一种诊治子宫内膜癌的分子标志物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了SKA3基因可以作为子宫内膜癌诊断的分子标志物，本发明的实验证明：与正常子宫内膜组织相比，SKA3基因在子宫内膜癌组织中表达量高。本发明还公开了SKA3基因可以用于制备治疗子宫内膜癌的药物。本发明的研究成果提供了一种新的子宫内膜癌临床诊断方法，同时提供了一种治疗子宫内膜癌的药物新靶标。
【专利说明】
-种诊治子宫内膜癌的分子标志物
技术领域
[0001] 本发明设及癌症诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明设及W检测SKA3异 常为手段的癌症诊断、预测预后方法;及抑制SKA3基因或蛋白质的癌症治疗剂。
【背景技术】
[0002] 子宫内膜癌巧ndometrial carcinoma EC)是原发于子宫内膜的上皮性恶性肿，是 女性生殖器Ξ大恶性肿瘤之一，高发年龄为58-61岁。近年来EC的发病率有逐年上升并年轻 化的趋势，约占女性癌症总数7%，占女性生殖道恶性肿瘤的20%-30%，已经接近甚至超过 宫颈癌的发病率，据美国癌症协会(American Cancer Society,ACS)报道，在美国EC已经成 为发病率最高的女性生殖道恶性肿瘤，2011年美国新增加 EC病例有46470例，远远高于宫颈 癌和卵巢癌，其中有8120例患者死于本病。在中国，随着经济水平增长、生活条件的提高W 及激素替代治疗等因素的影响，EC的发病率在逐渐升高。我国对EC发病率的研究没有确切 报道，但通过住院患者频谱比值间接推算，在北京、上海等经济发达城市EC的发病率明显上 升，已经成为经济发达省市女性生殖道恶性肿瘤之首。目前我国EC的病例增长迅速与国外 一致，严重威胁着女性健康，但其发病机制仍不明确。根据发病原因 EC分为雌激素依赖型（I 型）和非雌激素依赖型（II型），其中I型EC约占全部EC的85%，其发生一般经历子宫内膜增 生，尤其是非典型增生过程，发病期别早，预后好，早期发现是有效治疗的关键。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的之一在于提供一种通过检测SKA3基因或蛋白表达差异来诊断子宫 内膜癌的方法。
[0004] 本发明的目的之二在于提供一种通过检测SKA3基因或蛋白表达差异来预测子宫 内膜癌预后的方法。
[0005] 本发明的目的之Ξ在于提供一种通过抑制SKA3基因或SKA3蛋白来治疗子宫内膜 癌的方法。
[0006] 本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗子宫内膜癌的药物的方法。
[0007] 本发明的目的之五在于提供一种用于治疗子宫内膜癌的药物。
[000引为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0009]本发明提供了检测SKA3基因或SKA3蛋白的产品在制备子宫内膜癌诊断工具中的 用途。
[0010]本发明还提供了检测SKA3基因或SKA3蛋白的产品在制备预测子宫内膜癌预后工 具中的用途。
[0011] 进一步，所述检测SKA3基因或SKA3蛋白的产品包括检测SKA3基因或SKA3蛋白的表 达水平的产品。所述产品包括能够结合SKA3基因的核酸或者能够结合SKA3蛋白的物质（例 如抗体）。所述核酸能够检测SKA3基因的表达水平;所述物质能够检测SKA3蛋白的表达水 平。
[0012] 本发明的检测SKA3基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能:如 PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、巧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、AS0法、高 通量测序平台等。使用该产品可W定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0013] 包含在上述产品中的核酸可W通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有 期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0014] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Ampl if ication RefractoiT Mutation System,扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增 的核酸可W通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特异性寡核巧酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可扩增片段长度多态性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (单链构象多态性)法来检测。
[0015] 上面所述的核酸包括扩增SKA3基因的引物，产品中包括的引物可W通过通过化学 合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化 学合成来制备。
[0016] 在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列)所示。
[0017] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可W通过化学合成来制备，通过使用本 领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可W通 过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩 增它来制备。
[0018] 本发明的检测SKA3蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如， 可W包括化ISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
