咔唑?利凡斯的明二联体及其药物组合物和应用
【专利摘要】本发明提供了具有下述结构式的化合物或其药用盐、药物组合物及用途：。这些化合物涉及一系列咔唑和利凡斯的明的二联体，它们通过适当的接头连接，一方面可以发挥良好的神经保护作用，另一方面，促进神经干细胞的增殖。
【专利说明】
咔唑-利凡斯的明二联体及其药物组合物和应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及合成一系列咔唑和利凡斯的明的二联体，它们通过适当的接头连接。 本发明的化合物一方面可以发挥良好的神经保护作用；另一方面，促进神经干细胞(例如 C17.2)的增殖。本发明还涉及包含该二联体的药物组合物及其应用，以及它们的制备方法。
【背景技术】
[0002] 氧化应激被认为是导致阿尔茨海默病、帕金森氏症和脑缺血等多种神经系统疾病 的罪魁祸首之一。细胞内具有一套非常完善的抗氧化防御系统，可以维持活性氧或氧自由 基的水平，但是，在某些应激情况下，自由基的生成远远超过其清除，引起氧化失衡，从而导 致氧化应激，使细胞的功能发生改变，最终造成细胞的死亡。与其他器官相比，中枢神经系 统富含多不饱和脂肪酸、需要消耗大量的氧、缺乏内源性抗氧化蛋白，因此，中枢神经系统 更易受到氧化应激的损害。
[0003] 随着阿尔茨海默症(Alzheimer's disease, AD)病情的发展，患者大脑皮层和海 马区的神经递质胆碱的含量明显减少，脑内Ach的合成减少，导致突触间Ach的水平下降以 及ACh受体的敏感性降低，最终使胆碱能神经元出现不可修复的损伤。研究表明提高脑内 ACh水平，能够改善患者的记忆和认知能力。利凡斯的明作为第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂， 能同时作用于乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶，抑制两者对胆碱酯酶的水解作用，提高体内 胆碱酯酶的水平，改善AD的症状。
[0004] 咔唑类化合物是一类极为重要的含氮芳香环类化合物。研究发现咔唑衍生物对中 枢神经系统多种疾病，尤其是AD相关的靶点显示出良好的生物活性。根据文献报道，具有咔 唑母核的衍生物能够对多个抗AD靶标，例如影响与Αβ生成相关的酶(BACE1和γ-分泌酶）、 抑制Αβ积聚、神经保护作用、抗炎、促进成体神经发生等。
【发明内容】
[0005] 基于以上研究，我们设计了咔唑-利凡斯的明的二联体及其衍生物，基于咔唑的优 点，再进一步引入胆碱酯酶抑制剂的药效团，以起到一药"多靶点、多功能"的协同效果。
[0006] 本发明涉及式(I)的化合物或药用盐：
式⑴ 其中， X为C或N; R为-N(CH3) 2或-N(CH3) (CH2CH3)。
[0007] 除非另外指明，本发明的化合物还意欲包括区别仅在于存在一个或多个同位素富 集的原子的化合物。例如，具有本结构的除了用氘或氚替换氢，或者用 13C或14C_富集的碳原 子替换碳原子，或15n-富集的氮以为的化合物属于本发明的范围内。
[0008] 本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含本发明的任何一个化合物或其药用 盐，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
[0009] 本发明另一方面提供本发明的任一化合物或其药用盐在制备治疗中枢神经系统 退行性疾病或病症的药物中的应用。在一些实施方式中，所述中枢神经系统退行性疾病或 病症包括阿尔茨海默病、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症或亨廷顿舞蹈病。
[0010] 本发明另一方面提供一种治疗或缓解中枢神经系统退行性疾病或病症的方法，所 述方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的本发明的任一化合物或其药用盐，或本发 明的药物组合物。在一些实施方式中，所述中枢神经系统退行性疾病或病症包括阿尔茨海 默病、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症或亨廷顿舞蹈病。
