一种聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片及其制备方法和应用

本发明属于纳米材料改性和应用领域，具体涉及一种聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片及其制备方法和应用。

背景技术：

1、随着再生医学和器官移植技术的迅猛发展，细胞、组织和器官的供应不足成为了制约此类生物医疗技术发展的瓶颈。而冷冻保存是当前实现生物样品长期存储的唯一有效手段，是细胞治疗、辅助生殖以及器官移植等先进医疗技术充分发展的关键技术之一。然而在细胞冷冻后复温的过程中，不免会发生冰重结晶现象，在这一过程中会对细胞造成不可逆的机械损伤。因此对冷冻过程中细胞内外冰晶生长的控制以及细胞冰损伤的降低是至关重要的。

2、通过添加渗透型小分子或者渗透型以及非渗透型的冷冻保护剂(cpa)可以实现生物样品的成功复苏，但是在对生物样品的解冻处理过程中，冰再结晶的问题会显著影响样品的存活质量和效率，因此，提出有效控冰方法是实现低温保存科学的关键。现阶段冷冻剂的材料体系多为小尺寸纳米材料或是动物源抗冻蛋白，该类纳米材料具有尺寸小，与蛋白质尺寸接近，并且容易进入细胞内部，引起不可预测的生殖或遗传毒性等问题；而动物源抗冻蛋白的使用则因为其提取困难，价格昂贵，含有病原体、病毒dna会造成表观遗传毒性等问题受到限制。目前，对于在冷冻保存的细胞被解冻后增加细胞存活率、复苏细胞的方法以及冷冻剂对细胞毒性的问题存在未满足的需求。

技术实现思路

1、针对上述现有的技术存在的问题，本发明提供一种聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片及其制备方法和应用，通过将聚乙烯醇(pva)与氧化石墨烯(go)纳米片进行复合，大大增强了氧化石墨烯纳米片对冰重结晶的抑制活性。本发明制备的pva-g-go纳米片本身具有良好的冰重结晶抑制活性以及光热转化能力，能够在短时间内迅速将冷冻保存的细胞复温，可以实现冷冻细胞的快速复苏和高细胞存活效率。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、本发明的第一个目的是提供一种聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片的制备方法，包括以下步骤：

4、将氧化石墨烯分散在分散剂中得到棕色溶液；以n,n’-二环己基碳二亚胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)为催化剂，以pva为修饰物，将它们加入至棕色溶液中，在适当温度下搅拌均匀直至聚乙烯醇和氧化石墨烯之间的酯化反应完成。反应完成后通过0.45μmptfe微孔膜过滤悬浮液，并使用dmf和丙酮彻底清洗残留物。为了完全去除未反应的pva，将产物溶解在热水中，并用0.45μm尼龙膜过滤。最后，用热水冲洗滤液，放入真空干燥箱中干燥即得到聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片，记为pva-g-go。优选的，所述分散剂为二甲基亚砜(dmso)，反应物溶于dmso有利于反应进行，但是产物不溶于dmso有利于反应结束后过滤产物。所述氧化石墨烯和聚乙烯醇的质量比为10:1。研究发现当pva聚合度在1500～2000范围内时，pva具有冰重结晶抑制活性，当聚乙烯醇的聚合度为1700～1800，pva的冰重结晶抑制活性更好。

5、本发明的第二个目的是提供一种聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片，其是采用如上述第一个目的中所述的制备方法制备所得。

6、本发明的第三个目的是提供一种冷冻保护剂，包含细胞培养基(deme)、胎牛血清(fbs)、dmso以及如第二个目的所述的聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片；所述冷冻保护剂中聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片的添加量为30％-80％。

7、本发明的第四个目的是提供一种冷冻保存细胞的方法，步骤如下：将细胞与上述第三个目的中所述的冷冻保护剂混合均匀，然后放入冰箱内进行低温冷冻保存。进一步的，所述低温冷冻保存的具体步骤为：先在-20℃冰箱保存2小时，后放入-80℃冰箱进行长期储存。

8、本发明的第五个目的是提供一种对冷冻保存的细胞进行复苏的方法，包括以下步骤：采用如上述第四个目的中所述的方法对细胞进行低温冷冻保存完成后，使用近红外激光对存放细胞的冻存管进行照射使其解冻。