[0019] 本发明的检测SKA3蛋白的产品包括特异性结合SKA3蛋白的抗体或其片段。可W使 用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合祀蛋白质即可。本 发明的检测产品中包括的抗体或其片段可W是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体 对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肤。抗体片段可W包括F (al/ )2、Fab/ Jab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区（双抗 体）、或含有CDR的肤。本发明的检测SKA3蛋白的产品可W包括编码抗体或编码抗体片段的 氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
[0020] 抗体可W通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分祀 蛋白质的多肤或整合编码它们的多核巧酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免 疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞W获得杂交瘤。然后从杂交 瘤培养物收集抗体。最后可W通过使用被用作抗原的SKA3蛋白或其部分对获得的抗体实施 抗原特异性纯化来获得针对SKA3蛋白的单克隆抗体。可W如下制备多克隆抗体：用与上文 相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上 述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可W通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体 的序列信息来获得抗体片段。
[0021] 标记物与抗体或其片段的结合可W通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可 W如下巧光标记蛋白质或肤：用憐酸盐缓冲液清洗蛋白质或肤，添加用DMS0、缓冲剂、等准 备的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸 如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH (DojindoLaboratories);碱性憐酸酶标记试剂盒诸如碱性憐酸酶标记试剂盒-N肥、碱性憐 酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories);过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标 记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻胆蛋白标记试剂 盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2， B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH (DojindoLaboratories);巧光标记试剂盒诸如巧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte FluoHTM) 555标记试剂盒-N肥、HiLyte Fluo;r(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLi曲t 547和DyLi曲t647(Techno 化emical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluo;r(TM)抗体 标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒（Invitrogen Coloration)和EZ-标记物蛋白质标 记试剂盒(化nakoshi Co巧oration)。为了正确标记，可W使用适宜的仪器来检测经过标记 的抗体或其片段。
[0022] 作为依照本发明的检测产品的样品，可W使用例如自活检受试者获得的组织样品 或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定;例如，它可W包括组织、血液、血浆、 血清、淋己液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材 料。
[0023] 在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
[0024] 在本发明中，"预后"是指癌症患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过 程或结果。在本说明书中，预后可W是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可W通过检查生物标志物即SKA3蛋白或编码 SKA3蛋白的基因来预测。预后预测可W运样进行:根据生物标志物的有或无，或者升高或降 低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
[0025] 在本发明中，"预后良好"是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之 后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可^意 指在运样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可W意指至少3年或尤 其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如 本文中所使用的，"预后良好"还可W包括任何运样的状态，其中可W发现疾病如转移，但是 恶性低且不严重地影响生存能力。