[0011] 本发明还预期，本发明的任一化合物的"药用盐、衍生物、溶剂化物、前药"也具有 相同的活性。"药用盐、衍生物、溶剂化物、前药"是指任何药用盐，酯，溶剂化物，或经施用于 接受者后能够提供(直接或间接)本文所述化合物的其他化合物。然而，应当理解非药用盐 也属于本发明的范围内，因为那些可能用于制备用盐，盐，前药和衍生物的制备可以通过本 领域已知的方法进行。例如，本发明提供的化合物的药用盐可以通过常规方法由母体化合 物合成，该母体化合物含有碱或酸部分。通常，该盐例如通过将游离酸或碱形式的这些化合 物与化学计算量的适当碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中制备。通常，非 水性介质如乙醚，乙酸乙酯，乙醇，异丙醇或乙腈是优选的。酸加成盐的实例包括无机酸加 成盐例如，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硫酸盐，硝酸盐，和有机酸加成盐，如例如乙酸盐， 马来酸盐，富马酸盐，柠檬酸盐，草酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，苹果酸盐，扁桃酸盐和对甲苯 磺酸盐。碱加成盐的实例包括无机盐如钠、钾、钙、铵、镁、铝和锂盐；以及有机碱如乙二胺、 乙醇胺、N，N-二烷基乙醇胺、三乙醇胺、葡糖胺和碱性氨基酸盐。
[0012] 优选的衍生物或前药是相对于母体物质，当将这些化合物使用于患者时提高本发 明化合物的生物利用度(例如通过使得口服给药的化合物更容易被吸收到血液中）或增强 母体化合物向生物区室(例如脑或淋巴系统）的传递的那些。
[0013] 式（I)化合物前药的任何化合物属于本发明的范围内，术语"前药"以其最广泛的 意义使用并且包括在体内转化为本发明化合物的那些衍生物。这些衍生物对于本领域技术 人员是显而易见的，并且根据分子中存在的官能团，包括不限于本发明化合物的下列衍生 物:酯;氨基酸酯;磷酸;金属盐硫酸;氨基甲酸酯和酰胺。
[0014] 本发明的化合物可以是作为有利化合物或作为溶剂化物的晶体形式，意欲将两种 形式都包括在本发明的范围内。溶剂化的方法是本领域公知的。适当的溶剂化物是药用溶 剂化物。在一个具体实施方案中，溶剂化物是水合物。
[0015] 本发明的化合物一方面可以发挥良好的神经保护作用；另一方面，促进神经干细 胞(例如C17.2)的增殖，并且能够同时抑制AChE和BuChE的活性，综合了咔唑和利凡斯的明 的优点，起到了一药"多靶点、多功能"的协同效果。
【附图说明】
[0016] 图1.化合物对L-glutamate诱导HT22细胞死亡的保护作用和对HT22细胞的细胞 毒性。
[0017] 图2.化合物促进C17.2神经干细胞的细胞活力。
[0018]图3.化合物5a对C17.2神经干细胞的促增殖作用。
[0019] 图4.化合物5a对HUVEC细胞活力的影响。
[0020] 图5.化合物5a对L02细胞活力的影响。
【具体实施方式】
[0021] 以下描述用于制备本发明化合物的合成方法。
[0022] 下述反应路线例举了制备本发明的化合物的方法。
[0023] 反应路线 合成条件：（a) K2 ⑶3，CH3CN，90 °C，6 h; (b) Et3N，95 °C，overnight; (c) SnCh，EtOAc/EtO，50 °C，5 h; (d) BiCl3, Cyclohexane, N2, 80 °C，36 h. 其步骤为:将化合物1与环氧氯丙烷混合，得到中间体2。再将原料3与不同的酰氯反应， 得到中间体4a和4b;将原料6间硝基苯酚与不同的酰氯反应，再经过还原，得到中间体7a和 7b。最后将4a，4b，7a，7b分别与中间体2反应，即可合成得到式（I)所示最终产物5a，5b，8a， 8b 〇
[0024] 实施例1:化合物2
