具有MICP功能纺锤形赖氨酸芽孢杆菌在尾矿覆绿修复中的应用

本发明属于被破坏山体-重金属尾矿治理及恢复技术领域，尤其涉及一种具有micp功能纺锤形赖氨酸芽孢杆菌在尾矿覆绿修复中的应用技术。

背景技术：

工业化进程和经济快速发展加速了自然资源的浩劫并伴随着环境污染。西部经济欠发达地区，高新技术和新型能源产业匮乏，一些地方以突破环境承载力获取经济效益的发展模式大行其道。铜银矿的乱采、滥挖，使得处于生态过渡带，本就脆弱的山体千疮百孔，自然景观、地质遗迹、旅游资源和生态环境遭到严重破坏，造成严重的视觉污染和环境污染，特别是对土壤和地下水源的污染岌岌可危。因此，环境修复就显得非常重要，微生物已被广泛用于土壤修复中，其中微生物土体加固技术发展迅速。目前来看，胶结效果最好的是微生物成矿作用，这种成矿作用被称为微生物诱导方解石沉积(microbiologicallyinducedcalciteprecipitation，简称micp)。西部干旱地区高风蚀矿山，干旱缺水、风蚀强度大、坡度高、尾矿分布区土壤重金属超标、植被覆盖度低造成的尾矿土污染扩散严重、治理难度大，micp技术诱导的碳酸钙晶格促进重金属原位钝化，固定矿渣的飘逸的同时阻止土壤中重金属的游离，减少游离重金属对周边土壤和水质的污染。但是广谱的micp矿区修复技术目前还存在以下问题：

(1)微生物靶向性不强和工业发酵条件有待优化。

具有micp功效的微生物很多，不同区域，不同类别矿区中存在不同的micp菌株。微生物选育的前提条件是从自然界获得相应的原始菌种，特别是在生态脆弱区，由于自然环境的恶劣，micp菌株更需要优化，尽可能是乡土菌株。且根据发酵的材料价格，需要对工业发酵条件进行优化，降低成本。

(2)micp反应体系优化，缺乏对不同粒径矿渣施用量的标准。

micp反应体系，除了具有micp功能的菌株，其反应体系中还包括ca²⁺和尿素，研究学者对micp反应体系配比有比较多的研究，确定当菌液用量和胶结液体积比为1:1是最优比，成本最低。但对于不同矿渣颗粒大小，micp反应体系用量没有明确的意见。矿渣是在开采过程中的废料，其状态、颗粒大小不一致，因此，确定不同颗粒大小矿渣对用菌剂施用量，有助于高效修复工程的开展。

(3)单纯的micp尾矿修复技术，导致景观格局单一，生态效益低下。

单纯的micp固化技术虽然使得破坏山体矿渣固定，固化游离重金属，但对区域植被恢复无实际意义，固化后的表层形成硬壳，在生态环境脆弱的西北地区，不利于土壤水分的蓄积，营养物质的循环，甚至造成大面积地表径流，存在水分的流失，不利于植被恢复，造成土体修复可持续性和景观修复的漏洞。

(4)缺乏micp菌株对种子增强技术的探究，限制矿区植物恢复技术。

西北地区的部分铜银矿区尾矿，干旱少雨风蚀强烈，土壤退化严重，而种子增强技术能使种子在退化的环境中发芽，缩短种子发芽的时间并促进生长，在困难立地植被恢复方面发挥关键作用。目前的micp修复土体技术，仅仅局限在重金属原位钝化和矿渣表层的粉尘固定，在复合micp生物修复技术上存在缺陷，不利于尾矿环境的可持续生态修复。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有广谱的micp矿区修复技术存在的问题，提供一种具有micp功能的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株在尾矿覆绿修复中的应用。

本发明的构思是：虽然micp的固化技术与原理众所周知，但乡土菌株的选择、功能确定，micp体系使用量及micp菌剂对矿区植物种子的影响与尾矿修复治理好坏关系密切。本发明要解决以下技术问题：

(1)选择合适的具有micp功能菌种，确认区域原生菌株的micp功能及工业化生产技术，确定菌液反应液配比和该反应体系对于不同粒径的矿渣具体的施用量及施用次数，以便对大面积的矿山修复起到指导作用。