[0026] 在本发明中，"预后不良"是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短 时期（例如1、2、3、4、5年或更短）内发生致命状况。或者，预后差是指在运样的短时期里死 亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可W意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死 亡。
[0027] 预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能W100%的准确度预测 患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意 味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本 发明而言，本发明中SKA3基因或SKA3蛋白的水平升高的患者中，与不显示该特征的患者相 比，更有可能观察到特定过程或结果。
[0028] 进一步，所述检测SKA3基因或SKA3蛋白的产品可W是检测SKA3基因或SKA3蛋白的 试剂、也可W是包含所述试剂的试剂盒、忍片、试纸等，也可W是使用所述试剂的高通量测 序平台。
[0029] 本发明还提供了一种诊断子宫内膜癌的工具，所述工具能够检测SKA3基因或SKA3 蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合SKA3基因的核酸或者能够结合SKA3蛋白的物质 (例如抗体）。所述核酸能够检测SKA3基因的表达水平;所述物质能够检测SKA3蛋白的表达 水平。
[0030] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0031] 进一步，所述诊断子宫内膜癌的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通量 测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断子宫内膜癌的工具，随着高通量测序技术的 发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人 群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知SKA3 基因的异常与子宫内膜癌相关也属于SKA3基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0032] 本发明还提供了一种预测子宫内膜癌预后的工具，所述预测子宫内膜癌预后工具 包括能够结合SKA3基因的核酸或者能够结合SKA3蛋白的物质(例如抗体）。所述核酸能够检 测SKA3基因的mRNA水平;所述物质能够检测SKA3蛋白的表达水平。
[0033] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0034] 进一步，所述预测子宫内膜癌预后的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高 通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断子宫内膜癌的工具，随着高通量测序技 术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正 常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知 SKA3基因的异常与子宫内膜癌相关也属于SKA3基因的用途，同样在本发明的保护范围之 内。
[0035] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗SKA3抗体或其片段所识别的氨基酸的数 目没有特别限制，只要抗体能够结合SKA3即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识 别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制SKA3功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少 一个，更优选至少Ξ个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可W是IgG、IgM、IgA、IgE、I曲或 I巧。
[0036] 本发明还提供了一种诊断子宫内膜癌或预测子宫内膜癌预后的方法，所述方法包 括如下步骤：
[0037] (1)获取受试者的样品；
[0038] (2)检测受试者样品中SKA3基因或蛋白的表达水平；
[0039] (3)将测得的SKA3基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
[0040] (4)与对照相比，SKA3基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为子宫内膜 癌，或该受试者被确定为预后不良。
[0041] 本发明还提供了一种子宫内膜癌的治疗方法，所述方法包括抑制SKA3基因或SKA3 蛋白。
[0042] 进一步，所述方法包括抑制SKA3基因的表达，或抑制SKA3蛋白的表达或抑制SKA3 蛋白的活性。
[0043] 本发明还提供了一种癌症药物的筛选方法，可W通过在对癌细胞添加测试药物后 或在对癌症模型动物施用测试药物后的某个时期测量SKA3基因或者SKA3蛋白的表达水平 来测定癌症药物改善癌症预后的效果。更具体地说，当SKA3基因或者SKA3蛋白的表达水平 在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善癌症预后的 治疗药物。
[0044] 本发明还提供了一种含有SKA3基因或SKA3蛋白的抑制剂的药物。
[0045] 本发明还提供了上述抑制剂在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用。
[0046] 本发明的SKA3基因或SKA3蛋白的抑制剂不受限制，只要是可W抑制SKA3或设及 SKA3上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗癌症有效的药物即可。
