、骨、肌肉、肌腫、神经、肝、屯、肌、膜岛齡田胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷 冻保存后仍具有多向分化潜能，是一种理想的骨组织工程种子细胞。目前应用最广泛的骨 髓、脂肪、厮带和厮带血等来源的间充质干细胞，它们均具有多向分化潜能；而且易于获得 及扩增，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可为组织器官的修复和再生提 供所需的大量细胞;同时免疫原性低，不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不 会引起宿主的免疫反应，还具有独特的免疫调节功能。
[0003] 长链非编码RNA(Xong non-coding RNA, IncRNAs)，是一类大于200bp的不编码蛋 白的RNA。随着高通量测序技术的普及W及对LncRNAs的了解，人们发现LncRNAs在基因表达 调控中起着举足轻重的作用。同样在间充质干细胞定向分化的过程中，LncRNA也通过调控 相关基因的表达影响着分化的方向。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种LncRM ENST00000520431的应用。LncRM ENST00000520431 (N0NC0DE ID:N0NHSAT126033.2)定位于8号染色体，其表达情况能作为判 断厮带间充质干细胞是否诱导分化为成骨细胞的依据，因此可W用于制备预测人厮带来源 的间充质干细胞向成骨细胞分化的制剂，更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用 的成骨效率评价的试剂盒。
[0005] 长链非编码RNA ENST00000520431的应用，用于制备预测人厮带来源的间充质干 细胞向成骨细胞分化制剂，该长链非编码RNA ENST00000520431的转录本序列如SEQ NO: 1 所示。
[0006] 所述的预测人厮带来源的间充质干细胞向成骨细胞分化制剂包括检测长链非编 码RNA ENST00000520431表达量的实时巧光定量PCR检测试剂。
[0007] 所述的实时巧光定量PCR检测试剂包括实时巧光定量PCR的特异性引物：
[000引 IncRNA ENST00000520431 特异性正向引物：
[0009] 5 '-GGCACATGGAGAATTAAATG-3,
[0010] IncRNA ENST00000520431 特异性反向引物：
[0011] 5'-TCTTGTCCTCGCCTTGTCTT-3'〇
[0012] -种预测人厮带来源的间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂盒，该试剂盒包括：
[0013] IncRNA ENST00000520431 特异性正向引物：
[0014] 5 '-GGCACATGGAGAATTAAATG-3 '
[0015] IncRNA ENST00000520431 特异性反向引物：
[0016] 5'-TCTTGTCCTCGCCTTGTCTT-3'〇
[0017] 该试剂盒还包括：
[001引内参e-actin的特异性引物：
[0019] 正向引物5'-CCTATCGAGCATGGAGTGGT-3'
[0020] 反向引物5 ' -CTGAGGCATAGAGGGACAGC-3 '
[0021] 内参a-化bulin的特异性引物：
[0022] 正向引物5 ' -CCTGATGTATGCCAAACGTG-3 '
[0023] 反向引物5 '-TCCCTGTAAAAGCAGCACCT-3 '。
[0024] 该试剂盒全套试剂包括：
[0025] (1)从诱导的间充质干细胞抽提总RNA所用试剂，包括化izol试剂，S氯甲烧，异丙 醇，无酶水；（2) W总RNA为模板将IncRNA ENST00000520431逆转录为CDNA所用试剂，包括逆 转录缓冲液，dNTP，RNA酶抑制剂，MMLV逆转录酶W及随机引物；（3)将CDNA实时定量PCR所用 试剂，包括IncRNA ENST00000520431的特异性引物、实时巧光定量SYBR染料、无酶水。
[0026] 本发明通过成骨诱导培养基诱导人厮带来源的间充质干细胞，处理1、2、3周后，提 取细胞总RNA，逆转录后进行实时巧光定量PCR分析LncRNA ENST00000520431的表达，发现： 未诱导的LncRNA ENST00000520431是诱导14天表达的20倍左右，诱导后表达降低显著，其 它经典的成骨细胞分子marker如osteocalcin和osteopont in则增加。据此，
【申请人】提出利 用LncRNA ENST00000520431制备预测人厮带来源的间充质干细胞向成骨细胞分化试剂。