(2)确认micp菌剂处理对生境种子萌发的增强作用。干旱地区降雨少，生境种子萌发期较长，特别是在尾矿漂浮物分布的生境土中，种子的萌发周期明显加强，甚至无法萌发。本发明可以缩短种子的萌发周期，使其配合干旱地区的降雨分布时间发芽和快速生长，降低环境修复成本，提高修复成功率。

(3)确定micp固化技术与其功能菌种添加的客土栽植复合技术的使用，解决单纯micp固土修复，造成的土壤质量改良效率低下和景观格局单一的问题，形成以micp功能菌为核心的综合高效、可持续生态修复技术，达到矿山的植被恢复和生态环境重建目的，提升矿区的生态效益。

本发明的技术方案是这样的：具有micp功能纺锤形赖氨酸芽孢杆菌在尾矿覆绿修复中的应用，包括如下步骤：

(1)根据区域生态环境特点，在矿区尾矿周边采取定量矿渣，带回实验室进行液体瑶培，筛选具有micp功能的微生物，根据显色剂结果和16s分析结果确认并使用的一株是梭形赖氨酸芽孢杆菌，并确认其分解尿素诱导碳酸钙沉淀的功能。根据实验室结果采用胶结液(尿素或氯化钙)：菌液＝1：1的反应体系，对不同粒径矿渣进行温室控制实验，确定具体的micp整个反应体系对固定不同粒径矿渣的菌液使用量，以便野外指导矿区生态修复。

(2)在micp固化客土复绿复合生态修复技术既在固化的基础上，采用客土种植植物改善矿区生态环境达到尾矿复绿效果。区域植物种子的萌发受到矿渣重金属含量和区域水分缺乏的限制，在矿渣上直接复绿基本不可能，采取micp功能菌株发酵液梯度稀释，选取生境植物种子，进行micp菌剂诱导发芽实验。

(3)对区域的原始菌种进行纯化、鉴定分类。使用菌株由浙江工业大学潘响亮教授团队自宁夏中卫北山崾岘子的铜银矿区尾矿矿区矿渣土壤分离获得，后经进行纯化，挑选单菌落进行甘油管保藏待用。通过形态学、功能和16srdna序列分析鉴定结果表明，菌株属于芽孢杆菌属(bacillus)的纺锤型赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillusfusiformis)。

(4)根据该菌株的理化性质，特别是碳酸钙沉淀反应，确定其micp功能：使用的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液与尿素-cacl2混合液反应生成caco3，通过添加纺锤形赖氨酸芽孢杆菌能够显著增加caco3沉淀量，micp过程沉淀量cac03/mg，对照灭菌水处理0.01±0.006,菌剂处理144.47±12.91。说明该菌株具有micp功效。

(5)根据菌株的生物学功能确定，明确工业发酵技术，确定工业发酵原材料及发酵条件：蛋白胨4000.0g，牛肉膏1200.0g，食盐2000.0，ph7.2-7.4，灭菌蒸馏水200.0l，菌液od600﹥2.0。

(6)根据不同粒径矿渣的固化情况，确定该菌株能够通过和ca²⁺反应形成“生物”水泥，增强土壤抗剪能力，经过micp处理后，不同矿渣的抗剪强度都大幅度提高，且矿渣颗粒越细，抗剪强度提升越明显，从而维持了尾矿表面稳定性，阻碍干旱高风蚀地区矿渣因风蚀作用引发的重金属的扩散污染。

本发明具有如下有益效果：

1、具有micp功能的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌为西部矿区的生境菌种，其固化尾矿效果良好，对于不同粒径的矿渣颗粒均有固化效果，甚至是粒径大于15mm的大颗粒矿渣固化效果明显，突出区域生境菌种的适应性和固化高效性。

2、本发明通过发芽试验，发现该菌种不仅能固化矿渣，同时对区域植物种子萌发具有促进效果即种子增强效应。该菌种能够缩短种子萌发周期，这使得在干旱半干旱地区矿区污染土壤植被恢复成活率大大提升。缩短萌发周期除了可以提高植物修复效果，更重要的是，将某种植物种子萌发周期缩短，有利于更好的精准吻合区域降雨时间，从自然恢复的角度讲，有利于区域矿山修复技术成本的降低。