9、本发明的有益效果如下：

10、本发明提供的聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片是由氧化石墨烯纳米片与低表面能聚合物pva合制备所得。首先，因为氧化石墨烯具有独特的蜂窝六角形支架型结构、低毒性以及较高的生物相容性等特点使其在生物材料的低温保存上有着广泛的应用；其次，由于pva具有丰富的羟基官能团，能够与氧化石墨烯表面的羧基发生酯化反应，从而使pva结合在氧化石墨烯的表面，本发明应用pva对go进行修饰，根据吉布斯-汤普森公式可得，经修饰后的go能够进一步增加界面曲率、降低界面自由能从而实现对过冷度的双重调控。本发明制备的纳米片可以吸附在冰晶表面，抑制冰晶重结晶，在用于细胞冻存的过程中能有效的避免细胞被冰晶损伤，同时该复合物具有良好的光热效应，在对细胞进行复苏的过程中能够极大的提高细胞的存活率。这种双向协同作用的高效冰重结晶抑制纳米材料的制备与开发能够为目前的低温冷冻保存技术的安全与进步提供新的思路与方法。

11、本发明制备的聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片作为控冰材料应用在冷冻保护剂中时，首先能够通过吸附和晶格匹配实现对生物样品解冻过程中冰重结晶的生长抑制，相对于纯水可以实现最高超过83％的冰晶尺寸控制，并且经过官能化修饰，相对于go可提升超过1倍的冰重结晶抑制活性。此外，通过外加激光场的作用，pva-g-go能够通过光热转换作用加快样品的复温速率，减少冰重结晶的时间(相对于传统的水热法可提升超过10倍)，从而达到降低由冰重结晶带来的机械损伤。本发明通过对hela细胞和a549肺癌细胞的冷冻复苏实验证明，经过官能化修饰的go在冷冻复苏过程中能够在维持低细胞毒性的前提下实现超高的细胞存活效率(＞97％)。

技术特征：

1.一种聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片的制备方法，其特征在于：所述氧化石墨烯和聚乙烯醇的质量比为10:1。

3.根据权利要求1所述的聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片的制备方法，其特征在于：所述催化剂包括n,n’-二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶。

4.根据权利要求1所述的聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片的制备方法，其特征在于：所述聚乙烯醇的聚合度为1700～1800。

5.一种聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片，其特征在于：其是采用如权利要求1至4中任一项所述的制备方法制备所得。

6.一种冷冻保护剂，其特征在于：所述冷冻保护剂包括细胞培养基、胎牛血清、dmso以及如权利要求5所述的聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片；所述冷冻保护剂中聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片的添加量为30％-80％。

7.一种冷冻保存细胞的方法，其特征在于：步骤如下：将细胞与如权利要求6所述的冷冻保护剂混合均匀，然后放入冰箱内进行低温冷冻保存。

8.根据权利要求7所述的冷冻保存细胞的方法，其特征在于：所述低温冷冻保存的具体步骤为：先在-20℃冰箱保存2小时，后放入-80℃冰箱进行长期储存。

9.一种对冷冻保存的细胞进行复苏的方法，其特征在于：包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片及其制备方法和应用，该纳米片的制备方法包括以下步骤：将氧化石墨烯分散在分散剂中得到棕色溶液；向棕色溶液中加入催化剂和聚乙烯醇，使聚乙烯醇和氧化石墨烯之间发生酯化反应，反应完成后将所得混合液中的固体物分离出来并经过洗涤，即得到聚乙烯醇修饰的氧化石墨烯纳米片。该纳米片可以吸附在冰晶表面，抑制冰晶重结晶，在用于细胞冻存的过程中能有效的避免细胞被冰晶损伤，同时该复合物具有良好的光热效应，在对细胞进行复苏的过程中能够极大的提高细胞的存活率。这种双向协同作用的高效冰重结晶抑制纳米材料的制备与开发能够为目前的低温冷冻保存技术的安全与进步提供新的思路与方法。

技术研发人员：王振洋,赵君,李年,张淑东,刘变化,刘翠
受保护的技术使用者：中国科学院合肥物质科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/17