一种同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的引物组合及GeXP检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的引物组合及GeXP检测方法。本发明的引物组合由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV和引物对V组成。本发明还保护同时鉴别口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的GeXP检测方法。本发明建立的GeXP检测方法可以同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒。本方法具有高通量、特异性和灵敏度较高的特点，可用于牛病流行病学的监测和突发疫情的鉴别诊断，保障养牛业的健康发展。
【专利说明】
一种同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的引物组合及GeXP检测 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的引物组合及GeXP检测方法。
【背景技术】
[0002] 口蹄疫病毒（Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)、蓝舌病病毒（Bluetongue Virus，BTV)、水泡性口 炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus，VSV)、牛病毒性腹泻病毒 (Bovine Viral Diarrheal Virus，BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，IBRV)是引起牛病毒性皮炎的5种主要病毒。感染病毒的牛在临床 上均表现为口腔、口鼻之间、蹄、阴门及乳房发生病变，出现水泡、红斑、开裂、坏死和溃疡。 由FMDV引发的牛口蹄疫、由VSV引发的牛水泡性口炎和由BTV引发的牛蓝舌病是牛的高度急 性传染病，一般呈暴发性流行，死亡率高，被世界动物卫生组织(0ΙΕ)列为A类传染病。BVDV 和IBRV属于免疫抑制性疾病病毒，病毒感染机体后使免疫力下降，继发细菌感染，而且感染 地区遍布全国各省市，感染率居高。牛群中相当一部份牛是BVDV携带者，孕牛感染BVDV后可 造成出生持续性感染的小牛，它们终身带毒持续散毒，引起疾病的流行。这些疾病是养牛业 的巨大潜患，一旦暴发，将会造成巨大的经济损失。由于这5种病毒在临床症状十分相似，难 以区分，因此需建立一种高通量快速检测方法，对牛病毒性皮炎病毒进行准确诊断。
[0003] GeXP多基因表达分析系统是一种新型的高通量的基因检测技术，将多重PCR技术 和毛细管电泳技术有效的结合起来，采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物（即基因特 异性引物5'端连接通用引物序列）相结合从而引发多重体系的扩增，可同时对多达30个目 的基因进行有效检测分析，实现真正意义上的高通量检测鉴别多种病原体的目的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种同时鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的引物组合及GeXP检测 方法。
[0005] 本发明提供了一种引物组合，由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV和引物 对V组成；
[0006] 所述引物对I由引物FMDV-F和引物FMDV-R组成；
[0007] 所述引物FMDV-F为如下(al)或(a2)或(a3):
[0008] (al)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
[0009] (a2)序列表的序列1自5'末端第19至36位核苷酸所示的DNA分子；
[0010] (a3)将(al)或(a2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相 同功能的DNA分子；
[0011] 所述引物FMDV-R为如下(a4)或(a5)或(a6):
[0012 ] (a4)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
[0013] (a5)序列表的序列2自5'末端第20至43位核苷酸所示的DNA分子；
[0014] (a6)将(a4)或(a5)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相 同功能的DNA分子；
[0015] 所述引物对Π 由引物BTV-F和引物BTV-R组成；
[0016] 所述引物BTV-F为如下(a7)或(a8)或(a9):
[0017] (a7)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
[0018] (a8)序列表的序列3自5'末端第19至41位核苷酸所示的DNA分子；
[0019] (a9)将(a7)或(a8)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3 具有相同功能的DNA分子；
[0020] 所述引物BTV-R为如下（alO)或(all)或(al2):
[0021] (al 0)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
[0022] (all)序列表的序列4自5'末端第20至37位核苷酸所示的DNA分子；
[0023] (al2)将(alO)或(all)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有 相同功能的DNA分子；
[0024] 所述引物对III由引物VSV-F和引物VSV-R组成；
[0025] 所述引物VSV-F为如下(al3)或(al4)或(al5):
[0026] (al 3)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
[0027] (al4)序列表的序列5自5'末端第19至38位核苷酸所示的DNA分子；
[0028] (al5)将(al3)或(al4)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有 相同功能的DNA分子；
[0029] 所述引物VSV-R为如下(al6)或(al7)或(al8):
[0030] (al6)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
[0031] (al7)序列表的序列6自5'末端第20至38位核苷酸所示的DNA分子；
[0032] (al8)将(al6)或(al7)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有 相同功能的DNA分子；
[0033] 所述引物对IV由引物BVDV-F和引物BVDV-R组成；
[0034]所述引物 BVDV-F 为如下（al9)或(a20)或(a21):
[0035] (al9)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
[0036] (a20)序列表的序列7自5'末端第19至36位核苷酸所示的DNA分子；
[0037] (a21)将(al9)或(a20)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序 列7具有相同功能的DNA分子；
[0038]所述引物 BVDV-R 为如下（a22)或(a23)或(a24):
[0039] (a22)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
[0040] (a23)序列表的序列8自5'末端第20至44位核苷酸所示的DNA分子；
[0041] (a24)将(a22)或(a23)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有 相同功能的DNA分子；
[0042] 所述引物对V由引物IBRV-F和引物IBRV-R组成；
[0043]所述引物 IBRV-F 为如下（a25)或(a26)或(a27):
[0044] (a25)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
[0045] (a26)序列表的序列9自5'末端第19至41位核苷酸所示的DNA分子；
[0046] (a27)将(a25)或(a26)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有 相同功能的DNA分子；
[0047]所述引物 IBRV-R 为如下(a28)或(a29)或(a30):
[0048] (a28)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