将原料1(3.00 g)溶于100 ml乙腈中，加入环氧氯丙烷(31.00 g)、无水碳酸钾（2.50 g)。反应体系在90°C反应6小时，加入140 ml水、200 ml二氯甲烷，萃取分层、收集有机相。有 机相用100 ml 0.2 Μ盐酸洗涤一次后用无水硫酸镁干燥，抽滤、真空浓缩得黄色固体。初 产物用乙酸乙酯/石油醚重结晶得到白色固体1.37 g。产率:40%。咕匪1?(400 1抱，0130-de) δ 8.48 (d, /= 1.9 Hz, 2H), 7.7-7.64 (m, 2H), 7.64-7.59 (m, 2H), 4.84 (dd, /= 15.8, 2.9 Hz, 1H), 4.42 (dd, /= 15.8, 5.8 Hz, 1H), 3.32-3.29 (m, 1H), 2.84-2.62 (m, 1H), 2.55-2.52 (m, 1H). 实施例2:化合物4a
将原料3(0.30 g)、二甲氨基甲酰氯(0.29 g)、三乙胺(3 g)混合加入烧瓶中，95°C回流 反应过夜，加50 ml二氯甲烷溶解，75°C真空浓缩，加50 ml二氯甲烷复溶，然后用0.5 Μ氢氧 化钠溶液洗涤三次。混合有机相，用无水硫酸镁干燥、抽滤得到粘稠状物质。真空干燥，得到 0.29 g棕黄色固体。产率：59%</Η MMR (400 MHz, DMSO-?) δ 7.41 (t, /= 7.8 Hz, 1H), 6.28 (dd, /= 8.0, 0.5 Hz, 1H), 6.13 (dd, /= 7.6, 0.5 Hz, 1H), 6.08 (br, 1H), 2.93 (d, /= 44.0 Hz, 6H). 实施例3:化合物4b
将原料3(0.30 g)、N-甲基乙基氨基甲酰氯(0.33 g)、三乙胺（3 g)混合加入烧瓶中， 95° C回流反应过夜，加50ml二氯甲烷溶解，75° C真空浓缩，加50 ml二氯甲烷复溶，然后用 0.5 Μ氢氧化钠溶液洗涤三次。混合有机相，用无水硫酸镁干燥、抽滤得到粘稠状物质。真空 干燥，得到0.29 g棕黄色固体。产率：55%</Η MMR (400 MHz, DMSO-?) δ 7.41 (t, / = 7.8 Hz, 1H), 6.28 (d, /= 7.9 Hz, 1H), 6.13 (d, /= 7.5 Hz, 1H), 6.08 (br, 2H), 3.30-3.23 (m, 2H), 2.91 (d, /= 40.2 Hz, 3H), 1.18-1.05 (m, 3H). 实施例4:化合物7a
将原料6(1.00 g)、二甲氨基甲酰氯(0.77 g)、三乙胺(3 g)混合加入烧瓶中，95°C回流 反应过夜，加50 ml二氯甲烷溶解，75°C真空浓缩，加50 ml二氯甲烷复溶，然后用0.5 Μ氢氧 化钠溶液洗涤三次。混合有机相，用无水硫酸镁干燥、抽滤得到粘稠状物质。真空干燥，得到 1.23 g棕黄色固体。称量0.42 g棕黄色固体、并与氯化亚锡（1.72 g)、乙酸乙酯（10 ml)、无 水乙醇（10 ml)混合，室温下反应2 h，然后50°C反应5小时。向混合物中加入50 ml乙酸乙 酯，用0.5 Μ氢氧化钠溶液洗涤一次，收集有几层，再用饱和氯化钠溶液洗涤两次，有机层用 硫酸镁干燥，抽滤、浓缩得到0.25 g黄色固体。产率：559^? M1R (400 MHz, DMSO-?) δ 6.97 (t, /= 7.2 Hz, 1H), 6.39 (d, /= 7.9 Hz, 1H), 6.28 (s, 1H), 6.20 (d, J =7.8 Hz, 1H), 5.27 (br, 2H), 2.94 (d, /= 46.1 Hz, 6H). 实施例5:化合物7b
将原料6(1.00 g)、N-甲基乙基氨基甲酰氯(0.87 g)、三乙胺(3 g)混合，95°C回流反应 过夜，加50 ml二氯甲烷溶解，75°C真空浓缩，加50ml二氯甲烷复溶，然后用0.5 Μ氢氧化钠 溶液洗涤三次。混合有机相，用无水硫酸镁干燥、抽滤得到粘稠状物质。真空干燥，得到1.30 g棕黄色固体。称取0.47 g棕黄色固体，并与氯化亚锡（1.80 g)、乙酸乙酯（10 ml)、无水乙 醇（10 ml)混合，室温下反应2 h，然后50°C反应5小时。向混合物中加入50 ml乙酸乙酯，用 0.5 Μ氢氧化钠溶液洗涤一次，收集有几层，再用饱和氯化钠溶液洗涤两次，有机层用硫酸 镁干燥，抽滤、浓缩得到0.30 g黄色固体。产率:60%。咕NMR (400 MHz, DMSO-?) δ 6.97 (t, /= 8.0 Hz, 1H), 6.45-6.37 (m, 1H), 6.28 (t, /= 2.1 Hz, 1H), 6.24-6.18 (m, 1H), 5.24 (br, 1H), 3.46-3.35 (m, 1H), 2.93 (d, /= 41.5 Hz, 2H), 1.20- 1.06 (m, 3H). 实施例6:化合物5a