3、本发明发酵菌液活菌数较高，发酵成本较低，适合大规模使用。

4、由于是区域矿渣生境菌株，本发明适宜性强，对区域矿渣固化情况良好。

附图说明

图1为本发明的菌种分离图谱示意图；

图2为本发明菌剂反应液胶结后矿渣抗剪特性示意图；

图3为本发明不同浓度菌剂处理对种子萌发的影响示意图；

图4为本发明micp过程沉淀量状况图表；

图5为本发明工业化发酵培养基及发酵条件图表。

图1所示为宁夏中卫北山崾岘子铜银矿区尾矿矿渣土壤分离获得的微生物，进过分离纯化后进行16s测序，进化树分析结果。该结果显示本地区分离的菌株为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌，属于芽孢杆菌菌属。

图2所示为不同颗粒矿渣经micp处理后土壤抗剪能力。其中a为粒径k1≤5mm的矿渣处理、b为粒径k2在5～15mm的矿渣处理、c为粒径k3≥15mm的矿渣处理。土壤抗剪强度反应了土壤受垂直剪切力破坏的承受能力，峰值为最大承受强度，峰值对应的位移表示的是在最大剪切力下水平破坏程度。结果可知，经过micp处理后，不同矿渣的抗剪强度都大幅度提高，且矿渣颗粒越细，抗剪强度提升越明显，例如k1经过micp处理后，其最大抗剪强度高达2500mpa以上，约为尾矿渣自身抗剪强度的1.67倍。

图3为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌液稀释液对种子发芽率的影响。该图说明，不同稀释倍数的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液能够显著提升种子萌发效果，其中稀释倍数为40倍的稀释倍数最好，说明该菌株发酵液具有种子增强效果，有利于区域植被的恢复。

图4为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌发酵液与尿素-cacl2混合液反应生成caco3的产量。该结果显示，通过添加纺锤形赖氨酸芽孢杆菌能够显著增加caco3沉淀量，说明该菌株具有micp功效。

具体实施方式

为了更清楚地了解本发明实施方式，下面将结合实施例进行进一步说明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

实施例1：在实验室确定在发酵48-72h时赖氨酸芽孢杆菌发酵液od600最大，约为2，其对ca²⁺的固化效果最好。反应体系菌液和反应液的使用配比为1:1沉淀效果最优，同时在自然光源温室大棚内(平均最高温度t＝34±0.23℃)进行固化试验，确定不同粒径矿渣：k1(≤5mm)、k2(5～15mm)、k3(≥15mm)每个粒径矿渣完全固化菌剂及反应液使用量。完全固化菌剂及反应液使用量使用量如下：k1中浇入200ml/kg胶结液和菌液，k2中浇入约185ml/kg胶结液和菌液混合液，k3中浇入约165ml/kg胶结液和菌液混合液，根据渗透情况，分两次浇筑，处理周期为10天，在温度为30℃-42℃温度条件下自然通风晾干30天以上，既达到固化效果，根据抗剪试验结果显示micp固化后矿渣的抗剪强度大幅度增强，说明micp固化矿渣有助于抑制风蚀导致矿渣飘散引发的重金属污染扩散(参看图2)。

实施例2：取发酵液(od600＝1.8-2.0)稀释5倍、10倍、20倍和40倍菌液50ml，取净度一致胡枝子种子三个重复(每个重复100粒种子)，浸泡于不同稀释倍数的纺锤型赖氨酸芽孢杆菌发酵液，24小时后结束浸泡取出处理的种子与空白对照(蒸馏水浸泡处理)播种于标准发芽盒，发芽盒内装有营养土和蛭石(营养土：蛭石＝2:1)，至于人工气候箱观测发芽进度。结果显示，稀释的赖氨酸芽孢杆菌发酵液能够明显增加胡枝子发芽率，缩短发芽周期，其中稀释40倍菌液效果较好，20倍和10倍稀释菌液促进萌发效果差异不大(参看图3)。该实验证实具有micp特性的矿渣生境菌株--纺锤型赖氨酸芽孢杆菌发酵液对区域植物具有种子增强效应，有助于区域尾矿植被恢复，生态修复。

序列表

<110>宁夏大学

浙江工业大学

<120>具有micp功能纺锤形赖氨酸芽孢杆菌在尾矿覆绿修复中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1440

<212>dna/rna

<213>具有micp功能纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(ribosomal)

<400>1

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<212>dna/rna

<213>上游引物(ribosomal)

<400>2

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<210>3

<211>20

<212>dna/rna

<213>下游引物(ribosomal)

<400>3

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