[0049] (a29)序列表的序列10自5'末端第20至36位核苷酸所示的DNA分子；
[0050] (a30)将(a28)或(a29)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有 相同功能的DNA分子。
[0051]所述引物组合的用途为如下(bl)至(b6)中的任意一种：
[0052] (bl)鉴别5种牛病毒性皮炎病毒；
[0053] (b2)制备用于鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的试剂盒；
[0054] (b3)检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹 泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒；
[0055] (b4)制备用于检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛 病毒性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒；
[0056] (b5)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病 毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒；
[0057] (b6)制备用于检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡 性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒。
[0058] 本发明还保护所述引物组合的应用，为如下(bl)至(b6)中的任意一种：
[0059] (bl)鉴别5种牛病毒性皮炎病毒；
[0060] (b2)制备用于鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的试剂盒；
[0061] (b3)检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹 泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒；
[0062] (b4)制备用于检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛 病毒性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒；
[0063] (b5)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病 毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒；
[0064] (b6)制备用于检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡 性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒。
[0065] 本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒;所述试剂盒的用途为如下(cl)或(c2) 或(c3):
[0066] (cl)鉴别5种牛病毒性皮炎病毒；
[0067] (c2)检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹 泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒；
[0068] (c3)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病 毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒；
[0069] 所述5种牛病毒性皮炎病毒为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒 性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒。
[0070] 本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
[0071] 本发明还保护一种鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的方法，包括如下步骤(dl)或(d2):
[0072] (dl)将待测病毒的RNA进行反转录，得到cDNA模板，采用所述引物组合进行PCR扩 增（具体可进行GeXP多重PCR扩增;扩增产物可进行毛细管电泳检测），如果扩增产物含有 165-167bp的DNA片段、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果扩增产物含有135-137bp的 DNA片段、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果扩增产物含有278-281bp的DNA片段、待 测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果扩增产物含有308-310bp的DNA片段、待测病原 体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果扩增产物含有187-189bp的DNA片段、待测病原体为 或候选为牛传染性鼻气管炎病毒；
[0073] (d2)检测待病毒的cDNA中是否含有所述引物对I的靶序列、所述引物对II的靶序 列、所述引物对III的靶序列、所述引物对IV的靶序列或所述引物对V的靶序列，如果所述 cDNA中含有所述引物对I的靶序列、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果所述cDNA中含 有所述引物对II的靶序列、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果所述cDNA中含有所述 引物对III的靶序列、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果所述cDNA中含有所述引 物对IV的靶序列、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果所述cDNA中含有所述引 物对V的靶序列、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒。
[0074] 本发明还保护一种检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病毒、水泡性口炎病毒、 牛病毒性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤(el)或(e2):
[0075] (el)将待测病毒的RNA进行反转录，得到cDNA模板，采用所述引物组合进行PCR扩 增（具体可进行GeXP多重PCR扩增;扩增产物可进行毛细管电泳检测），如果扩增产物含有 165-167bp的DNA片段、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果扩增产物含有135-137bp的 DNA片段、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果扩增产物含有278-281bp的DNA片段、待 测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果扩增产物含有308-310bp的DNA片段、待测病原 体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果扩增产物含有187-189bp的DNA片段、待测病原体为 或候选为牛传染性鼻气管炎病毒；
[0076] (e2)检测待病毒的cDNA中是否含有所述引物对I的靶序列、所述引物对II的靶序 列、所述引物对III的靶序列、所述引物对IV的靶序列或所述引物对V的靶序列，如果所述 cDNA中含有所述引物对I的靶序列、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果所述cDNA中含 有所述引物对II的靶序列、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果所述cDNA中含有所述 引物对III的靶序列、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果所述cDNA中含有所述引 物对IV的靶序列、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果所述cDNA中含有所述引 物对V的靶序列、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒。