将化合物2(0.24 g)、化合物4a(0.15 g)、氯化铋(0.15 g)混合，加入10 ml环己烷，氮 气保护下室温反应10分钟，然后81° C反应36 h。反应结束后向体系加入10 ml水、20 ml乙酸 乙酯，萃取分离水相和有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并用无水硫酸镁干 燥，抽滤、浓缩得到棕黄色油状液体，真空干燥后得到0.10 g黄色固体。产率:28%。咕匪R (400 MHz, mSO-de) δ 8.52-8.44 (m, 2H), 7.65-7.59 (m, 4H), 7.41 (t, /= 7.8 Hz, 1H), 6.29 (dd, /= 8.0, 0.5 Hz, 1H), 6.14 (dd, /= 7.6, 0.5 Hz, 1H), 6.08 (br, 1H), 5.53 (d, /= 5.4 Hz, 1H), 4.49 (dd, /= 14.9, 3.9 Hz, 1H), 4.37 (dd, /= 14.9, 8.0 Hz, 1H), 4.16-4.04 (m, 1H), 3.75 (dd, /= 11.1, 4.7 Hz, 1H), 3.66 (dd, /= 11.1, 5.7 Hz, 1H), 2.99 (s, 3H), 2.88 (s, 3H). 13C NMR (101 MHz, MSO-de) δ 159.79, 157.86, 154.07, 140.43, 140.08, 129.19, 123.72, 123.49, 112.58, 111.85, 105.31, 102.29, 69.73, 47.96, 47.02, 38.71, 36.55. HRMS (ESI): calcd for (M+Na)+(C23H22〇3N4Br2Na+) 582.9951， found 582.9965. 实施例7:化合物5b
将化合物2(0.24 g)、化合物4b(0.15 g)、氯化铋(0.15 g)混合，加入10ml环己烷，氮气 保护下室温反应10分钟，然后81°C反应36 h。反应结束后向体系加入10 ml水、20 ml乙酸乙 酯，萃取分离水相和有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并用无水硫酸镁干燥， 抽滤、浓缩得到棕黄色油状液体，真空干燥后得到0.11 g黄色固体。产率:30%。咕NMR (400 MHz, mSO-de) δ 8.50-8.45 (m, 2H), 7.64-7.59 (m, 4H), 7.41 (t, /= 7.8 Hz, 1H), 6.29 (d, /= 8.0 Hz, 1H), 6.17-6.02 (m, 2H), 5.54 (s, 1H), 4.48 (dd, / = 14.9, 3.9 Hz, 1H), 4.37 (dd, /= 14.9, 8.0 Hz, 1H), 4.15-4.07 (m, 1H), 4.03 (q, /= 7.1 Hz, 2H), 3.75 (dd, /= 11.1, 4.7 Hz, 1H), 3.65 (dd, /= 11.1, 5.7 Hz, 1H), 2.92 (d, /= 40.0 Hz, 3H), 1.18 (t, /= 7.1 Hz, 3H). 13C 匪R (101 MHz, MSO-de) δ 159.71, 157.76, 157.67, 153.70, 153.58, 140.51, 140.09, 129.19, 123.72, 123.49, 112.59, 111.85, 105.40, 102.46, 102.26, 69.73, 47.96, 47.02， 43.97, 34.16, 34.04， 13.56. HRMS (ESI): calcd for (M+H)+(C24H25〇3N4Br2+) 575.0288,found 575.0301. 实施例8:化合物8a
