用于处理石化含油污水的微生物絮凝剂及其制备和应用的制作方法

本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种用于处理石化含油污水的微生物絮凝剂及其制备和应用。

背景技术：

石化工业的含油污水从原油脱水而来，水质来自不同地层，生产工艺也有所不同，因此水质复杂、含油量高、可生化性能差、含氨氮高、含有多种酚和硫化物，并且水量变动性较大、容易导致出水不稳定。

絮凝是传统水处理工艺中简单有效而又普遍使用的一种工艺，它是通过向废水中投加絮凝剂，通过改变水体中胶体表面电荷、吸附、网扫捕集等从而使水体的胶粒物质发生凝聚和絮凝而分离出来以净化废水的方法。常用絮凝剂包括无机盐类（硫酸铝、氯化铁等）和高分子物质（聚合氯化铝、聚丙烯酰胺等）。

传统絮凝虽然可以去除其中大部分悬浮物和胶体物质，但常用的化学絮凝剂用量较大，不易被分解且容易造成二次污染。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的之一在于提供一种用于处理石化含油污水的微生物絮凝剂。

本发明的目的之二在于提供用于处理石化含油污水的微生物絮凝剂的制备方法。

本发明的目的之三在于提供用于处理石化含油污水的微生物絮凝剂的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种用于处理石化含油污水的微生物絮凝剂，所述微生物絮凝剂包括蜡样芽胞杆菌菌株（Bacillus cereus）和/或所述蜡样芽胞杆菌菌株（Bacillus cereus）在生长过程中产生的胞外多聚物。该蜡样芽胞杆菌菌株可以直接投放到石化含油污水中作为絮凝剂，也可以在投放时添加架桥剂。

其中，所述蜡样芽胞杆菌菌株的Genbank 序列号为CM000723.1，同源性为98％。所述蜡样芽胞杆菌菌株，由长庆油田处理油井污水的处理池中污泥分离，并通过高岭土悬液的絮凝实验筛选得到。

用于处理石化含油污水的微生物絮凝剂的筛选方法，具体筛选的方法如下：

A.培养基准备

细菌固体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂2g/L，PH值为7.0-7.5；

细菌液体培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，pH值为7.0-7.5；

真菌固体培养基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂2g/L、1/3000孟加拉红溶液体积比10％、氯霉素0.1 g/L，PH值为7.0-7.5；

真菌液体培养基：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、1/3000孟加拉红溶液体积比10％、氯霉素0.1g/L，pH值为7.0-7.5；

放线固体菌培养基：淀粉15g/L、硝酸钾1g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、琼脂2g/L,PH值为7.0-7.5；

放线液体菌培养基：淀粉15g/L、硝酸钾1 g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、pH值为7.0-7.5；

B. 泥样准备

活性污泥样品取自长庆油田含油污水处理的二级沉淀池，污泥样品采用无菌水进行梯度稀释，稀释梯度分别为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8；

C. 菌落培养

将步骤B中10^-6、10^-7、10^-8的梯度稀释液分别吸取1mL用灭菌涂布棒涂于细菌固体培养基上培养，将10^-4、10^-5、10^-6的梯度稀释液分别吸取1mL用灭菌分别涂布棒涂于真菌和放线菌固体培养基上培养；

D.菌落纯化

将步骤C中在培养基上得到多种菌株的菌落，挑选各菌落进行平板纯化培养，重复3次后，所得菌株即为分离纯化后的菌株，将菌株接种到斜面培养基上进行4℃保存；

E. 絮凝菌株待测液制备

将步骤D中纯化的菌株接种至各相应的液体培养基中，进行摇床培养48h，最后将培养液高速离心，离心后的上清液即为各絮凝菌株待测液；

F.絮凝能力最强菌株筛选

分别吸取步骤E中制得的各菌株待测液用高岭土悬液的絮凝实验进行筛选，通过高岭土悬浊液絮凝率来判定各菌株的絮凝性能强弱，挑选出絮凝能力最强菌株；

G.微生物絮凝剂制备

将步骤F中筛选出来的絮凝能力最强菌株进行量产扩大培养，扩大培养基成分为：红糖15g/L、硝酸钾1g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.5g/L，pH值为7.0-7.5；摇床速度120r/min，培养温度为30℃，培养时间为48h；