[0077] 本发明还保护一种检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病毒和/或水 泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤 (Π )或(f2):
[0078] (Π )将待测样本的RNA进行反转录，得到cDNA模板，采用所述引物组合进行PCR扩 增（具体可进行GeXP多重PCR扩增;扩增产物可进行毛细管电泳检测），如果扩增产物含有 165-167bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有口蹄疫病毒，如果扩增产物含有135-137bp 的DNA片段、待测样本含有或疑似含有蓝舌病病毒，如果扩增产物含有278-281bp的DNA片 段、待测样本含有或疑似含有水泡性口炎病毒，如果扩增产物含有308-310bp的DNA片段、待 测样本含有或疑似含有牛病毒性腹泻病毒，如果扩增产物含有187-189bp的DNA片段、待测 样本含有或疑似含有牛传染性鼻气管炎病毒；
[0079] (f2)检测待测样本的cDNA中是否含有所述引物对I的靶序列、所述引物对II的靶 序列、所述引物对III的靶序列、所述引物对IV的靶序列或所述引物对V的靶序列，如果所述 cDNA中含有所述引物对I的靶序列、待测样本含有或疑似含有口蹄疫病毒，如果所述cDNA中 含有所述所述引物对II的靶序列、待测样本含有或疑似含有蓝舌病病毒，如果所述cDNA中 含有所述所述引物对III的靶序列、待测样本含有或疑似含有水泡性口炎病毒，如果所述 cDNA中含有所述所述引物对IV的靶序列、待测样本含有或疑似含有牛病毒性腹泻病毒，如 果所述eDNA中含有所述所述引物对V的靶序列、待测样本含有或疑似含有牛传染性鼻气管 炎病毒。
[0080] 本发明还保护引物组合，为如下(gl)或(g2):
[0081] (gl)所述引物对I或所述引物对II或所述引物对III或所述引物对IV或所述引物 对V;
[0082] (g2)所述引物对I、所述引物对II、所述引物对III、所述引物对IV和所述引物对V 中的任意两个引物对的组合、任意三个引物对的组合、任意四个引物对的组合。
[0083]所述引物组合的用途为鉴别口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒 和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒。
[0084] 本发明还保护所述引物组合的应用，为鉴别口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水 泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒。
[0085] 本发明还保护含有所述引物组合的试剂盒;所述试剂盒的用途为鉴别口蹄疫病毒 和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎 病毒。
[0086] 以上任一所述5种牛病毒性皮炎病毒为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病 毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒。
[0087] 以上任一所述待测病毒具体可为FMDV 0型灭活病毒、FMDV A型灭活病毒、FMDV Asial型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、VSV IND型灭活病毒、BTV 4型灭活病毒、BTV 8型灭 活病毒、BTV 9型灭活病毒、BTV 15型灭活病毒、BTV 17型灭活病毒、BTV 18型灭活病毒、 BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型）、BVDV参考毒株NADL株(BVDV-1型）、BVDV参考毒株 牦牛株(BVDV-1型）、BRV参考毒株NCDV、BRV参考毒株BRV014、IBRV病毒、BVDV毒株GX-BVDV1、 BVDV 毒株 GX-BVDV2、BVDV 毒株 GX-BVDV3、BVDV 毒株 GX-BVDV4、BVDV 毒株 GX-BVDV5、BVDV 毒株 GX-BVDV6、BVDV 毒株 GX-BVDV7、BVDV 毒株 GX-BVDV8、BVDV 毒株 GX-BVDV9、BVDV 毒株 GX-BVDV10、BVDV 毒株 GX-BVDV11、BVDV 毒株 GX-BVDV12、BVDV 毒株 GX-BVDV13 或 BVDV 毒株 GX-041。
[0088] 以上任一所述"所述引物对I的靶序列"具体可为如下(hi)或(h2)或(h3): (hi)序 列表的序列18所示的DNA分子；（hi)序列表的序列18自5'末端第19至146位核苷酸所示的 DNA分子；（h3)与(hi)或(h2)具有98%以上同源性的DNA分子。
[0089] 以上任一所述"所述引物对II的靶序列"具体可为如下(h4)或(h5)或(h6):(h4)序 列表的序列19所示的DNA分子；（h5)序列表的序列19自5'末端第19至117位核苷酸所示的 DNA分子；（h6)与(h4)或(h5)具有98 %以上同源性的DNA分子。
[0090] 以上任一所述"所述引物对III的靶序列"具体可为如下(h7)或(h8)或(h9):(h7) 序列表的序列20所示的DNA分子；（h8)序列表的序列20自5'末端第19至259位核苷酸所示的 DNA分子；（h9)与(h7)或(h8)具有98 %以上同源性的DNA分子。
[0091] 以上任一所述"所述引物对IV的靶序列"具体可为如下（hlO)或(hll)或(hl2): (hlO)序列表的序列21所示的DNA分子；（hll)序列表的序列21自5'末端第19至289位核苷酸 所示的DNA分子；（hl2)与(hlO)或(hll)具有98%以上同源性的DNA分子。
[0092] 以上任一所述"所述引物对V的靶序列"具体可为如下（hl3)或（hl4)或（hl5): (hl3)序列表的序列22所示的DNA分子；（hl4)序列表的序列22自5'末端第19至169位核苷酸 所示的DNA分子；（hl5)与(hl3)或(hl4)具有98%以上同源性的DNA分子。
[0093] 以上任一所述待测样本具体可为粪便拭子、眼试子、鼻粘液拭子、抗凝血、食道-咽 部分泌物、水泡液、直肠黏膜组织样本、水泡皮组织样本或淋巴结组织样本。
[0094]以上任一所述GeXP多重PCR扩增的反应体系中，引物组合中的各条引物的浓度如 下:FMDV-F 和 FMDV-R 的浓度均为 0 · 2ymolAiL，BTV-F 和 BTV-R 的浓度均为 0 · 2ymolAiL，VSV-F 和 VSV-R 的浓度均为 0.2ymolAxL，BVDV-F 和 BVDV-R 的浓度均为 2ymolAiL，IBRV-F 和 IBRV-R 的 浓度均为〇. 2μηιο1/μL。
[0095]以上任一所述GeXP多重PCR扩增的反应体系（20yL)具体可为：模板以以10-100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5Xbuffer 4yL(bufTer内含有通用引物，通用引 物由序列表的序列16所示的引物A和序列表的序列17所示的引物B组成，其中引物A的5'末 端具有CY5荧光基团的标记，引物A和引物B的工作浓度均为0.25yM)，MgCl 2(25yM)4yL，含有 弓丨物组合中的所有引物的引物混合物lyL，DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20yL。 [0096] 以上任一所述GeXP多重PCR扩增的反应程序具体可为:95°C5分钟预变性;94°C30 秒，55 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；94°C 30秒，68 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环;94 °C 30秒，50 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环;72 °C延伸5min，结束反应。
[0097]以上任一所述毛细管电泳的电泳条件为：90 °C 120秒，变性；2.0KV 30秒，吸入样 品；6.0KV 35分钟，分离样品。
[0098]本发明建立的GeXP检测方法可以同时鉴别口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎 病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒5种牛病毒性皮炎病毒。本方法具有高通 量、特异性和灵敏度较高的特点，可用于牛病流行病学的监测和突发疫情的鉴别诊断，保障 养牛业的健康发展。
【附图说明】
[0099] 图1为实施例2中各待测样本的多重PCR扩增结果图。
[0100] 图2为实施例2中5种牛病毒性皮炎病毒混合样本的多重PCR扩增结果图。