将化合物2(0.20 g)、化合物7a(0.11 g)、氯化铋(0.15 g)混合，加入10 ml环己烷，氮 气保护下室温反应10分钟，然后81° C反应36 h。反应结束后向体系加入10 ml水、20 ml乙酸 乙酯，萃取分离水相和有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并用无水硫酸镁干 燥，抽滤、浓缩得到棕黄色油状液体。然后用硅胶柱梯度洗脱过柱(洗脱剂为乙酸乙酯/石油 醚）。得到0.035 g黄色固体。产率：12%。咕 MMR (400 MHz, DMSO-?) δ 8.47-8.45 (m, 2H), 7.63-7.55 (m, 4H), 7.04 (t, /= 8.1 Hz, 1H), 6.46 (dd, /= 8.2, 1.4 Hz, 1H), 6.33 (t, /= 1.9 Hz, 1H), 6.26 (dd, /= 7.6, 1.8 Hz, 1H), 6.00-5.80 (m, 1H), 5.27-5.14 (m, 1H), 4.52-4.44 (m, 1H), 4.39-4.31 (m, 1H), 4.11-4.03 (m, 1H), 2.96 (d, /= 44.0 Hz, 6H). 13C NMR (101 MHz, DMSO-?) δ 154.59，152.88， 150.29, 140.16, 140.08, 129.72, 129.08, 123.70, 123.67, 123.45, 123.42, 112.66, 112.60, 111.73, 111.69, 109.78, 109.58, 105.99, 68.50, 47.81, 47.71, 36.71, 36.54. HRMS (ESI): calcd for (M+H)+(C24H24〇3N3Br2+) 560.0179， found 560.0189. 实施例9:化合物8b
将化合物2(0.20 g)、化合物7b(0.10 g)、氯化铋(0.15 g)混合，加入10 ml环己烷，氮 气保护下室温反应10分钟，然后81° C反应36 h。反应结束后向体系加入10 ml水、20 ml乙酸 乙酯，萃取分离水相和有机相，水相用乙酸乙酯萃取两次，合并有机相并用无水硫酸镁干 燥，抽滤、浓缩得到棕黄色油状液体。然后用硅胶柱梯度洗脱过柱(洗脱剂为乙酸乙酯/石油 醚）。得到0.030 g黄色固体。产率：10%</Η NMR (400 MHz, DMSO-?) δ 8.46 (d, /= 1.8 Hz, 2H), 7.65-7.53 (m, 4H), 7.04 (t, /= 8.1 Hz, 1H), 6.46 (dd, /= 8.1, 1.5 Hz, 1H), 6.36-6.30 (m, 1H), 6.26 (dd, /= 7.9, 1.6 Hz, 1H), 5.86 (t, /= 5.9 Hz, 1H), 5.18 (d, /= 5.3 Hz, 1H), 4.49 (dd, /= 14.9, 3.8 Hz, 1H), 4.35 (dd, /= 14.9, 8.0 Hz, 1H), 4.11-4.05 (m, 1H), 3.44-3.34 (m, 2H), 2.94 (d, / = 38.0 Hz, 4H), 1.18 (t, /= 7.1 Hz, 3H). 13C 匪R (101 MHz, DMSO-?) δ154·25, 152.85, 150.30, 140.16, 129.73, 129.08, 123.67, 123.41, 112.67, 111.68, 109.69, 109.57, 106.01, 68.49, 47.81, 47.71, 43.88, 34.33, 34.02, 13.56. HRMS (ESI): calcd for (M+H) + (C25H26〇3N3Br2+) 574.0335，found 574.0347. 