一种促进中温好氧微生物降解的综合调理剂及其制备和使用方法与流程

本发明涉及有机污染土壤微生物修复领域，具体涉及一种促进中温好氧微生物降解(石油污染物)的综合调理剂及其制备和使用方法。

背景技术：

微生物修复技术作为一种廉价环保型修复技术在石油污染土壤修复过程已得到广泛应用。针对于该技术修复效率低、修复速率慢等缺陷，围绕生物放大及生物刺激等多种调控方法已展开研究和尝试。制约微生物修复效率的主要因素来源于土壤理化性质的动态变化，随着修复过程的持续，土壤营养物质逐渐匮乏。其中，土壤有机质，特别是可溶性有机碳(DOC)含量不断减少，土壤内C:N:P比例随着微生物可利用碳源的消耗而失衡，导致微生物生理状态逐渐下降，微生物丰度降低，细胞内外的代谢酶活性减弱，从而对石油烃的代谢矿化能力下降，修复速率减慢。此外，随着微生物呼吸代谢作用的进行，土壤孔隙内氧含量逐渐下降，土壤氧化还原电位逐渐降低，从而导致石油烃矿化所需的电子受体不足，微生物降解能力减弱。再有，土壤对石油烃分子的吸附作用是制约其生物可接触性及生物可利用性的重要因素，由此限制了微生物代谢能力的发挥。

因此，对于上述的不利因素，已有较多调节对策得到尝试，包括外源碳源的添加，土壤翻耕通气等多种方法，但过量的易代谢碳源的施用可导致其与石油烃碳代谢的竞争作用的产生，反而阻碍修复过程，且短时间内的大量外源有机碳的加入也不利于微生物修复效率的长时间维持，而土壤翻耕等操作过程繁琐费时费力，这些潜在的不利因素仍然制约了微生物修复效率的进一步提升。

对此，通过开发并添加一种具有碳源缓释及土壤孔隙和营养配比调节能力的综合调理剂可有效实现优化土壤营养、改善土壤孔隙环境及污染物接触效率，从而提高并延长微生物修复的效率及其高效修复过程。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种促进中温好氧微生物降解(石油污染物)的综合调理剂及其制备和使用方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种促进中温好氧微生物降解的综合调理剂，综合调理剂为干制剂和湿制剂；其中，干制剂为可溶性有机碳含量(DOC)比例达2％～4％(w/w)的碳化的水稻稻壳；加入量为待修复有机污染土壤重量的5％～7％(w/w，g/g)，且添加后使待修复有机污染土壤孔隙度达65％～75％；

湿制剂为KNO₃、KH₂PO₄和K₂HPO₄中的一种或几种的水溶液；添加量为使待修复有机污染土壤中非石油来源有机碳参与的C:N:P比例达100:5～10:1～2。

通常待修复土壤的有机碳由土壤石油污染物来源有机碳、土壤天然来源有机碳(SOC)及干制剂添加的外源碳组成。

其中，土壤天然来源有机碳(SOC)为石油污染土壤总的有机碳与石油污染物来源有机碳之差；石油污染物来源有机碳的用固相萃取法提取后用元素分析仪测定，石油污染土壤总的有机碳用元素分析仪测定。

所述干制剂可溶性有机碳含量(DOC)比例达2％～4％(w/w)的碳化的水稻稻壳制备方法为：向待碳化处理稻壳中分批次缓慢加入浓度为40％～50％(w/v)的硫酸，使硫酸与稻壳的添加比例达到1:2～1:2.5(v/w，mL/g)，待混匀后，放置碳化2～5h使稻壳中可溶性有机碳含量(DOC)比例达2％～4％(w/w)，而后采用氨水调节稻壳酸碱度至pH达7.5～8.5，自然风干后收集制得干制剂。