[0027] 将LncRNA ENST00000520431用于预测人厮带来源的间充质干细胞是否向成骨细 胞分化的方法：（1)收集成骨诱导后或未诱导的人厮带来源的间充质干细胞，抽提总RNA; (2) W总RM为模板将LncRM ENST00000520431 逆转录为cDM; (3)用LncRM ENST00000520431特异性引物和内参引物进行实时巧光定量PCR扩增获得相对表达量，诱导 和未诱导的表达量差异明显，可W作为是否成骨分化的预测试剂。
[002引利用本发明的试剂可W检测LncRNA ENST00000520431在成骨诱导后的人厮带来 源的间充质干细胞的表达水平从而判断是否成骨分化，为人厮带间充质干细胞成骨分化提 供了 IncRNA的分子标志物，具有深远的实践意义和推广性。
[0029] W下结合【附图说明】和【具体实施方式】进一步说明本发明，而非限制本发明。
【附图说明】
[0030] 图1为实时巧光定量PCR分析LncRNA ENST00000520431成骨诱导后或未诱导的人 厮带来源的间充质干细胞的表达差异；
[0031] QC1205con代表用普通培养基培养组；
[0032] QC1205diff代表用成骨诱导培养基培养组。
[0033] 图2为成骨标志物分子OCN表达水平分析。
【具体实施方式】
[0034] 实施例1成骨诱导培养基诱导1、2、3周和未诱导的人厮带间充质干细胞中LncRNA ENST00000520431的检测试剂盒
[0035] 1.异丙醇 100mL
[0036] 2. Trizol 试剂100mL
[0037] 3. S氯甲烧 50ml
[003引 4. IiiM随机逆转录引物SOiil
[0039] 5.无酶水 2ml
[0040] 6.IOmM dNTP IOOyl
[0041 ] 7.200UAU RNA逆转录酶50iU
[0042] 8.5 X逆转录缓冲液Iml
[0043] 9.40UAU RNA抑制剂50化1
[0044] 10.Premix Ex 化9 50iU
[0045] 11. IOiiM IncRNA ENST00000520431 特异性引物50iU
[0046] 巧光定量PCR的特异性引物：
[0047] IncRNA ENST00000520431正向引物：5'-GGCACATGGAGAATTAAATG-3'
[004引 IncRNA ENST00000520431反向引物：5'-TCTTGTCCTCGCCTTGTCTT-3'
[0049] 12. IOiiM内参对照引物各50iU
[(K)加]内参e-actin的特异性引物：
[0051 ] 5'-CCTATCGAGCATGGAGTGGT-3'
[005。 5'-CTGAGGCATAGAGGGACAGC-3'
[0化3] 内参a-化bulin的特异性引物：
[0054] 5 '-CCTGATGTATGCCAAACGTG-3 '
[0055] 5 '-TCCCTGTAAAAGCAGCACCT-3 '
[0056] 实施例2人厮带间充质干细胞成骨诱导后LncRNA ENST00000520431的检测
[0057] (1)收集成骨诱导1，2,3周后和未诱导的人厮带来源的间充质干细胞，抽提总RNA: 去尽诱导后的培养板中培养基，加入1ml Trizol,在室溫下水平放置5min，使裂解液均匀分 布于细胞表面，然后用移液枪吹打细胞使细胞脱落;将细胞裂解液转移至离屯、管中，加入 200iilS氯甲烧，盖紧离屯、管管盖，上下振荡15秒，室溫静置3分钟，12,000g，4°C离屯、15分 钟。取出离屯、管，样品分为S层:淡色的上清水相、中间的白色层及粉红色的下层有机相。小 屯、吸取淡色上清水相移至另一离屯、管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀，室溫静置10分钟， 然后12 ,OOOg，4°C离屯、10分钟，在管底可见RNA沉淀。小屯、去除上清，缓慢沿管壁加入 1血75%乙醇，轻轻混匀。12，OOOg，4°C离屯、10分钟，小屯、吸尽上清。室溫干燥沉淀2~5分钟， 加入30~50化的无RNase水溶解RNA沉淀，分光光度计检测RNA的浓度和质量，0D260/280比 值在1.8-2.0之间，-70°C保存。
[0化引（2)W总RNA为模板将LncRNAENST00000520431逆转录为cDNA;
[0化9] Oligo(dT)ISprimer(IOOiiM)化 1
[0060] Total RNA 化邑
[0061] 无酶水 To化 1
[0062] 逆转录第一步条件:62°C5分钟
[0063] 5 X逆转录缓冲液化1
[0064] dNTP(10mM 仙 I
[0065] RNA 酶抑制剂(40UAU)化I
[0066] MMLV 逆转录酶(200UAU)化1
[0067] 第一步产物
[0068] Total 2化1
[0069] 逆转录第二步程序，42°C60分钟，72°C5分钟。