实施例10:抑制L-glutamate诱导细胞毒性作用 小鼠海马神经元细胞株HT22,用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基，在37°C，饱和湿 度，含体积分数为5% C02、95%空气的二氧化碳培养箱中常规培养。取对数生长期细胞，以 0.25%胰酶消化后，完全培养基重悬，显微镜下细胞计数板计数并调整细胞浓度为10 X 104 个/ml，接种96孔细胞培养板，100 μ!7孔，培养过夜，使细胞贴壁。将96孔板中培养基吸走， 待测化合物用DMS0溶解，用完全培养基稀释，加入到96孔板中，100 μ!7孔。预孵育30 min 后，加入2 yL lOOmM L-glutamate。模型组不加待测化合物，直接加入2 yL lOOmM L-glutamate。孵育24 h后，每孔加入10 yL 5mg/mL MTT，孵育2h，弃去上清，加 DMSO 100 μ!7 孔，振荡使生成物formazan充分溶解，在酶标仪上测定各孔吸光度值，测定波长570 nm。采 用公式化合物促进细胞的存活率(％)=1 〇〇%* (A待) / (Α|_-Α?)计算细胞存活率。 结果见图1。
[0025]实施例11:促进C17.2神经干细胞的细胞活力 小鼠神经干细胞细胞株C17.2，用含10%胎牛血清、5%马血清和2 mM L-谷氨酰胺的DMEM 完全培养基，在37°C，饱和湿度，含体积分数为5% C02、95%空气的二氧化碳培养箱中常规 培养。取对数生长期细胞，以〇. 25%胰酶消化后，完全培养基重悬，显微镜下细胞计数板计数 并调整细胞浓度为10 X 1〇4个/ml，接种96孔细胞培养板，100 μ!7孔，培养过夜，使细胞贴 壁。将96孔板中培养基吸走，待测化合物用DMS0溶解，用完全培养基稀释，加入到96孔板中， 100 μ!7孔。孵育24 h后，每孔加入10 yL 5mg/mL ΜΤΤ，孵育2h，弃去上清，加 DMS0 100 μ!7 孔，振荡使生成物formazan充分溶解，在酶标仪上测定各孔吸光度值，测定波长570 nm。采 用公式化合物促进细胞的存活率(％) = 1〇〇%*(Α待/ (A機粗-Ase)计算细胞存活 率。结果见图2。
[0026] 实施例12: BrdU掺入法检测细胞增殖 实验前，C17.2细胞经10 μΜ的Brdu处理4h。
[0027] (1)取出盖玻片，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次； (2) 加入适量预冷的95%乙醇，室温固定30 min; (3) 弃去固定液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5 min; (4) 加入适量0.5% Triton-X 100溶液，室温放置30 min; (5) 弃去0.5% Triton-X 100溶液，用roS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5 min; (6) 加入适量2 N盐酸溶液，室温放置30 min; (7) 弃去2 N盐酸溶液，用roS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5 min; (8) 加入适量硼酸缓冲液，室温放置12 min; (9) 弃去硼酸缓冲液，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，每次5 min; (10) 加入适量2% BSA溶液，室温放置15 min; (11) 弃去2% BSA溶液，加入适量2% BSA溶液稀释的一抗，于4 °C孵育过夜； (12) 弃去一抗，用2% BSA溶液轻轻洗涤细胞3次，每次5 min; (13) 加入适量2% BSA溶液稀释的荧光二抗，室温放置1.5 h; (14) 弃去二抗，用2% BSA溶液轻轻洗涤细胞3次，每次5 min; (15) 加入DAPI工作液(5 yg/mL)，室温放置10 min; (16) 弃去DAPI工作液，用2% BSA溶液轻轻洗涤细胞3次，每次5 min; (17) 把盖玻片撬起，将贴有细胞面的盖玻片朝下，贴在滴有抗荧光淬灭封片剂的载玻 片上，透明指甲油封片； (18) 激光共聚焦上机，拍照。结果见图3。