[0047] 进一步，所述抑制剂包括反义核酸、dsRNA、核酶、适体、SKA3结合蛋白片段、或抗体 或其片段。
[004引"反义核酸"指含有与编码SKA3的mRNA互补的序列的核酸。反义核酸可W由DNA、 RNA或二者组成。反义核酸不需要与祀SKA3的mRNA 100 %互补。反义核酸可含有非互补碱 基，只要它能够在严格条件下特异性杂交即可。当将反义核酸引入细胞时，它结合祀多核巧 酸并抑制转录、RNA加工、翻译或稳定性。除反义多核巧酸之外，反义核酸还包括多核巧酸模 拟物，它含有经过修饰的主链、和y和5/端部分。运样的反义核酸可W根据SKA3序列信息来 恰当设计并使用本领域技术人员公知的方法来生成。
[00例 "dsRNA"指含有双链RNA结构，通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达的RNA，包括 siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)dcIsRNA不需要与祀基因序列具有100%的同源性， 只要它可抑制祀基因表达即可。为了稳定化或其它目的，可W将dsRNA的一部分用DNA替代。 优选的是，S i RNA是21 -2 3个碱基的双链RNA。S i RNA可W通过本领域技术人员公知的方法来 制备，例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。shRNA是具有发夹转角化airpin turn)结构的短链RNA。shRNA可W通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合 成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA。
[0050] "核酶"指具有催化活性的RNA，它能够切割、粘贴、插入、和转移RNA。核酶的结构可 W包括键头、发夹等。
[0051] "适体"指结合某物质诸如蛋白质的核酸。适体可W是RNA或DNA。核酸的形式可W 是双链或单链。适体的长度无限制，只要它能够特异性结合祀分子即可，可W由例如10至 200个核巧酸、优选10至100个核巧酸、更优选15至80个核巧酸、进一步更优选15至50个核巧 酸组成。适体可W使用本领域技术人员公知的方法来选择。例如，可W采用SELEX(通过指数 式富集进行的配体的系统进化）。
[0052] "SKA3结合蛋白的片段"指结合SKA3且抑制SKA3实施原始功能的蛋白质的片段。
[0053] 本发明的药物可W作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可W与本发明的药 物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即 可，优选的是，用于治疗或预防癌症的药物可W包括例如烧化剂，诸如异环憐酷胺、环憐酷 胺、达卡己嗦、替莫挫胺、尼莫司汀、白消安、丙卡己阱、美法仑、和雷莫司汀;抗代谢物，诸如 依诺他滨、卡培他滨、卡莫氣、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞巧、阿糖胞巧十八烷基憐酸盐 (cy^rabine ocfos化te)、替加氣、替加氣-尿喀晚、替加氣吉美喀晚奥替拉西钟、去氧氣尿 巧、径基脈、氣尿喀晚、氣达拉滨、培美曲塞、喷司他下、琉嚷岭、和甲氨蝶岭;植物生物碱，诸 如伊立替康、依托泊巧、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和 长春碱;抗癌抗生素，诸如放线菌素 D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他下 stimalamer、柔红霉素、多柔比星、化柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素 C、和米托蔥酿； 基于销的药物，诸如奥沙利销、卡销、顺销、和奈达销;激素药物，诸如阿那曲挫、依西美坦、 雌莫司汀、烘雌醇、氯地孕酬、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氣他胺、 泼尼松龙、憐雌酪、米托坦、甲睾酬、甲径孕酬、美雄烧、亮丙瑞林、和来曲挫；生物反应修饰 剂，诸如干扰素 α、干扰素 β、干扰素丫、白介素、乌苯美司、干BCG、和香茹多糖;和分子祀向药 物，诸如伊马替尼（imatinib)、吉非替尼(旨6門1:;[]1化）、吉姆单抗、奥佐米星、他米己罗汀、曲 妥单抗、维A酸、棚替佐米(bo;rtezomib)、和利妥昔单抗等。
[0054] 本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、 舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
[0055] 本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即 可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下 的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，屯、室内，直肠，阴道， 烦骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可W系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
[0056] 本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可 W依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可W使用例 如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
[0057] 在本发明的上下文中，"诊断子宫内膜癌"既包括判断受试者是否已经患有子宫内 膜癌、也包括判断受试者是否存在患有子宫内膜癌的风险。
[0058] 本文所用的"治疗"涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的 疾病或疾病状态，并且包括：
