一种透明质酸修饰红光碳点HA-R-CDs的制备方法及其在肺癌细胞靶向成像中的应用

本发明属于荧光纳米材料，具体涉及一种透明质酸修饰红光碳点ha-r-cds的制备方法及其在肺癌细胞靶向成像中的应用。

背景技术：

1、红光碳点(发射波长大于600nm)具有对生物组织损害小、深组织穿透能力和背景信号低等特点，而被广泛用于生物传感、荧光成像的材料设计当中。近年来，越来越多的具有长波长红光发射的碳点被制备出来。前驱体酸度环境是碳点红移的一个重要因素。但这种策略合成的碳点具有明显的嗜酸性，在碱性条件下，碳点表面的氨基去质子化导致荧光猝灭，并不适合在合成的碳点基础之上对其进一步的修饰。与水热法相比，采用溶剂热法制备红光碳点，不仅可以获得发光性质优异的长波长发射碳点，还可以避免水热法酸化红移碳点的嗜酸性特点。

2、肺癌是全世界发病率和死亡率高的恶性肿瘤之一，荧光成像导航技术可以为术中实时、精确地观察肿瘤及其周围健康组织提供切实可行的应对措施。通常，对荧光团修饰靶向分子可以促进细胞内吞。透明质酸(ha)，是一种分布于细胞外间质的天然高分子多糖，由重复的n-乙酰葡萄糖胺和d-葡萄糖醛酸两个亚基构成。ha因其具有生物相容性、可降解性、非免疫原性和高亲水性，参与着人体大多数的生理过程(包括细胞粘附、迁移和伤口愈合等)，并在其中发挥着重要作用。除此以外，ha与肺癌细胞表面高表达的cd44受体(细胞分化簇44受体)有很强的亲和力。基于ha和cd44受体的特殊相互作用，荧光碳纳米材料可以通过受体介导的内吞作用，被识别、结合并内化到肿瘤细胞，为靶向型荧光探针的构建用于细胞成像提供了良好的分子基础。

技术实现思路

1、为实现上述目的，本发明提供一种透明质酸修饰红光碳点ha-r-cds的制备方法及其在肺癌细胞靶向成像中的应用。

2、本发明采用的技术方案是：

3、一种透明质酸修饰红光碳点ha-r-cds的制备方法，包括以下步骤：

4、1)柠檬酸和尿素溶解于n,n-二甲基甲酰胺中，置于聚四氟乙烯反应釜中加热反应，反应结束后，向得到的深棕色溶液中加入naoh溶液，室温搅拌，离心得到沉淀，用超纯水对沉淀多次洗涤，收集上清液，通过冷冻干燥得到红光碳点粉末r-cds；

5、2)将n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入到透明质酸水溶液中，室温下搅拌活化透明质酸的羧基，得到混合液；将r-cds水溶液逐滴加入到上述混合液中，用naoh溶液调节溶液ph，室温下搅拌进行酰胺化反应，经纯化、冷冻干燥后，得到透明质酸修饰红光碳点粉末ha-r-cds。

6、进一步的，上述的制备方法，步骤1)中，柠檬酸和尿素的质量比为0.5-2:1；加热反应是在150-180℃下进行4-8h。

7、进一步的，上述的制备方法，步骤1)中，naoh溶液的浓度为30-60mg/ml，体积为10-30ml。

8、进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，透明质酸水溶液的浓度为5-15mg/ml；活化的时间为6-16h。

9、进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:0.8-1.4。

10、进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，r-cds水溶液的浓度为1-10mg/ml。

11、进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，ph范围为6-8。

12、进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，酰胺化反应的时间为12-36h。

13、进一步的，上述的制备方法，步骤2)中，纯化的步骤为：将酰胺化反应完的溶液用截留分子量为8000-14000da的透析袋透析6-24h，透析过程每隔4h更换一次超纯水。

14、上述任意一项所述的制备方法制备的透明质酸修饰红光碳点ha-r-cds在肺癌细胞靶向成像中的应用。

15、本发明的有益效果为：

16、1、本发明提供的透明质酸修饰红光碳点ha-r-cds的制备方法简单易行，无需复杂反应设备。

17、2、本发明所制备的透明质酸修饰红光碳点ha-r-cds最佳激发波长位于560nm，最大发射波长位于630nm，其荧光稳定性强，克服了有机染料水溶性差、抗光漂白性差的缺点。

18、3、本发明所制备的长波长碳点细胞毒性低，可靶向标记a549人肺癌细胞，并在细胞内发射明亮的红色荧光，其长波长发光特性可有效降低生物背景的干扰，增强了细胞内的荧光信号，在生物医学领域具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种透明质酸修饰红光碳点ha-r-cds的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，柠檬酸和尿素的质量比为0.5-2:1；加热反应是在150-180℃下进行4-8h。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，naoh溶液的浓度为30-60mg/ml，体积为10-30ml。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，透明质酸水溶液的浓度为5-15mg/ml；活化的时间为6-16h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，n-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1:0.8-1.4。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，r-cds水溶液的浓度为1-10mg/ml。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，ph范围为6-8。

8.根据权利要求1所述的其制备方法，其特征在于，步骤2)中，酰胺化反应的时间为12-36h。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，纯化的步骤为：将酰胺化反应完的溶液用截留分子量为8000-14000da的透析袋透析6-24h，透析过程每隔4h更换一次超纯水。

10.权利要求1-9中任意一项所述的制备方法制备的透明质酸修饰红光碳点ha-r-cds在肺癌细胞靶向成像中的应用。

技术总结
本发明公开了一种透明质酸修饰红光碳点HA‑R‑CDs的制备方法及其在肺癌细胞靶向成像中的应用。本发明以柠檬酸和尿素为原料，溶剂热法制备红光碳点R‑CDs，然后将与肺癌细胞表面高表达的CD44受体有特异性结合能力的透明质酸HA共价接枝于R‑CDs表面，构建了透明质酸修饰红光碳点HA‑R‑CDs。基于HA与肺癌细胞表面高表达的CD44受体之间的特异性亲和力，增强了荧光碳点与肺癌细胞结合率，易于通过胞吞内化作用主动摄入肺癌细胞，以此实现靶向荧光实时点亮癌细胞。本发明提供的透明质酸修饰红光碳点HA‑R‑CDs具有较好的pH稳定性和抗光漂白能力，最大荧光发射峰位于为630nm，其长波长发光特性降低了生物背景干扰，在肺癌细胞成像和术中导航定位癌细胞等医学领域具有广阔的应用前景。

技术研发人员：娄振宁,郝晓迈,王征,周欣雨,李婷婷,熊英,单炜军,崔俊硕,于海彪,冯小庚
受保护的技术使用者：辽宁大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15