所述向待碳化处理稻壳中分批次缓慢加入硫酸时要不断的快速搅拌使硫酸与稻壳充分混匀；

所述碳化过程中每隔15～30min搅拌一次稻壳。

一种促进中温好氧微生物降解的综合调理剂的制备方法，其特征在于：

1)干制剂的制备：向待碳化处理稻壳中分批次缓慢加入浓度为40％～50％(w/v)的硫酸，使硫酸与稻壳的添加比例达到1:2～1:2.5(v/w，mL/g)，待混匀后，放置碳化2～5h使稻壳中可溶性有机碳含量(DOC)比例达2％～4％(w/w)，而后采用氨水调节稻壳酸碱度至pH达7.5～8.5，自然风干后收集制得干制剂；

2)湿制剂的制备：将KNO₃、KH₂PO₄、K₂HPO₄中的一种或几种经水制成水溶液，得湿制剂。

所述调理机中干制剂加入量为待修复有机污染土壤重量的5％～7％(w/w，g/g)，且添加后使待修复有机污染土壤孔隙度达65％～75％；

湿制剂添加量为使待修复有机污染土壤中非石油来源有机碳参与的C:N:P比例达100:5～10:1～2。

所述步骤1)向待碳化处理稻壳中分批次缓慢加入硫酸时要不断快速搅拌使硫酸与稻壳充分混匀；

所述碳化过程中每隔15～30min搅拌一次稻壳。

一种促进中温好氧微生物降解的综合调理剂的使用方法，先将综合调理剂中干制剂混入有机污染土壤中，加入量为待修复有机污染土壤重量的5％～7％(w/w，g/g)，且添加后使待修复有机污染土壤孔隙度达65％～75％；而后在补给湿制剂，使待修复有机污染土壤中非石油来源有机碳参与的C:N:P比例达100:5～10:1～2。

其中，湿制剂的选择根据土壤湿度及所需N、P元素的含量要求确定湿制剂中营养盐的种类以及具体用量。

上述利用本发明综合调理剂促进中温好氧微生物降解(石油污染物)中的中温好氧微生物为可在30～40℃的好氧条件下进行繁殖代谢的微生物，例如蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、缺陷假单胞菌(B.diminuta)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、诺卡氏菌(Nocardia rhamnosiphila)等。

本发明具有以下优点及有益效果：

1.本发明所制备的干制剂由部分碳化稻壳组成，碳化过程由40％～50％浓度的硫酸对稻壳的腐蚀实现，中浓度硫酸不仅降低了应用浓硫酸时潜在的安全风险，且相对温和的腐蚀过程有利于对稻壳的适度碳化，从何实现既破坏稻壳表面蜡质层，释放有机碳源，又避免因过度碳化而导致稻壳有机碳的过量消耗。

2.本发明综合调理剂中部分碳化过程既利于增加外源碳库中可溶性有机碳(DOC)的产生，增加土壤中微生物易于利用的速效碳的含量，又有效提高潜在碳源的储备。

3.本发明综合调理剂中部分碳化的稻壳还具有更强的吸附能力，不仅同时吸附石油烃分子和微生物，增强石油烃的生物可接触性及生物可利用性，又可吸附一定量的微生物易利用碳源，并随着微生物修复过程的进行再将其缓慢释放，达到提供缓释碳源的目的，以延长微生物的高效代谢过程。

4.本发明综合调理剂中干制剂在土壤中的混入可有效提高石油污染土壤的孔隙度，从而增加了土壤空气含氧量，保障足量的石油烃分子代谢所需的电子受体，利于中温好氧微生物降解功能的发挥。

5.本发明综合调理剂在使用时先将干制剂施用后补给湿制剂，有效调节非石油烃来源碳参与的C:N:P的比例，实现微生物的营养供给的优化。

6.本发明综合调理剂中干制剂pH调节至7.5～8.5的偏碱性状态，有利于为微生物提供适宜的生存代谢环境，且偏碱性环境下有利于增强土壤双电层厚度，增加zeta电位绝对值，从而利于维持土壤团粒的稳定性，防止凝聚现象发生，保持土壤已有孔隙度水平。

附图说明

图1为本发明实施例提供的石油烃降解率的曲线，其中，CK为对照，Bio为中温好氧微生物修复对照，Bio-R为施加综合调理剂的中温好氧微生物修复处理。

图2为本发明实施例提供的石油烃降解速率的曲线，其中，Bio为中温好氧微生物修复对照，Bio-R为施加综合调理剂的中温好氧微生物修复处理，虚线与实线分别为两者石油烃降解速率的模拟曲线。