将扩大培养后的菌株培养基先高速离心，去除细胞体，再加入2倍体积的冷冻无水乙醇至上清液，将上清液中的有机絮凝成分溶解至乙醇内，放入4℃冰箱中静置24h；

再将混合样品高速离心，弃掉上清液，将沉淀用75％乙醇溶解洗涤离心，重复3-5次，得到絮凝剂粗品；

最后用冷冻干燥机干燥制得所述用于处理石化含油污水的微生物絮凝剂。

用于处理石化含油污水的微生物絮凝剂的使用，将所述微生物絮凝剂直接投放到石化含油污水中搅拌，投放量按照每100ml污水投放2-6ml的微生物絮凝剂计算。

本发明中的微生物絮凝剂在其生长代谢过程中，在一定条件下能分泌包围在微生物壁外的细胞多聚化合物，这些胞外多聚物成分主要包括脂类、肽类、多糖等各种衍生物等。多聚物能通过絮凝架桥、改变表面电荷以及亲疏水性从而使水中悬浮物和胶体类物质脱稳，从而起到絮凝和沉淀作用。相比于传统的无机、有机人工合成的化学絮凝剂，微生物絮凝剂具有无毒害、无二次污染、环境友好、沉降性能稳定、易被生物降解等优点。

而且本发明通过和无机絮凝剂聚合氯化铝（PAC）、有机絮凝剂阳离子聚丙烯酰胺（PAM）对比，新型微生物絮凝剂絮凝效果更优，同时不会造成水体的二次污染。

同时本发明在水质pH变动的情况下（6-9）絮凝效果比较稳定，在中性偏酸的环境下（pH值6-7）絮凝效果最好，絮凝率最高可达68.9％（pH值为6，滴加量为4mL）。本发明量产培养过程选择用红糖水作为主要培养基质量，降低了生产成本，易于进行生物工程的大量生产。

附图说明

图1本发明投加量对絮凝率的影响；

图2污水pH对絮凝率的影响；

图3本发明与有机无机絮凝剂投加量对絮凝率的影响；

图4 本发明细菌PCR电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，以助于本领域技术人员理解本发明。

活性污泥样品取自长庆油田含油污水处理的二级沉淀池，含油污水处理设计量为300m³/天，污泥含水率97.6％，pH值6-8。COD_Cr为1000-150 mg/L，BOD₅为500-700 mg/L，NH₄-N为300-400 mg/L，浊度200-250NTU，pH值6-9。采用絮凝气浮+A²O+膜处理工艺进行处理后达标排放。

污泥样品采用无菌水进行梯度稀释，稀释梯度分别为10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8。所用平板分离培养基为：牛肉膏蛋白胨培养基（细菌培养基），成分为：其中牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂2g/L，pH值为中性（7.0-7.5）；

马丁-孟加拉红培养基（真菌培养基），成分为：蛋白胨5g/L、葡萄糖10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂2g/L、1/3000孟加拉红溶液体积比10％、氯霉素0.1g/L，pH值为中性（7.0-7.5）；

高氏一号培养基（放线菌培养基），成分为：淀粉15g/L、硝酸钾1g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、琼脂2 g/L，pH值为中性（7.0-7.5）；

将10^-6、10^-7、10^-8的梯度稀释液分别吸取1mL用灭菌涂布棒涂于细菌培养基上，将10^-4、10^-5、10^-6的梯度稀释液分别吸取1mL用灭菌涂布棒涂于真菌和放线菌培养基上，将所有涂菌平板倒置后放入恒温培养箱内培养48h，细菌培养温度37℃，放线菌和真菌培养温度为30℃。

培养后在培养基上得到多种菌株的菌落，挑选各菌落进行平板纯化培养，重复3次后，所得菌株即为分离纯化后的菌株，将菌株接种到斜面培养基上进行4℃保存。

将纯化菌株接种至各相应的液体培养基中进行培养，液体培养基和平板分离培养基出不含琼脂糖外其他成分相同，在各自培养温度下进行摇床培养48h，摇床速度为150r/min。随后将培养基5000r/min高速离心30min，离心后的上清液即为各菌株的絮凝待测液。