[0070] (3)用LncRNA ENST00000520431特异性引物和内参引物进行实时巧光定量PCR: ENST00000520431特异性引物DNA序列由Invitrogen公司合成。
[0071 ]先将逆转录产物稀释5倍，混匀，2化1反应体系如下：
[0072] SYBR Premix 2XIOyl
[0073] ENST00000520431 或内参引物化 1
[0074] cDNA产物 0.5iil [00巧]无酶水To化1 20iU
[0076] 实时巧光定量PCR反应95°C30秒，40个循环的95°C5秒，65°C30秒，72°C30秒，65~ 95°(：，每0.05秒增加0.5°(：。
[0077] IncRNA ENST00000520431正向引物：5'-GGCACATGGAGAATTAAATG-3'
[007引 IncRNA ENST00000520431反向引物：5'-TCTTGTCCTCGCCTTGTCTT-3'
[0079] 内参e-actin的特异性引物：
[0080] 正向引物5 ' -CCTATCGAGCATGGAGTGGT-3 '
[0081 ]反向引物5 ' -CTGAGGCATAGAGGGACAGC-3 '
[0082] 内参a-Tubulin的特异性引物：
[0083] 正向引物5 ' -CCTGATGTATGCCAAACGTG-3 '
[0084] 反向引物5 ' -TCCCTGTAAAAGCAGCACCT-3 '
[0085] (4)成骨诱导的测定:本实验数据采用相对定量的分析方法，0-actin和a-化bul in 作为内参基因，数据利用GraphPad Prism进行分析。成功诱导厮带间充质干细胞向成骨细 胞分化后IncRNA ENST00000520431显著下调，差异具有显著性(p<0.05)。
[00化]W上研究表明，IncRNA ENST00000520431可作为厮带间充质干细胞向成骨细胞分 化标志物。
【主权项】
1. 长链非编码RNA ENST00000520431的应用，其特征在于，用于制备预测人脐带来源的 间充质干细胞向成骨细胞分化的制剂，该长链非编码RNAENST00000520431的转录本序列如 SEQ NO: 1 所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，预测人脐带来源的间充质干细胞向成骨细 胞分化的制剂包括检测长链非编码RNA ENST00000520431表达量的实时荧光定量PCR检测 试剂。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的实时荧光定量PCR检测试剂包括实 时荧光定量PCR的特异性引物： IncRNA ENST00000520431 特异性正向引物： 5，-GGCACATGGAGAATTAAATG-3， IncRNA ENST00000520431 特异性反向引物： 5 '-TCTTGTCCTCGCCTTGTCTT-3 '。4. 一种预测人脐带来源的间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂盒，其特征在于，该试 剂盒包括： IncRNA ENST00000520431 特异性正向引物： 5，-GGCACATGGAGAATTAAATG-3， IncRNA ENST00000520431 特异性反向引物： 5 '-TCTTGTCCTCGCCTTGTCTT-3 '。5. 根据权利要求4所述的预测人脐带来源的间充质干细胞向成骨细胞分化试剂盒，其 特征在于，该试剂盒包括： 内参β-actin的特异性引物： 正向引物5 ' -CCTATCGAGCATGGAGTGGT-3 ' 反向引物5 ' -CTGAGGCATAGAGGGACAGC-3 ' 内参α-Tubulin的特异性引物： 正向引物5 ' -CCTGATGTATGCCAAACGTG-3 ' 反向引物5 '-TCCCTGTAAAAGCAGCACCT-3 '。6. 根据权利要求4或5所述的预测人脐带来源的间充质干细胞向成骨细胞分化的试剂 盒，其特征在于，该试剂盒包括： (1)从诱导的间充质干细胞抽提总RNA所用试剂，包括Trizol试剂，三氯甲烷，异丙醇， 无酶水；（2)以总RNA为模板将IncRNA ENST00000520431逆转录为cDNA所用试剂，包括逆转 录缓冲液，dNTP，RNA酶抑制剂，MMLV逆转录酶以及随机引物；（3)将cDNA实时定量PCR所用试 剂，包括lncRNAENST00000520431的特异性引物、实时荧光定量SYBR染料、无酶水。
【文档编号】C12Q1/68GK105925707SQ201610435777
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】帅词俊, 彭淑平, 高丹, 何世微, 钟雁城, 曾朝阳
【申请人】中南大学