[0101] 图3为实施例5中采用反应体系1-5时多重PCR的扩增结果图。
【具体实施方式】
[0102] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0103] FMDV 0型灭活病毒、FMDV A型灭活病毒、FMDV Asia I型灭活病毒、BTV 4型灭活病 毒、BTV 8型灭活病毒、BTV 9型灭活病毒、BTV 15型灭活病毒、BTV 17型灭活病毒、BTV 18型 灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、VSV IND型灭活病毒:参考文献:秦敏，邹丰才，杨云庆，等.蓝 舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎多重PCR检测方法的建立[J].动物医学进展，2015， 36(9):18-22.;由云南出入境检验检疫局惠赠，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0104] BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型）：中国兽医药品监察所，货号:AV69。
[0105] BVDV参考毒株NADL株(BVDV-1型）：中国兽医药品监察所，货号:AV67。
[0106] BVDV参考毒株牦牛株(BVDV-1型）：中国兽医药品监察所，货号:AV68。
[0107] IBRV病毒：中国兽医微生物菌种保藏管理中心，货号:AV21。
[0108] BVDV 毒株 GX-BVDVUBVDV 毒株 GX-BVDV2、BVDV 毒株 GX-BVDV3、BVDV 毒株 GX-BVDV4、 BVDV 毒株 GX-BVDV5、BVDV 毒株 GX-BVDV6、BVDV 毒株 GX-BVDV7、BVDV 毒株 GX-BVDV8、BVDV 毒株 BVDV13、BVDV 毒株 GX-041:参考文献：Fan Q，Xie Z，Xie L，et al.A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of bovine viral diarrhea virus[J].Journal of Virological Methods， 2012，186 (1 -2): 43-48.;公众可以从广西壮族自治区兽医研究所获得。
[0109] Genome Lab GeXP Starter Kit 5Xbuffer:其中含有序列表的序列16所不的引 物A和序列表的序列17所示的引物B，其中引物A的5'末端具有CY5荧光基团的标记;美国贝 克曼库尔特公司。
[0110]样品缓冲液:美国贝克曼库尔特公司，货号:M409196。
[0111] DNA size standard kit-400 Base Pairs :美国贝克曼库尔特公司产品，货号： 608098〇
[0112] DNA polymerase:美国SIGMA公司，货号：D4184-1.5KU。
[0113] MgCh(25yM):美国SIGMA公司，货号:M8787-1.5ML。
[0114] EasyPure Viral DNA/RNA Kit:北京全式金生物技术有限公司，货号:ER201-01。
[0115] 实施例1、引物组合的设计和制备
[0116] 进行大量序列分析、比对获得了用于鉴别?10￥、81^￥3￥、8￥0￥和181^5种牛病毒 性皮炎病毒的若干引物。将各个引物进行预实验，比较灵敏度、特异性等性能，最终得到用 于鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的5对特异性引物。每个特异性引物对，正向引物和反向引物 均由靶向区段和通用引物区段组成，通用引物区段位于靶向区段的5'端。
[0117] 用于鉴定FMDV的引物对由如下两条引物组成(5 ' -3 ：
[0118] FMDV-F(序列表的序列 1): AGGTGACACTATAGAATAGCCGTGGGACCATACAGG ；
[0119] FMDV-R(序列表的序列2) ：GTACGACTCACTATAGGGAAAGTGATCTGTAGCTTGGAATCTC〇
[0120] 下划线部分为通用引物区段。
[0121] 用于鉴定BTV的引物对由如下两条引物组成(5'-3'）：
[0122] BTV-F(序列表的序列3):AGGTGACACTATAGAATAAGGGTAACTCACAGCAAACTCAA；
[0123] BTV-R(序列表的序列4):GTACGACTCACTATAGGGAGAGCAGCCTGTCCATCCC〇
[0124] 下划线部分为通用引物区段。
[0125] 用于鉴定VSV的引物对由如下两条引物组成(5 ' -3 '）：
[0126] VSV-F(序列表的序列5):AGGTGACACTATAGAATAAAACTACTGGACGGGCTTGA；
[0127] VSV-R(序列表的序列6) ：GTACGACTCACTATAGGGATGAGATGCCCAAATGTTGC〇
[0128] 下划线部分为通用引物区段。
[0129] 用于鉴定BVDV的引物对由如下两条引物组成(5'^3'）：
[0130] BVDV-F(序列表的序列7): AGGTGACACTATAGAATAGTGAGTTCGTTGGATGGC；
[0131] BVDV-R(序列表的序列8) ：GTACGACTCACTATAGGGATATGTTTTGTATAAGAGTTCATTTG〇
[0132] 下划线部分为通用引物区段。
[0133] 用于鉴定ETEC的引物对由如下两条引物组成(5'-3'）：
[0134] IBRV-F(序列表的序列9):AGGTGACACTATAGAATAGCGTCATTTACAAGGAGAACATC；
[0135] IBRV-R(序列表的序列 10):GTACGACTCACTATAGGGAATCTCGCCCATGCCCAC〇
[0136] 下划线部分为通用引物区段。
[0137] 用于鉴定FMDV的引物对命名为引物对I。
[0138] 用于鉴定BTV的引物对命名为引物对II。
[0139] 用于鉴定VSV的引物对命名为引物对III。
[0140] 用于鉴定BVDV的引物对命名为引物对IV。
[0141] 用于鉴定IBRV的引物对命名为引物对V。
[0142] 上述各引物对组成引物组合。
[0143] 实施例2、特异性 [0144] -、单一模板实验
[0145] 1、提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA。待测样本分别为:FMDV 0型灭活病毒、 BTV 4型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型）、IBRV病 毒。
[0146] 2、分别以步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1的引物组合进行GeXP多重PCR。
[0147] 多重PCR的反应体系（20yL):模板lyL(约 100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5Xbuffer 4yL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列 表的序列17所不的引物B组成，其中引物A的5'末端具有CY5焚光基团的标记，引物A和引物B 的工作浓度均为0.25μΜ)，MgCl2(25μΜ)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物lyL， DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20yL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓 度均为0.2ymolAxL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2ymolAiL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μ mol/yUBVDV-F 和 BVDV-R 的浓度均为 2ymolAxL，IBRV-F 和 IBRV-R 的浓度均为 0·2μπιο?ΛΛ。设 置用等体积水作为模板的阴性对照。
[0148] 多重PCR的反应程序：95 °C 5分钟预变性;94 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循 环；94 °C 30秒，68 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；94 °C 30秒，50 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；72 °C延伸5min，结束反应。