分别吸取各菌株待测液1mL、3mL、5mL滴入高岭土悬浊液中进行絮凝性能试验，对照组分别吸取等量的培养基进行测试，通过高岭土悬浊液絮凝率来判定各菌株的絮凝性能强弱，以此筛选出絮凝性能强的菌株。絮凝率通过在550nm处的吸光度的差值判断，公式如下：

絮凝率（％）=（A₁-A₂）/A₁×100％，其中A₁为对照组吸光度值，A₁为待测液的吸光度值。

高岭土悬浊液是在100ml烧杯中加入0.5g高岭土和5ml 1％（wt％）的CaCl₂溶液。实验中加入待测液后先快速搅拌1min，在慢搅3min，随后静置15min，用分光光度计测定550nm出的吸光度，由此计算出各菌株的絮凝率。

经过絮凝率测定，筛选出絮凝率最高的菌株，当加入3mL待测液时，该菌株絮凝能力最强，达到92.12％。

该菌株在平板培养基上菌落呈浅黄色、表面光滑，无气丝，革兰氏染色呈紫色，提取菌种DNA并用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增后再进行纯化扩增，PCR电泳纯化扩增见图4，随后将PCR纯化产物进行切胶测序，测序结果显示鉴定菌株为蜡样芽胞杆菌菌株（Bacillus cereus），Genbank序列号为CM000723.1，同源性为98％。

将该菌株进行量产扩大培养，培养罐中培养基成分为红糖15g/L、硝酸钾1 g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.5 g/L、氯化钠0.5 g/L，pH值为中性（7.0-7.5）；摇床速度120r/min，培养温度为30℃，培养时间为48h。

将培养后的菌株培养基以5000r/min高速离心30min，去除细胞体，加入2倍体积的冷冻无水乙醇至上清液，将上清液中的有机絮凝成分溶解至乙醇内，放入4℃冰箱中静置24h。之后再将混合样品以5000r/min高速离心30min，弃掉上清液，将沉淀用75％乙醇溶解洗涤离心，重复3-5次，得到絮凝剂粗品，并通过冷冻干燥机干燥。称重后，1L发酵罐可以生产约2.13g微生物絮凝制剂。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。

本发明微生物絮凝剂对含油污水絮凝效果试验：

1.新型微生物絮凝剂对pH适应性和投加量试验：

取100mL长庆油田油井污水放入250mL锥形瓶中，测得此时水中pH值为6.8。分别吸取量产发酵罐中絮凝剂样品2mL、4 mL、6 mL、8 mL、10mL、12 mL加入污水样品中，对照组分别采用等量未培养菌种的液体培养基作为待测样品。加入待测液将锥形瓶放在磁力搅拌器上，快搅1min，慢搅3min，之后静置5min。通过测定污水550nm处的吸光度来计算絮凝率，计算公式之前已经给出。

从图1絮凝效果看出，在pH接近中性条件下，投加量4mL时絮凝率达到66.5％，继续增加絮凝剂用量，絮凝效果没有明显提升。

对污水的pH调节用HCl和NaOH溶液进行调节，吸取4mL絮凝剂样品加入污水样品，并测定各pH下絮凝剂絮凝效果。从图2可以看出，新型絮凝剂对pH值适应较为广泛，在中性偏酸条件下（pH为4-7），絮凝效果较好，碱性环境中，可能由于氢氧根负电荷改变了絮凝剂的表面负荷，从而影响对悬浮物和油的聚积效果，降低了絮凝率。

2.新型和传统絮凝剂对含油污水处理效果对比

采用传统的无机絮凝剂（氯化铝）和有机絮凝剂（阳离子型聚丙烯酰胺PAM）进行絮凝实验，在污水样品中分别加入2mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL的传统絮凝剂样品（1％，w/v），在同样搅拌条件下测定吸光度进行絮凝效果对比分析。从图3可以看出，针对该种含油污水的絮凝效果，有机絮凝剂（PAM）要优于无机絮凝剂（PAC），两种絮凝剂最佳投加量均在10mL左右，用量较新型微生物絮凝剂较大，而且对于污水处理而言，有机絮凝剂也属于难降解物，无机絮凝剂中金属离子同样存在二次污染风险。新型微生物絮凝剂絮凝效果较传统絮凝剂有优势，絮凝效率最高为66.5％，并且微生物絮凝剂本身作为自身物质可被微生物降解和吸收，不会对环境造成二次污染。