一种结直肠癌腹膜转移模型及其建立方法
【专利摘要】本发明涉及一种小鼠结直肠癌腹膜转移模型及其建立方法。包括如下步骤：(1)采用慢病毒转染构建具有萤火虫素荧光酶基因的HCT116细胞，使其在底物激发下能够发出波长在500～600nm的近红外光；(2)于小鼠腹腔注射10*5个细胞/只进行造模；(3)通过活体内借助D?luciferin对肿瘤进行定位，实时观测癌症发生过程。本发明优点在于：本发明采用灵敏精准的活体荧光成像系统进行实时评测体内成瘤及转移情况，避免了传统的通过解剖小鼠来判定模型的建立成功，又更好地及时地观察疾病病理进展过程。
【专利说明】
一种结直肠癌腹膜转移模型及其建立方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种结直肠癌腹膜转移模型及其建立方法。
【背景技术】
[0002]结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率在我国仅次于肺癌、胃癌、肝癌、食管癌，据全国城乡主要恶性肿瘤估计分析，结肠癌新发病例数达20万，死亡人数达10万，在美国结肠癌是第三大常见的肿瘤，2008年估计有149000新发病例，近50000人死于结肠癌。目前我国结、直肠癌的发病率仍处于逐年上升的过程，每年新发病病例约增加2%。结肠癌的标化发病率迅速上升，与1972年比，2000年标化发病率男性增加134%，女性增加135%。
[0003]由于人类的特殊性以及从伦理方面考虑，在人结肠癌转移机制及抗转移治疗方法的研究上，都需要与人结肠癌更接近、更理想的动物模型。肿瘤的发生和发展过程是一个多因素、多步骤的复杂生物学演变过程。目前结肠癌转移相关机制尚未完全查明，肿瘤转移动物模型在肿瘤转移的研究中占有极其重要的地位，因此无论是对结肠癌转移过程和转移相关机制的研究还是对结肠癌的临床防治研究，最终都要依靠适宜的动物模型来进行。
[0004]目前，常用于建立小鼠结肠癌模型的方法包括自发及原位诱发小鼠结肠癌模型和移植性小鼠结肠癌模型，后者根据移植物分为细胞移植和组织移植，根据部位的不同，又可分为皮下移植、肝脏移植和原位移植。一个理想合适的动物模型应该可以成功模拟人类从临床发病到疾病转移以及最后发展的各个方面，主要概括为以下标准:1、肿瘤细胞需要具有活力和转移的潜质。2肿瘤细胞需要能够达到而且侵及到肝脏组织，最终可以在肝脏生长成为肿瘤结节。3、动物模型应具有较高的有效性。4、动物模型应具有可重复性。5、动物模型应该具有实用性。现有技术的结肠癌小鼠模型要么制备周期长、成瘤均一度差;要么未能完全模拟自然转移过程、并发症多;要么制备操作复杂、成功率较低、模型不稳定。由于小鼠肠壁菲薄纤细，注射针极易刺穿肠壁，致使结肠壁原位注射手术难度较大，或者因为刺穿肠壁，导致肿瘤接种失败，或者由于漏液造成肠外腹腔多处种植。即使成功致瘤，也易于出现因接种部位肿瘤组织呈团块状生长过大，造成肠腔梗阻，导致小鼠死亡。
[0005]本发明采用慢病毒转染构建具有萤火虫素荧光酶基因的HCTl16细胞，使其在底物激发下能够发出波长在500?600nm的近红外光。通过活体内借助D-1ucifer in对肿瘤进行定位，实时观测癌症发生过程。本发明采用灵敏精准的活体荧光成像系统进行实时评测体内成瘤及转移情况，避免了传统的通过解剖小鼠来判定模型的建立成功，又更好地及时地观察疾病病理进展过程。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供结直肠癌腹膜转移模型的建立方法。
[0007]本发明的再一的目的是，提供由如上所述方法制备的小鼠结直肠癌腹膜转移模型。
[0008]本发明的另一的目的是，提供如上所述小鼠结直肠癌腹膜转移模型的鉴定方法。
[0009]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
[0010]—种结直肠癌腹膜转移模型的建立方法，包括如下步骤:
[0011 ] (I)采用慢病毒转染构建具有萤火虫素荧光酶基因的HCTl 16细胞，使其在底物激发下能够发出波长在500?600nm的近红外光；