[0059] (1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾 病状态，但尚未被诊断出患有运种疾病状态时；
[0060] (2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生;或者
[0061] (3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
[0062] 术语"治疗"通常设及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用），其中可达到某些预 期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止）、改善病症和治愈 病症。还包括作为预防措施(例如预防）的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危 险的患者的用途，也包括在术语"治疗"中。
[0063] 本发明的优点和有益效果：
[0064] 本发明的发现了一种诊断子宫内膜癌的分子标志物，使用该分子标志物可W在子 宫内膜癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
[0065] 另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方 案策略。
[0066] 本发明的包括SKA3基因或蛋白的抑制剂的治疗药物可用作新的子宫内膜癌的治 疗药物。
【附图说明】
[0067] 图1显示利用QPCR检测SKA3基因在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织中的表达 情况；
[0068] 图2显示利用Western blot检测SKA3蛋白在子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织 中的表达情况；
[0069] 图3显示利用QPCR检测S iRNA对SKA3基因的干扰效率；
[0070] 图4显示抑制SKA3蛋白功能对子宫内膜癌细胞增殖的影响。
[0071] 具体的实施方式
[0072] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0073] 实施例1基因忍片筛选差异表达基因
[0074] 1、样本收集：
[0075] 子宫内膜癌组织样本:收集子宫内膜癌患者，全部患者均经手术治疗，手术石蜡标 本10例。所有患者均经过病理检查确诊患有子宫内膜癌。其他入组条件为:所有患者入院前 未接受过任何治疗:未合并其他恶性肿瘤;未合并其他激素相关性疾病;临床资料完整。
[0076] 10例子宫内膜癌患者，发病平均年龄58岁。患者主要临床表现为阴道不规则出血、 下腹痛、月经素乱、阴道排液等，亦有部分患者无明显症状而于健康查体发现。子宫内膜癌 标本经肥染色切片，组织形态学确诊为子宫内膜癌。
[0077] 正常子宫内膜组织样本：10例正常子宫内膜手术石蜡标本。样本来源的病人所患 疾病包括:子宫肌瘤、子宫脱垂、膀賊膨出、直肠膨出。
[007引 2、组织RNA的获取
[00巧]使用化izol-步法提取组织总RNA，通过化no化op ND-1000读取26化m和280nm处 的吸光度值(A)测定RNA溶液的纯度。经1%甲醒变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察， 检测RNA的完整性。
[0080] 3、基因忍片杂交及扫描
[0081 ] 总RNA经线性化扩增后，cy3-UTP标记，巧光标记后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 纯化，用Amhion的RNA化agmen化tion Reagents对标记好的cRNAs进行片段化处理。采用美 国Agilent公司的人全基因表达谱忍片(4x 44K基因），在忍片杂交炉中65°C杂交17h，然后 洗脱、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner扫描仪扫描。
[0082] 4、忍片数据处理与分析
[0083] 杂交后的忍片经忍片扫描仪读取数据点后，将数据导入分析软件，对于两组比值 的自然对数绝对值大于2.0或小于0.5的基因作为差异表达基因。
[0084] 5、统计学处理
[0085] 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，组间差异比较采用单因素方差分析法，P< 0.05差异有显著性意义。
[0086] 6、结果
[0087] 忍片结果显示，子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织之间共筛选出654个差异表 达基因，其中表达水平上调的基因421个，表达水平下调的基因233个。
[0088] 实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因
[0089] 考虑现有技术中还未见关于该基因与子宫内膜癌相关性进行研究的基因作为候 选基因，同时考虑基因测序的结果，选择SKA3基因（其表达在子宫内膜癌组织中上调）进行 验证。
[0090] 1、样本收集
[0091] 按照实施例1的方法收集子宫内膜癌组织50例，正常子宫内膜组织60例。
[0092] 2、在mRNA水平上进行验证
[0093] 2.1提取组织RNA
[0094] 步骤同实施例1。
[0095] 2.2逆转录
[0096] 使用逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液对bg总RNA进行逆反录合成cDNA。采用25μ1 反应体系，每个样品取化g总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入W下组分:DEPC水，5 X逆 转录缓冲液，lOmmol/1 dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 MMLVRT，模板 RNA。42 °C解育1小时，72 °C 10分钟，短暂离屯、。
[0097] 2.3PCR