[0028] 实施例13:化合物5a对HUVEC和L02细胞活力的影响 人脐静脉内皮细胞株HUVEC和人正常肝细胞株L02,用含10%胎牛血清的DMEM完全培养 基，在37°C，饱和湿度，含体积分数为5% C02、95%空气的二氧化碳培养箱中常规培养。取 对数生长期细胞，以0.25%胰酶消化后，完全培养基重悬，显微镜下细胞计数板计数并调整 细胞浓度为10 X 1〇4个/ml，接种96孔细胞培养板，100 μ!7孔，培养过夜，使细胞贴壁。将96 孔板中培养基吸走，待测化合物用DMS0溶解，用完全培养基稀释，加入到96孔板中，100 μL7 孔。孵育24 h后，每孔加入10 yL 5mg/mL ΜΤΤ，孵育2h，弃去上清，加 DMS0 100 μ!7孔，振荡 使生成物formazan充分溶解，在酶标仪上测定各孔吸光度值，测定波长570 nm。采用公式化 合物促进细胞的存活率(％)=1〇〇%*(Α待/ (Α|_-Α?)计算细胞存活率。结果见 图4和图5。
[0029] 实施例14:抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BuChE)的活性 反应体系总体积200 yL，其中AChE终浓度为0.03 U/mL(BuChE终浓度为0.05 U/mL)， DTNB终浓度500 μΜ，底物硫代乙酰胆碱或硫代丁酰胆碱终浓度500 μΜ，同时设对照组(0.1 M pH 8.0 PBS代替待测化合物)和空白组(酶稀释液代替酶溶液）。
[0030] 96孔板中每孔加入2 yL酶溶液(或酶稀释液），40 yL DTNB，118 yL ros，20 UL待 测化合物（10XX37 °C孵育20 min，最后加入20 uL底物。在412 nm处测定5 min内吸光度变 化(每隔1 min读数一次）。单次实验每个浓度设2个复孔，重复三次实验。结果见表1。
[0031] 表1.化合物抑制AChE和BuChE的活性
an.t. means no test. b n.a. means no active. 实施例15:平行人造膜通透性测定方法测定血脑屏障透过性 1)米用平行人工膜渗透模型（parallel artificial membrane permeability assay PAMPA)研究化合物的膜渗透作用。猪脑脂质PBL溶于链烷中，浓度为2%。滴加4 μL的PBL到 96-孔1^受体板亲脂性滤膜上以模拟生物膜，加入300 1^的？85/^切!1(7:3)缓冲液，在供 体管中加入化合物样品液(0.1 mg/ml)，将96孔滤膜置于接收板上，使磷脂膜能接触到供体 液，如此形成三明治结构，25°C静置10小时，待扩散完毕，分别吸取受体液和供体液，用紫外 分光光度计测定浓度。化合物设置4个复孔，检测五个波长，n=3，以平均值±标准误表示。
[0032] 2)在每次实验中，用13种已商品化的上市药物来进行验证分析。根据下面公式计 算凡值，结果见表2。
[0033] 式中Vd是接受池的体积，Va是接受池的体积，A是膜面积，t是渗透时间， 是接受池的吸光度，[c/rag'iUuiiibri?是理论平衡吸光度。
[0034] 表2.血脑屏障透过性·
a PeXl(TB cm 值大于5.3,则化合物能够透过血脑屏障，小于2.4被定义为不能透过 血脑屏障。
【主权项】
1. 一种具有下述结构式的化合物或其药用盐：式(I) 其中， X为C或N; R为-N(CH3)2或-N(CH3) (CH2CH3)。2. -种药物组合物，包括如权利要求1所述的任一化合物或其药用盐，以及药学上可接 受的载体或赋形剂。3. 权利要求1的任一化合物或其药用盐在制备治疗中枢神经系统退行性疾病或病症的 药物中的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，所述中枢神经系统退行性疾病或病症包括阿尔茨海默 病、帕金森氏症、肌萎缩侧索硬化症或亨廷顿舞蹈病。
【文档编号】C07D209/88GK106045972SQ201610385701
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】皮荣标, 颜金武, 杨晓红, 陈紫薇, 王胜男, 陈景考
【申请人】中山大学