[0012](2)取步骤I制备的HCT116细胞，培养细胞株，于小鼠腹腔注射1*5个细胞/只进行造模；
[0013](3)通过活体内借助D-1uciferin对肿瘤进行定位，实时观测癌症发生过程。
[0014]—种结直肠癌腹膜转移模型的建立方法，包括如下步骤:
[0015](I)采用慢病毒转染构建具有萤火虫素荧光酶基因的HCTl 16细胞，使其在底物激发下能够发出波长在500?600nm的近红外光；
[0016](2)取步骤I制备的HCT116细胞，培养细胞株，2*105个细胞/只Matrigel基质胶固定于于小鼠盲肠壁浆膜层；
[0017](3)通过活体内借助D-1uciferin对肿瘤进行定位，实时观测癌症发生过程。
[0018]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
[0019]如上任一所述的方法制备的小鼠结直肠癌腹膜转移模型。
[0020]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
[0021]如上所述小鼠结直肠癌腹膜转移模型的鉴定方法，包括如下步骤:
[0022](I)分别于3、11、16、22天活体荧光成像检测肿瘤的形成和发展；
[0023](2)肠系膜成像检测腹膜转移情况；
[0024](3)提取腹水瘤细胞，培养观察是否形成细胞球；
[0025](4)苏木精-伊红染色检查模型小鼠大网膜内新生血管及血管充血情况；
[0026](5)苏木精-伊红染色检查模型小鼠肠系膜坏死组织及粘膜缺损情况。
[0027]本发明优点在于:
[0028]1、本发明采用灵敏精准的活体荧光成像系统进行实时评测体内成瘤及转移情况，避免了传统的通过解剖小鼠来判定模型的建立成功，又更好地及时地观察疾病病理进展过程。
[0029]2、本发明采用慢病毒转染构建具有萤火虫素荧光酶基因的HCTl 16细胞，使其在底物激发下能够发出波长在500?600nm的近红外光。我们通过活体内借助D-1uciferin对肿瘤进行定位，实时观测癌症发生过程。
【附图说明】
[0030]附图1为腹腔注射接种腹膜转移模型，活体荧光成像检测肿瘤的形成和发展。
[0031]附图2为造模21天后，小鼠肠系膜成像(左，造模组；中，造模组;右，空白组)。
[0032]附图3为腹腔注射建立腹膜转移模型，腹水瘤细胞提取收集培养。
[0033]附图4为腹腔注射建立腹膜转移模型，小鼠大网膜切片H&E染色结果(A为空白对照组，B、C、D分别为3只腹膜转移模型实验组)。
[0034]附图5为腹腔注射建立腹膜转移模型，小鼠肠系膜组织切片H&E染色(E为空白对照组，F、G、H分别为3只腹膜转移模型实验组)。
[0035]附图6为盲肠壁接种腹膜转移模型，活体荧光成像检测肿瘤的形成和发展。
[0036]附图7为盲肠壁接种10*5个细胞/只进行造模，造模21天后小鼠肠系膜成像(左，造模组;右，造模组)。
【具体实施方式】
[0037]下面结合【具体实施方式】，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0038]实施例1腹腔注射结直肠癌细胞株建立腹膜转移模型
[0039]1、动物模型
[0040](I)腹腔注射，2*105个细胞/只
[0041]2、活体荧光成像
[0042]腹腔注射接种腹膜转移模型的建立，利用活体荧光成像检测肿瘤的形成和发展。
[0043]结果如图1所示，随着造模时间延长，小鼠体内腹腔形成了活体成像仪可检测到的一定数量的肿瘤细胞。
[0044]3、开腹成像
[0045]腹腔注射10*5个细胞/只进行造模。造模21天后，处死小鼠，肠系膜成像。
[0046]结果如图2所示。可看到小鼠肠系膜转移结节明显，并见明显腹水，上述结果表明:腹腔注射造模22天后发现小鼠体内有明显的腹膜转移情况。
[0047]4、腹水收集
[0048]腹腔注射建立腹膜转移模型，腹水瘤细胞提取收集培养。
[0049]实验结果如图3所示，水瘤细胞提取收集后，进行2D培养，发现极易形成细胞球。
[0050]5、H&E 染色