[0098] 使用引物设计软件Primer Premier 5.0设计mRNA巧光定量上下游PCR引物，合成 引物序列，使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒操作，具体步骤按说明书进行操作，采 用25μ1反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复Ξ次W上W保证结果的可 靠性。配制W下反应体系(如表1所示），各项操作均于冰上进行：
[0099] 表1巧光定量PCR各组分及相应体积
[0100]
[0101] WGAPDH为内参，WSYBR Green I作为巧光标记物，在Li曲t切cler巧光定量PCR 仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，Δ ACT法进行相对定量。
[0102] SKA3基因引物序列如下所示：
[0103] 上游引物:5'-ATGAAGATTACACAATGG-3'（沈Q ID N0.1);
[0104] 下游引物：5'-AGGAGAGTTGGTATATTC-3'（SEQ ID N0.2)。
[0105] GAPDH基因引物序列如下所示：
[0106] 上游引物：5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0107] 下游引物：5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.4)
[010引 2.4结果
[0109]结果如图1所示，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中SKA3基因的mRNA水 平明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)
[0110] 3、在蛋白水平上进行验证
[0111] 3.1提取组织总蛋白
[0112] 按照化i如化组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0113] 3.2Weste;rn blot检测
[0114] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗解育、二抗解育、 显色。
[0115] 3.3统计学处理
[0116] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，Wi3-actin为内参，将SKA3蛋白 条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统 计学意义。
[0117] 3.4 结果
[011引结果如图2所示，与正常子宫内膜组织相比，子宫内膜癌组织中SKA3蛋白水平显著 增加，差异具有统计学意义(P<0. 05)。
[0119] 实施例3抑制SKA3基因表达
[0120] UsiRNA设计合成
[0121] 针对 SKA3 的 siRNA 序列：
[0122] 正义链为5'-UCCAUUAGUACUUUUGUUGCC-3'（沈Q ID N0.5)
[0123] 反义链为5'-CAACAAAAGUACUAAUGGAAA-3'（沈Q ID N0.6);
[0124] W上S i RNA序列与阴性对照S i RNA序列（S i RNA-NC)均由上海吉玛制药技术有限公 司提供。
[0125] 2、子宫内膜癌细胞的培养与转染
[0126] 2.1细胞培养
[0127] IsMkawa3-H-12细胞系均用50ml的培养瓶贴壁培养于RPMI 1640培养基(含10% 胎牛血清，lOOU/ml青霉素，lOOg/ml链霉素）中，在37 °C，5 % C〇2饱和湿度的培养箱中连续培 养。
[012引 2.2细胞转染
[0129] (1)转染前24小时，在50化1无抗培养基中接种0.5-2*105个细胞，转染时细胞融合 度为30-50%。铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。
[0130] (2)用50μ1无血清培养基稀释siRNA(转染细胞的终浓度为33nM，轻轻吹吸3-5次混 匀。
[0131 ] (3)轻轻颠倒混匀转染试剂，用5〇41无血清培养基稀释化1^9(^6(31日1]1；[]162000轻 轻吹吸3-5次混匀，室溫下静置5min。
[0132] (4)混合转染试剂和SiRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室溫下静置20min。
[0133] (5)转染复合物加入到24孔细胞板中，100μΙ/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。
[0134] (6)细胞板置于37 °C，5 %C〇2培养箱中培养18-48小时。转染4-6小时后可换鲜培养 基。
[0135] 3、利用QPCR实验检测S iRNA的干扰效率
[0136] 3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0137] 3.2逆转录
[013引步骤同实施例2。
[0139] 3.3QPCR
[0140] 步骤同实施例2。
[0141] 3.4 结果
[0142] 结果如图3所示，siRNA-SKA3能够有效的抑制SKA3基因的表达，差异具有统计学意 义(P<0.05)。
[0143] 实施例4 SKA3基因的表达对子宫内膜癌细胞增殖能力的测定
[0144] 1、步骤：
[0145] 应用5-漠-2/脱氧尿喀晚(Brd U)标记及检测试剂盒。参照试剂盒使用说明，细胞 转染(转染步骤同实施例3)48小时后，吸弃培养基，加入化d U标记培养基，37°C，5 %C〇2培 养箱中培育60min。弃去培养基，PBS冲洗后，W 70 %乙醇固定，过夜。用一抗为小鼠的抗化d U抗体，二抗为带FITC的抗小鼠的巧光抗体，进行免疫反应。然后进行流式细胞学检测。
[0146] 2、化d U渗入结果：
[0147] 结果显示:转染siRNA-NC细胞组渗入率平均为：（27.14±1.42)% ;siRNA-SKA3细 胞组渗入率平均为(9.12±0.74) %，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明， SKA3基因表达促进了子宫内膜癌细胞的增殖。
[0148] 实施例5子宫内膜癌细胞抗体中和实验
[0149] 1、步骤：