[0149] 3、将步骤2的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为:将3yL多重PCR扩增 产物、38.75yL样品缓冲液和0.25yL DNA size standardkit-400 Base Pairs漩涡震荡混 匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上 每孔加入180yL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件:90 °C 120秒，变性;2.0KV 30秒，吸入样品；6.0KV 35分钟，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通 过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软 件Express Profiler software分析结果。
[0150] 根据电泳结果进行判断，判断标准为:5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断 大小分别为：FMDV:165-167bp，BTV :135-137bp，VSV:278-281bp，BVDV:308-310bp，IBRV: 187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确 结果。
[0151] 电泳结果如图1所示。图1中，横坐标表示片段大小(单位为bp)，纵坐标表示信号强 度，即PCR扩增产物的含量。图1A为FMDV 0型灭活病毒cDNA的多重PCR扩增结果，扩增得到 165.03bp的DNA片段。图1B为BTV 4型灭活病毒cDNA的多重PCR扩增结果，扩增得到136.72bp 的DNA片段。图1C为VSV NJ型灭活病毒cDNA的多重PCR扩增结果，扩增得到278.04bp的DNA片 段。图1D为BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型）cDNA的多重PCR扩增结果，扩增得到 309.58bp的DNA片段。图1F为IBRV病毒基因组DNA的多重PCR扩增结果，扩增得到188.21bp的 DNA片段。每个反应只出现特异性单峰，无其它信号峰，且片段大小与判断标准相符。阴性对 照均无扩增，无目的信号峰值。
[0152]二、混合模板实验
[0153] 1、提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA。待测样本分别为:FMDV 0型灭活病毒、 BTV 4型灭活病毒、VSV NJ型灭活病毒、BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型）、IBRV病 毒。
[0154] 2、将步骤1得到的5种cDNA混合。
[0155] 3、以步骤2得到的混合液为模板，采用实施例1的引物组合进行GeXP多重PCR。
[0156] 多重PCR的反应体系（20yL):模板lyL，Genome Lab GeXP Starter Kit 5Xbuffer 4yL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列表的序列17 所示的引物B组成，其中引物A的5'末端具有CY5荧光基团的标记，引物A和引物B的工作浓度 均为0.25μΜ)，1^(：1 2(25以1〇4以1^，含有引物组合中的所有引物的引物混合物1以1^，0麻 polymerase 10U，用超纯水补足至20yL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓度均 为0 · 2ymolAxL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0 · 2ymolAiL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0 · 2μπιο1/μ L，BVDV-F 和 BVDV-R 的浓度均为 2ymolAxL，IBRV-F 和 IBRV-R 的浓度均为 0·2μπιο1/μL。设置用 等体积水作为模板的阴性对照。
[0157] lyL模板中FMDV 0型灭活病毒的cDNA约100ng，BTV 4型灭活病毒的cDNA为约 100ng，VSV NJ型灭活病毒的cDNA为约100ng，BVDV参考毒株Oregon CV24株（BVDV-1型）的 cDNA 为约 100ng，IBRV 病毒的 cDNA 为约 100ng。
[0158] 多重PCR的反应程序：95 °C 5分钟预变性;94 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循 环；94 °C 30秒，68 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；94 °C 30秒，50 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；72 °C延伸5min，结束反应。
[0159] 4、将步骤3的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为:将3yL多重PCR扩增 产物、38.75yL样品缓冲液和0.25yL DNA size standard kit-400 Base Pairs漩涡震荡混 匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上 每孔加入180yL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件:90 °C 120秒，变性;2.0KV 30秒，吸入样品；6.0KV 35分钟，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通 过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软 件Express Profiler software分析结果。
[0160] 根据电泳结果进行判断，判断标准为:5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断 大小分别为：FMDV:165-167bp，BTV :135-137bp，VSV:278-281bp，BVDV:308-310bp，IBRV: 187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确 结果。
[0161] 检测结果如图2所示。图2中，横坐标表示片段大小(单位为bp)，纵坐标表示信号强 度，即PCR扩增产物的含量。结果表明，使用GeXP多重PCR可以同时检测出5种牛病毒性皮炎 病毒对应的 5 种信号峰，FMDV:166.17bp，BTV:136.85bp，VSV:280.45bp，BVDV:309.67bp， IBRV: 188.02bp，无其它杂峰。阴性对照均无扩增，无目的信号峰值。
[0162] 实施例3、普适性
[0163] 1、提取待测样本的总RNA，并反转录为cDNA。待测样本分别为：：FMDV 0型灭活病 毒、FMDV A型灭活病毒、FMDV Asia I型灭活病毒、BTV 4型灭活病毒、BTV 8型灭活病毒、BTV 9型灭活病毒、BTV 15型灭活病毒、BTV 17型灭活病毒、BTV 18型灭活病毒、VSV NJ型灭活病 毒、VSV IND型灭活病毒、BVDV参考毒株Oregon CV24株(BVDV-1型）、BVDV参考毒株NADL株 (BVDV-1 型）、BVDV参考毒株牦牛株（BVDV-1 型）、BVDV毒株GX-BVDV1、BVDV毒株GX-BVDV2、 BVDV 毒株 GX-BVDV3、BVDV 毒株 GX-BVDV4、BVDV 毒株 GX-BVDV5、BVDV 毒株 GX-BVDV6、BVDV 毒株
[0164] 2、分别以步骤1得到的cDNA为模板，采用实施例1的引物组合进行GeXP多重PCR。
[0165] 多重PCR的反应体系（20yL):模板lyL(约 100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5Xbuffer 4yL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列 表的序列17所不的引物B组成，其中引物A的5'末端具有CY5焚光基团的标记，引物A和引物B 的工作浓度均为0.25μΜ)，MgCl2(25μΜ)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物lyL， DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20yL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓 度均为0.2ymolAxL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2ymolAiL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μ mol/yUBVDV-F 和 BVDV-R 的浓度均为 2ymolAxL，IBRV-F 和 IBRV-R 的浓度均为 0·2μπιο?ΛΛ。设 置用等体积水作为模板的阴性对照。