[0051 ]腹腔注射癌细胞方法建立模型下，大网膜切片H&E染色。
[0052]实验结果如图4所示，相较于空白组，模型组大网膜内多处出现明显的新生血管及血管充血现象。
[0053]腹腔注射癌细胞建立模型方法下，肠系膜组织切片H&E染色。
[0054]实验结果如图5所示，相较于空白组，模型组在肠系膜内出现红染无结构的坏死组织即粘膜及粘膜下层缺损，以及明显的炎症细胞浸润的情况。
[0055]实施例2盲肠壁原位接种进行腹膜转移模型的建立
[0056]1、动物模型
[0057]盲肠壁原位接种:2*105个细胞/只Matrigel基质胶固定于于盲肠壁楽膜层。
[0058]2、活体荧光成像
[0059]盲肠壁接种腹膜转移模型的建立，利用活体荧光成像检测肿瘤的形成和发展。
[0060]结果如图6所示，结果显示，注射后17-30d小鼠出现较明显的肝脏转移、肺转移等一系列的脏器转移。
[0061]3、开腹成像
[0062]盲肠壁接种10*5个细胞/只进行造模。造模21天后，处死小鼠，肠系膜成像。
[0063]结果如图7所示，可以看到，小鼠腹膜壁及肠系膜转移结节明显，上述结果表明:腹腔注射造模21天后小鼠体内明显的腹膜转移情况。
[0064]采用慢病毒转染构建具有萤火虫素荧光酶基因的HCTl16细胞，使其在底物激发下能够发出波长在500?600nm的近红外光。我们通过活体内借助D-1uciferin对肿瘤进行定位，实时观测癌症发生过程。
[0065]腹膜转移模型的两种建立方法:
[0066]I，腹腔注射结直肠癌细胞株;2，盲肠壁原位接种结直肠癌细胞株。
[0067]方法一的成功率为70?80%，出现肉眼可见的腹膜转移(肠系膜)以及腹水。同时，免疫学方法分别检测了大网膜及肠系膜的组织学形态。方法二的成功率为65?70%，出现肉眼可见的腹膜转移(腹膜壁和肠系膜)和多处脏器转移，包括肝、淋巴转移等。
[0068]我们采用了灵敏精准的活体荧光成像系统进行实时评测体内成瘤及转移情况，避免了传统的通过解剖小鼠来判定模型的建立成功，又更好地及时地观察疾病病理进展过程。
[0069]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种结直肠癌腹膜转移模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)采用慢病毒转染构建具有萤火虫素荧光酶基因的HCTl16细胞，使其在底物激发下能够发出波长在500?600nm的近红外光； (2)取步骤I制备的HCT116细胞，培养细胞株，于小鼠腹腔注射1*5个细胞/只进行造模； (3)通过活体内借助D-1uciferin对肿瘤进行定位，实时观测癌症发生过程。2.一种结直肠癌腹膜转移模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)采用慢病毒转染构建具有萤火虫素荧光酶基因的HCTl16细胞，使其在底物激发下能够发出波长在500?600nm的近红外光； (2)取步骤I制备的HCT116细胞，培养细胞株，2*105个细胞/只Matrigel基质胶固定于于小鼠盲肠壁浆膜层； (3)通过活体内借助D-1uciferin对肿瘤进行定位，实时观测癌症发生过程。3.权利要求1-2任一所述的方法制备的小鼠结直肠癌腹膜转移模型。4.权利要求3所述的小鼠结直肠癌腹膜转移模型的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)分别于3、11、16、22天活体荧光成像检测肿瘤的形成和发展； (2)肠系膜成像检测腹膜转移情况； (3)提取腹水瘤细胞，培养观察是否形成细胞球； (4)苏木精-伊红染色检查模型小鼠大网膜内新生血管及血管充血情况； (5)苏木精-伊红染色检查模型小鼠肠系膜坏死组织及粘膜缺损情况。
【文档编号】A61K49/00GK106047933SQ201610430738
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】蔡国响, 徐烨, 蔡三军, 孟献珂, 郑洪途, 李清国
【申请人】复旦大学附属肿瘤医院