图3为本发明实施例提供的微生物数量的曲线，其中，CK为对照，Bio为中温好氧微生物修复对照，Bio-R为施加综合调理剂的中温好氧微生物修复处理。

图4为本发明实施例提供的脱氢酶活性的曲线，其中，Bio为中温好氧微生物修复对照，Bio-R为施加综合调理剂的中温好氧微生物修复处理。

图5为本发明实施例提供的胜利油田石油污染土壤中石油烃降解率的曲线，其中，CK为对照，Bio为中温好氧微生物修复对照，Bio-R为施加综合调理剂的中温好氧微生物修复处理。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。

本发明采用由部分碳化的水稻稻壳组成的干制剂与KNO₃、KH₂PO₄和K₂HPO₄等无机盐溶液组成的湿制剂搭配而成，并分别施用。综合调理剂的应用可增加土壤孔隙度，增强通气性，提高土壤微生物易利用碳库容量，同时以速效碳源及缓释碳源的方式补充到土壤中，优化土壤中C:N:P比例，并利用部分碳化稻壳表面的吸附作用增强微生物与石油烃污染物的接触性，有利于中温好氧微生物修复的高效持续进行。

实施例1

综合调理剂的制备：

1)干制剂的制备：取完整的水稻脱离稻壳18g，在塑料容器内加入50％浓度的硫酸45ml，采用少量多次的方法缓慢加入硫酸，每次加入后均快速搅拌稻壳，使硫酸在稻壳内均匀分布，待硫酸全部加入后放置4h继续碳化，每隔20min搅拌一次，直至稻壳中可溶性有机碳含量(DOC)比例达3.1％(w/w)；碳化结束后采用氨水调节稻壳酸碱度至pH达8.0，自然风干后收集制得综合调理剂组分中的干制剂。碳化处理结束后测定稻壳可溶性有机碳含量(DOC)达3.1％(w/w，g/g)。

2)湿制剂的制备：择根据土壤湿度及所需N、P元素的含量要求确定湿制剂中营养盐的种类以及具体用量，使待修复有机污染土壤中非石油来源有机碳参与的C:N:P比例达100:5～10:1～2；具体湿制剂为含9.7％(w/v，g/mL)KNO₃，0.87％(w/v，g/mL)KH₂PO₄，1.39％(w/v，g/mL)K₂HPO₄的水溶液；取50ml。

利用上述获得综合调理剂对吉林油田石油污染土壤的中温好氧微生物修复的调节。

试验所用污染土壤来自吉林油田石油污染现场土壤，经去除肉眼可见草根杂质后，室内自然风干并过2mm筛子，将制备好的干制剂(部分碳化稻壳)全部加入300g石油污染土壤中，施用比例达6％(w/w，g/g)，再次搅拌混合均匀，使土壤孔隙度达75％。将施加干制剂混合均匀后的土壤内加入全部50mL湿制剂，再次搅拌混合均匀，完成综合调理剂的施用。此时土壤内的C:N:P比例为100:5:1。土壤混合均匀后经采用固相萃取法测定初始石油烃含量为2％(w/w，g/g)。

试验分为3个处理，即自然降解对照(CK)、中温好氧微生物修复对照(Bio)及综合调理剂施用的中温好氧微生物修复(Bio-R)，每个处理供试的石油污染土壤质量为300g。本实施例将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、缺陷假单胞菌(B.diminuta)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)和诺卡氏菌(Nocardia rhamnosiphila)菌株培养液按体积比为1:1:1：1的比例混合作为中温好氧微生物的菌悬液。

在Bio及加入综合调理剂的Bio-R两个处理土壤中分别加入100mL和50mL的石油降解功能菌群悬液(微生物数量相同)，使土壤内微生物丰度达5.6×10⁸copies/g干土。三组处理均在28±2℃下进行降解试验，试验共进行56d，每7d取样一次，而后通过固相萃取法测定石油降解率、石油降解速率、微生物数量及脱氢酶活性。