[0166] 多重PCR的反应程序：95 °C 5分钟预变性;94 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循 环；94 °C 30秒，68 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；94 °C 30秒，50 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；72 °C延伸5min，结束反应。
[0167] 3、将步骤2的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为:将3yL多重PCR扩增 产物、38.75yL样品缓冲液和0.25yL DNA size standard kit-400 Base Pairs漩涡震荡混 匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上 每孔加入180yL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件:90 °C 120秒，变性;2.0KV 30秒，吸入样品；6.0KV 35分钟，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通 过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软 件Express Profiler software分析结果。
[0168] 根据电泳结果进行判断，判断标准为:5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断 大小分别为：FMDV:165-167bp，BTV:135-137bp，VSV:278-281bp，BVDV :308-310bp，IBRV: 187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确 结果。
[0169] 采用实施例1的引物组合对待测样本进行多重PCR扩增，每个样本只出现对应病原 体的特异性单峰，无其他信号峰，且片段大小与判断标准相符，结果表明，实施例1设计的引 物组合普遍适用于5种牛病毒性皮炎病毒。
[0170] 实施例4、质粒标准品制备
[0171] FMDV标准品：将序列表的序列11所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重 组质粒(命名为FMDV标准品）。
[0172] BTV标准品：将序列表的序列12所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重组 质粒(命名为BTV标准品）。
[0173] VSV标准品：将序列表的序列13所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重组 质粒(命名为VSV标准品）。
[0174] BVDV标准品：将序列表的序列14所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重 组质粒(命名为BVDV标准品）。
[0175] IBRV标准品：将序列表的序列15所示的双链DNA分子与pMD-18T载体连接，得到重 组质粒(命名为IBRV标准品）。
[0176] 实施例5、敏感性
[0177] 1、将实施4制备的FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品 等拷贝数混合，得到混合液。
[0178] 2、用ddH20 10倍梯度稀释步骤2得到的混合液，得到各个稀释液。
[0179] 3、将步骤2得到的稀释液作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行GeXP多重 PCR〇
[0180] 多重PCR的反应体系（20yL):模板lyL(约 100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5Xbuffer 4yL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列 表的序列17所不的引物B组成，其中引物A的5'末端具有CY5焚光基团的标记，引物A和引物B 的工作浓度均为0.25μΜ)，MgCl2(25μΜ)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物lyL， DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20yL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓 度均为0.2ymolAxL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2ymolAiL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μ mol/yUBVDV-F 和 BVDV-R 的浓度均为 2ymolAxL，IBRV-F 和 IBRV-R 的浓度均为 0·2μπιο?ΛΛ。设 置用等体积水作为模板的阴性对照。
[0181] 由于采用的稀释液的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
[0182] 反应体系1中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初 始浓度均为1 〇6拷贝/yL;
[0183] 反应体系2中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初 始浓度均为1 〇5拷贝ΛΛ;
[0184] 反应体系3中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初 始浓度均为1 〇4拷贝ΛΛ;
[0185] 反应体系4中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初 始浓度均为1 ο3拷贝/yL;
[0186] 反应体系5中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初 始浓度均为1 〇2拷贝ΛΛ;
[0187] 反应体系6中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初 始浓度均为1 〇拷贝/yL;
[0188] 反应体系7中，FMDV标准品、BTV标准品、VSV标准品、BVDV标准品和IBRV标准品的初 始浓度均为1拷贝/yL。
[0189] 多重PCR的反应程序：95 °C 5分钟预变性；94 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循 环；94 °C 30秒，68 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；94 °C 30秒，50 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；72 °C延伸5min，结束反应。
[0190] 4、将步骤3的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为:将3yL多重PCR扩增 产物、38.75yL样品缓冲液和0.25yL DNA size standard kit-400 Base Pairs漩涡震荡混 匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上 每孔加入180yL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件:90 °C 120秒，变性;2. OKV 30秒，吸入样品；6.OKV 35分钟，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通 过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软 件Express Profiler software分析结果。
[0191] 根据电泳结果进行判断，判断标准为:5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断 大小分别为：FMDV: 165-167bp，BTV:135-137bp，VSV:278-281bp，BVDV:308-310bp，IBRV: 187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确 结果。
[0192] 检测结果如图3所示。图3A-3E依次对应采用反应体系1-5时多重PCR的扩增结果， 图3中，横坐标表示片段大小（单位为bp)，纵坐标表示信号强度，即PCR扩增产物的含量。结 果表明，当检测体系中待测DNA的浓度低至100拷贝AxL时，也可以检测出5种牛病毒性皮炎 病毒。