[0150] 将子宫内膜癌细胞Ishikawa3-H-12接种于96孔细胞培养板中，每孔2*103个细胞/ 孔/200μ1，细胞贴壁后进行如下处理：
[0151] 实验组1(对照组）：子宫内膜癌细胞中加入无关单抗(1:50);
[0152] 实验组2:子宫内膜癌细胞中加入抗人SKA3单抗(1:50)。
[0153] 将细胞在37°C、5%C02培养箱解育24小时后，加入化-TdRQyCi/孔），再培养24小 时，收集细胞，加液体闪烁液，的十数仪检测cpm值。
[0154] 2、统计学方法
[0155] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具 有统计学意义。
[0156] 3、结果
[0157] 结果如图4所示，相比于对照组，加入抗人SKA3单抗的细胞组细胞增殖减缓。上述 实验结果表明，抑制SKA3蛋白的功能可W抑制子宫内膜癌细胞增殖。
[015引实施例6流式细胞仪测定SKA3基因表达对细胞调亡的影响
[0159] 购买抓公司的AnnexinV-門TC细胞调亡检测试剂盒进行细胞调亡的检测。
[0160] 1、细胞培养与转染
[0161] 步骤同实施例3。
[0162] 2、调亡检测
[0163] (1)细胞用不含的膜酶消化收集；
[0164] (2)用洗涂细胞二次(离屯、收集细胞5*1〇5);
[01 化](3)加入500μ1 binding buffer悬浮细胞；
[0166] (4)加入?5μ1 AnnexinV-FUC混匀后，加入?5μ1 Propidium Iodide混匀；
[0167] (5)室溫、避光、反应 5-15min;
[0168] (6)在化内，进行流式细胞仪的观察和检测；
[0169] (7)用流式细胞仪检测，激发波长Ex = 488nm发射波长血=530nm。
[0170] 3、统计学方法：
[0171] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具 有统计学意义。
[01巧 4、结果：
[0173] 实验结果显示，转染siRNA-NC细胞组细胞平均调亡率为12%，转染siRNA-SKA3组 细胞平均调亡率为38%，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0174] 实施例7 Transwell实验检测SKA3基因表达对细胞迁移的影响
[0175] 步骤；
[0176] 1、从-80°C的冰箱中取出冻存的Ma化i ge 1物，然后在4 °C溫度条件下过夜，使其变 成液体。
[0177] 2、取出20化1无血清细胞培养基，加入50μ1的Ma化igel试剂，在低溫条件，最好是 在冰面上操作将其混和均匀，然后各加入1〇化1，放在37°C，二氧化碳的培养箱中培育化，此 间常观察液体情况，当液体变成稍白色时，说明其已变为凝固态。
[0178] 3、将转染过的细胞(按照实施例3步骤操作）用膜酶消化，用不含血清的培养基清 洗3次，然后计数，再将其配成细胞悬浮液。
[0179] 4、用无血清的培养基将凝胶轻轻洗1次，然后将2*105细胞悬浮于100μΙ RPMI 1640中，再接种于transwell上室。
[0180] 5、下室加600μ1 10%FBS RPMI 1640。
[0181] 6、37 °C培养箱中，培养1化后，取出transwe 11小室，每组均重复4个样本。
[0182] 7、其中1个小室弃去培养基，用无巧的PBS洗3遍，4%多聚甲酵固定lOmin，棉签擦 掉上层未迁移的细胞，PBS洗3遍，结晶紫染色或Giemsa染色，在显微镜下观察。剩余3个小室 将其下层迁移细胞用0.25%膜蛋白酶消化，计算迁移细胞数。
[0183] 结果：
[0184] 迁移实验结果显示，转染siRNA-NC细胞组细胞迁移个数平均为230个，转染siRNA- SKA3细胞组细胞迁移个数平均为126个，差异具有统计学意义(P<0.05)。
[0185] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测SKA3基因或SKA3蛋白的产品在制备诊断子宫内膜癌或预测子宫内膜癌预后的 工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测SKA3基因或SKA3蛋白的产品包括 检测SKA3基因或SKA3蛋白的表达水平的产品。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合SKA3基因的核 酸或者能够结合SKA3蛋白的物质;所述核酸能够检测SKA3基因的表达水平;所述物质能够 检测SKA3蛋白的表达水平。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增SKA3基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。5. -种诊断子宫内膜癌或预测子宫内膜癌预后的工具，其特征在于，所述工具包括能 够检测SKA3基因或SKA3蛋白的表达水平的工具。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合SKA3基因的核酸或 者能够结合SKA3蛋白的物质;所述核酸能够检测SKA3基因的表达水平;所述物质能够检测 SKA3蛋白的表达水平。7. 根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增SKA3基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。8. -种治疗子宫内膜癌的药物，其特征在于，所述药物包含SKA3基因或SKA3蛋白的抑 制剂。9. 根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述抑制剂能够抑制SKA3或涉及SKA3上游 或下游途径的物质的表达或活性。10. 权利要求8或9所述的抑制剂在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106011260SQ201610491575
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月29日
【发明人】杨承刚, 宋宏涛
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司