试验结果表明：

土壤综合调理剂的施用显著提高微生物修复的整体效率，石油烃降解率具有起点高、持久性强的特点(图1)，整体降解率在处理56d后达到41.7±0.2％，较Bio处理提高15.29％。拟合石油烃降解速率曲线分析表明(图2)，Bio-R处理在前28天呈现匀速的线性降解过程，而Bio处理仅在前21d具有匀速降解特征，且线性降解阶段的石油烃降解速率较Bio-R低0.08g/Kg·d^-1。由此可见，土壤综合调理剂的施用显著提高了石油烃的降解速率。各处理的微生物丰度(图3)及脱氢酶活性(图4)分析表明，土壤综合调理剂的添加有效保持了微生物的生物量并一定程度促进了脱氢酶活性的提高及保持活性高水平的持久性，处理初期的高活性源于速效碳的能量供给作用，而高水平维持的持久性则来源于综合调理剂中缓释碳源的释放，有利于微生物修复石油烃污染土壤功能的强化。

实施例2

对于综合调理剂烦请再给出几个制备实施例，根据权利要求给出的范围，进行增加。

胜利油田石油污染土壤的中温好氧微生物修复

综合调理剂的制备：

1)干制剂的制备：取完整的水稻脱离稻壳20g，在塑料容器内加入50％浓度的硫酸50ml，采用少量多次的方法缓慢加入硫酸，每次加入后均快速搅拌稻壳，使硫酸在稻壳内均匀分布，待硫酸全部加入后放置5h继续碳化，每隔30min搅拌一次，直至稻壳中可溶性有机碳含量(DOC)比例达3.5％(w/w)；碳化结束后采用氨水调节稻壳酸碱度至pH达7.8，自然风干后收集制得综合调理剂组分中的干制剂。碳化处理结束后测定稻壳可溶性有机碳含量(DOC)达3.5％(w/w，g/g)。

2)湿制剂的制备：择根据土壤湿度及所需N、P元素的含量要求确定湿制剂中营养盐的种类以及具体用量，使待修复有机污染土壤中非石油来源有机碳参与的C:N:P比例达100:5～10:1～2；具体湿制剂为含9.5％(w/v，g/mL)KNO₃，0.89％(w/v，g/mL)KH₂PO₄，1.42％(w/v，g/mL)K₂HPO₄的水溶液；取55ml。

利用上述获得综合调理剂对胜利油田石油污染土壤进行中温好氧微生物修复的调节。

试验所用污染土壤来自胜利油田石油污染现场土壤，经去除肉眼可见草根杂质后，室内自然风干并过2mm筛子，将制备好的干制剂(部分碳化稻壳)全部加入320g石油污染土壤中，施用比例达7％(w/w，g/g)，再次搅拌混合均匀，使土壤孔隙度达73％。将施加干制剂混合均匀后的土壤内加入全部55mL湿制剂，再次搅拌混合均匀，完成综合调理剂的施用。此时土壤内的C:N:P比例为100:6:1.5。土壤混合均匀后经固相萃取法测定初始石油烃含量为2.9％(w/w，g/g)。

试验分为3个处理，即自然降解对照(CK)、中温好氧微生物修复对照(Bio)及综合调理剂施用的中温好氧微生物修复(Bio-R)，每个处理供试的石油污染土壤质量为320g。

本实施例将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、缺陷假单胞菌(B.diminuta)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)三种菌株培养液按体积比为1:1:1的比例混合作为中温好氧微生物的菌悬液。

在Bio及加入综合调理剂的Bio-R两个处理土壤中分别加入110mL和55mL的石油降解功能菌群悬液(微生物数量相同)，使土壤内微生物丰度达9.6×10⁷copies/g干土。三组处理均在29±2℃下进行降解试验，试验共进行60d，每10d取样一次，而后通过固相萃取法测定石油降解率。

试验结果表明：

土壤综合调理剂的施用显著促进了微生物修复的整体效率，石油烃降解率在处理60d后达到42.5±0.6％，较Bio处理提高18.6％(图5)。由此表明，综合调理剂有效改善了土壤孔隙度、土壤有效碳源及C:N:P的营养比例，利于微生物对石油污染物的代谢。