[0193] 实施例5、临床样本检测
[0194] 待测样本为:305份临床样本，其中包括156份粪便拭子，30份眼试子，30份鼻粘液 拭子，70份抗凝血，2份0P液(食道-咽部分泌物），2份水泡液，15份组织样品（10份直肠黏膜， 2份水泡皮，3份淋巴结）。临床样品采集于2012-2014年广西各地，约1 /2的样品来源于各地 奶牛场无症状奶牛，约1/4的样品来源于具有腹泻，消瘦，流鼻涕等临床症状的牛，1/4样品 来源于具有精神不撅，吞咽困难，发烧，口腔糜烂出现水泡，口鼻白沫的牛。
[0195] 1、提取待测样本总RNA并反转录得到cDNA。
[0196] 2、将步骤1得到的cDNA作为模板，采用实施例1制备的引物组合进行进行GeXP多重 PCR〇
[0197] 多重PCR的反应体系（20yL):模板lyL(约 100ng)，Genome Lab GeXP Starter Kit 5Xbuffer 4yL(buffer内含有通用引物，通用引物由序列表的序列16所示的引物A和序列 表的序列17所不的引物B组成，其中引物A的5'末端具有CY5焚光基团的标记，引物A和引物B 的工作浓度均为0.25μΜ)，MgCl2(25μΜ)4μL，含有引物组合中的所有引物的引物混合物lyL， DNA polymerase 10U，用超纯水补足至20yL。多重PCR的反应体系中，FMDV-F和FMDV-R的浓 度均为0.2ymolAiL，BTV-F和BTV-R的浓度均为0.2ymolAiL，VSV-F和VSV-R的浓度均为0.2μ mol/yUBVDV-F 和 BVDV-R 的浓度均为 2ymolAxL，IBRV-F 和 IBRV-R 的浓度均为 0·2μπιο?ΛΛ。设 置用等体积水作为模板的阴性对照。
[0198] 多重PCR的反应程序：95 °C 5分钟预变性;94 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循 环；94 °C 30秒，68 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；94 °C 30秒，50 °C 30秒，72 °C 30秒，10个循环；72 °C延伸5min，结束反应。
[0199] 3、将步骤2的多重PCR扩增产物进行毛细管电泳，具体步骤为:将3yL多重PCR扩增 产物、38.75yL样品缓冲液和0.25yL DNA size standard kit-400 Base Pairs漩涡震荡混 匀，加入上样板中，每孔滴加1滴石蜡封闭液面，避免甲酰胺氧化和样品蒸发。在缓冲液板上 每孔加入180yL的样品缓冲液，进行毛细管电泳。毛细管电泳条件:90 °C 120秒，变性;2. OKV 30秒，吸入样品；6.OKV 35分钟，分离样品。不同大小片段的PCR产物在电泳中分离，仪器通 过检测PCR产物携带的荧光基团辨认其片段大小和信号强度。电泳完成后，使用仪器自带软 件Express Profiler software分析结果。
[0200] 根据电泳结果进行判断，判断标准为:5种牛病毒性皮炎病毒目的基因的扩增片断 大小分别为：FMDV:165-167bp，BTV :135-137bp，VSV:278-281bp，BVDV:308-310bp，IBRV: 187-189bp。由于GeXP本身系统的误差，扩增片断大小与理论值存在±2bp偏差均属于正确 结果。
[0201] 4、将步骤3得到的阳性扩增产物进行测序以验证结果的正确性。
[0202] 检测结果如表1所示。
[0203]表1临床样本检测结果统计
[0205] 305份样品中，83份检测结果为阳性，均为单重感染，无混合感染。测序结果显示阳 性结果均为对应的病毒，无非特异性扩增的假阳性。
【主权项】
1.引物组合，由引物对I、引物对II、引物对III、引物对IV和引物对V组成； 所述引物对I由引物FMDV-F和引物FMDV-R组成； 所述引物FMDV-F为如下(al)或(a2)或(a3): (al)序列表的序列1所示的单链DNA分子； (a2)序列表的序列1自5'末端第19至36位核苷酸所示的DNA分子； (a3)将(al)或(a2)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功 能的DNA分子； 所述引物FMDV-R为如下(a4)或(a5)或(a6): (a4)序列表的序列2所示的单链DNA分子； (a5)序列表的序列2自5'末端第20至43位核苷酸所示的DNA分子； (a6)将(a4)或(a5)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功 能的DNA分子； 所述引物对Π 由引物BTV-F和引物BTV-R组成； 所述引物BTV-F为如下(a7)或(a8)或(a9): (a7)序列表的序列3所示的单链DNA分子； (a8)序列表的序列3自5'末端第19至41位核苷酸所示的DNA分子； (a9)将(a7)或(a8)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有 相同功能的DNA分子； 所述引物BTV-R为如下(alO)或(all)或(al2): (alO)序列表的序列4所示的单链DNA分子； (all)序列表的序列4自5'末端第20至37位核苷酸所示的DNA分子； (al2)将(alO)或(all)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的DNA分子； 所述引物对ΠI由引物VSV-F和引物VSV-R组成； 所述引物VSV-F为如下(al3)或(al4)或(al5): (al3)序列表的序列5所不的单链DNA分子； (al4)序列表的序列5自5'末端第19至38位核苷酸所示的DNA分子； (al5)将(al3)或(al4)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的DNA分子； 所述引物VSV-R为如下(al6)或(al7)或(al8): (al6)序列表的序列6所不的单链DNA分子； (al7)序列表的序列6自5'末端第20至38位核苷酸所示的DNA分子； (al8)将(al6)或(al7)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的DNA分子； 所述引物对IV由引物BVDV-F和引物BVDV-R组成； 所述引物BVDV-F为如下(al9)或(a20)或(a21): (al9)序列表的序列7所示的单链DNA分子； (a20)序列表的序列7自5'末端第19至36位核苷酸所示的DNA分子； (a21)将(al9)或(a20)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7 具有相同功能的DNA分子； 所述引物BVDV-R为如下(a22)或(a23)或(a24): (a22)序列表的序列8所示的单链DNA分子； (a23)序列表的序列8自5'末端第20至44位核苷酸所示的DNA分子； (a24)将(a22)或(a23)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的DNA分子； 所述引物对V由引物IBRV-F和引物IBRV-R组成； 所述引物IBRV-F为如下(a25)或(a26)或(a27): (a25)序列表的序列9所不的单链DNA分子； (a26)序列表的序列9自5'末端第19至41位核苷酸所示的DNA分子； (a27)将(a25)或(a26)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的DNA分子； 所述引物IBRV-R为如下（a28)或(a29)或(a30): (a28)序列表的序列10所示的单链DNA分子； (a29)序列表的序列10自5'末端第20至36位核苷酸所示的DNA分子； (a30)将(a28)或(a29)经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同 功能的DNA分子。2. 权利要求1所述引物组合的应用，为如下(bl)至(b6)中的任意一种： (bl)鉴别5种牛病毒性皮炎病毒； (b2)制备用于鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的试剂盒； (b3)检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病 毒或牛传染性鼻气管炎病毒； (b4)制备用于检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒 性腹泻病毒或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒； (b5)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/ 或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒； (b6)制备用于检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口 炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒； 所述5种牛病毒性皮炎病毒为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹 泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒。3. 含有权利要求1所述引物组合的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下（cl)或（c2)或 (c3)： (cl)鉴别5种牛病毒性皮炎病毒； (c2)检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病 毒或牛传染性鼻气管炎病毒； (c3)检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病病毒和/或水泡性口炎病毒和/ 或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒； 所述5种牛病毒性皮炎病毒为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹 泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒。4. 权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。5. -种鉴别5种牛病毒性皮炎病毒的方法，包括如下步骤(dl)或(d2): (dl)将待测病毒的RNA进行反转录，得到cDNA模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如 果扩增产物含有165-167bp的DNA片段、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果扩增产物 含有135-137bp的DNA片段、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果扩增产物含有278-281bp的DNA片段、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果扩增产物含有308-310bp的 DNA片段、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果扩增产物含有187-189bp的DNA片 段、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒； (d2)检测待病毒的cDNA中是否含有权利要求1所述引物对I的靶序列、所述引物对II的 靶序列、所述引物对III的靶序列、所述引物对IV的靶序列或所述引物对V的靶序列，如果所 述cDNA中含有所述引物对I的靶序列、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果所述cDNA中 含有所述引物对II的靶序列、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果所述cDNA中含有所 述引物对III的靶序列、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果所述cDNA中含有所述 引物对IV的靶序列、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果所述cDNA中含有所述 引物对V的靶序列、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒； 所述5种牛病毒性皮炎病毒为口蹄疫病毒、蓝舌病病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹 泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒。6. -种检测待测病毒是否为口蹄疫病毒、蓝舌病毒、水泡性口炎病毒、牛病毒性腹泻病 毒或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤(el)或(e2): (e 1)将待测病毒的RNA进行反转录，得到cDNA模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如 果扩增产物含有165-167bp的DNA片段、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果扩增产物 含有135-137bp的DNA片段、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果扩增产物含有278-281bp的DNA片段、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果扩增产物含有308-310bp的 DNA片段、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果扩增产物含有187-189bp的DNA片 段、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒； (e2)检测待病毒的cDNA中是否含有权利要求1所述引物对I的靶序列、所述引物对II的 靶序列、所述引物对III的靶序列、所述引物对IV的靶序列或所述引物对V的靶序列，如果所 述cDNA中含有所述引物对I的靶序列、待测病原体为或候选为口蹄疫病毒，如果所述cDNA中 含有所述引物对II的靶序列、待测病原体为或候选为蓝舌病病毒，如果所述cDNA中含有所 述引物对III的靶序列、待测病原体为或候选为水泡性口炎病毒，如果所述cDNA中含有所述 引物对IV的靶序列、待测病原体为或候选为牛病毒性腹泻病毒，如果所述cDNA中含有所述 引物对V的靶序列、待测病原体为或候选为牛传染性鼻气管炎病毒。7. -种检测待测样本中是否含有口蹄疫病毒和/或蓝舌病毒和/或水泡性口炎病毒和/ 或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒的方法，包括如下步骤(Π )或(f2): (Π )将待测样本的RNA进行反转录，得到cDNA模板，采用所述引物组合进行PCR扩增，如 果扩增产物含有165-167bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有口蹄疫病毒，如果扩增产 物含有135-137bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有蓝舌病病毒，如果扩增产物含有 278-281bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有水泡性口炎病毒，如果扩增产物含有308-310bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有牛病毒性腹泻病毒，如果扩增产物含有187- 189bp的DNA片段、待测样本含有或疑似含有牛传染性鼻气管炎病毒； (f2)检测待测样本的cDNA中是否含有权利要求1所述引物对I的靶序列、所述引物对II 的靶序列、所述引物对III的靶序列、所述引物对IV的靶序列或所述引物对V的靶序列，如果 所述cDNA中含有所述引物对I的靶序列、待测样本含有或疑似含有口蹄疫病毒，如果所述 cDNA中含有所述所述引物对II的靶序列、待测样本含有或疑似含有蓝舌病病毒，如果所述 cDNA中含有所述所述引物对III的靶序列、待测样本含有或疑似含有水泡性口炎病毒，如果 所述cDNA中含有所述所述引物对IV的靶序列、待测样本含有或疑似含有牛病毒性腹泻病 毒，如果所述cDNA中含有所述所述引物对V的靶序列、待测样本含有或疑似含有牛传染性鼻 气管炎病毒。8. 引物组合，为如下(gl)或(g2): (gl)权利要求1中的所述引物对I或所述引物对II或所述引物对III或所述引物对IV或 所述引物对V; (g2)权利要求1中的所述引物对I、所述引物对II、所述引物对III、所述引物对IV和所 述引物对V中的任意两个引物对的组合、任意三个引物对的组合、任意四个引物对的组合。9. 权利要求8所述引物组合在制备试剂盒中的应用，所述试剂盒的用途为鉴别口蹄疫 病毒和/或蓝舌病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管 炎病毒。10. 含有权利要求8所述引物组合的试剂盒，所述试剂盒的用途为鉴别口蹄疫病毒和/ 或蓝舌病毒和/或水泡性口炎病毒和/或牛病毒性腹泻病毒和/或牛传染性鼻气管炎病毒。
【文档编号】C12N15/11GK105969913SQ201610567609
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】谢芝勋, 范晴, 谢志勤, 邓显文, 谢丽基, 黄莉, 罗思思, 黄娇玲, 张艳芳, 曾婷婷, 王盛, 刘加波, 庞耀珊
【申请人】广西壮族自治区兽医研究所