由超临界流体从乳液萃取制备粒子的制作方法

专利名称：由超临界流体从乳液萃取制备粒子的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及一种使用超临界流体经溶剂萃取制备粒子的方法，其中，将溶质溶解在溶剂中形成溶液，将溶液分散在不混溶或部分混溶的液体中形成乳液，并从乳剂中萃取溶剂。
背景技术：
粒子通常这样制备使所需的物质在有机溶剂中形成溶液，然后溶液用大量水乳化。再通过溶剂蒸发或用另一种有机溶剂萃取，所需的物质以微细粒子形式从乳液中沉淀出来。从乳液胶束中除去有机溶剂导致过饱和现象，其反过来又使所需的物质以微细粒子沉淀。
此方法有许多缺点。首先，该方法以极其慢的速率进行，大部分情况下要超过若干小时。为了保证低的残余溶剂水平需要不希望的长蒸发时间。其次，有机溶剂萃取方法难于大规模进行，且需要使用大量溶剂，产生大量废液流。而且，由于使用某种难于完全除去、且有时会作为残余物质保留在最终产物中的溶剂，近些年还要考虑到因此可能对环境和健康产生的影响。

发明内容
本发明提供一种由乳液液滴经超临界流体萃取溶剂制备溶质粒子的装置和方法，其中乳液液滴含有溶剂和溶解于溶剂中的溶质所形成的溶液。溶液分散在通常不混溶的液体中形成乳液。本发明优选实施方案中，该方法使用超临界流体，如二氧化碳，由乳液胶束经水不混溶或部分混溶的溶剂的萃取来制备基本不溶于水的粒子的胶体悬浮水溶液。本发明的方法中所用的形成乳液液滴的溶剂可回收和循环。
下列描述中将对本发明的上述和其它特征进行更详尽的说明，其还详细阐述了本发明的某些说明性实施方案，但是，这些描述仅示意了可使用本发明原理的各种不同方法中的若干种。


图1为本发明方法中所用装置的示意图；图2为使用实施例1(a)中定义的方法得到的聚苯乙烯粒子的体积粒度分布图；图3为实施例2(a)中制备的EUDRAGIT RS(EU)粒子的TEM显微照片；图4为实施例2(f)中制备的EU粒子的体积粒度分布图；图5为实施例2(h)中制备的EU粒子的体积粒度分布图；图6为实施例3(a)中制备的聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)粒子的SEM显微照片；图7为实施例3(e)中制备的PLGA粒子的体积粒度分布图；图8为实施例3(f)中制备的PLGA粒子的体积粒度分布图；图9为实施例3(h)中制备的PLGA粒子的SEM显微照片；图10为实施例3(i)中制备的PLGA粒子的体积粒度分布图；图11为实施例4(a)中制备的醋酸胆固醇酯(CA)的扫描电子显微照片；图12为粒度相对于CA浓度的图；图13为实施例4(a)中制备的CA粒子的体积粒度分布图；图14(a)，14(b)和14(c)为平均粒度相对于CA浓度和乙酸乙酯浓度的多维图；图15为实施例4(j)中制备的CA毫微粒子的SEM显微照片；图16为实施例5(a)中制备的三软脂酸甘油酯粒子的数量平均粒度分布图；和图17为实施例5(a)中制备的三软脂酸甘油酯粒子的体积平均粒度分布图。
发明详述本发明提供一种由乳液的超临界流体萃取(“PSFEE”)制备粒子的方法。为了形成粒子，将溶质溶解在适当的溶剂中形成溶液。然后将溶液分散在不混溶的液体中形成乳液；溶质在不混溶的液体中不溶解。这样，该乳液包括含有溶质(在溶液中)的不连续相和连续相。从不连续相中萃取溶剂，溶质沉淀进入流体中形成在连续相(即，不混溶液体)中的粒子悬浮液。
参考图1，其显示了用于本发明方法的装置100。该装置100包括容器110，超临界流体源112，乳液源114，和第一、第二出口120、122。容器110优选为限定了轴线128的圆柱形，且具有侧壁130和第一、第二末端132、134。轴线128优选垂直，且末端132、134是定向的，使相对于彼此来说第一末端132在下，第二末端134在上。侧壁130和末端132、134具有连续的内表面136，其限定了萃取室138。
过滤器板144，优选为不锈钢的，且孔径小于0.5微米，其设置在室138内，并覆盖内表面的第一末端132。超临界流体源112通过过滤器板144与室138连通，并提供超临界流体流过其中。过滤器板144使超临界流体能形成气泡以细微液滴的形式呈气泡通过乳液，从而使超临界流体和乳液之间的接触达到最大。
乳液源114通过入口146与室138连通。在可选择的实施方案中，包括喷嘴的入口穿过侧壁130而连通。喷嘴优选具有一个或多个小直径孔。喷嘴将乳液喷入顶部空间142，这样，与仅用泵使乳液流通过入口146的情况相比，形成了相对更小的乳液微粒。另外，可将填充床放置在萃取室138内，优选紧邻第一末端132从而可以覆盖。如果存在填充床，则其可增加乳液和超临界流体之间的混合。室138具有空闲体积或基本上未被填塞的上部空间142。
回压调节阀162与第一出口120连通，放气阀168与第二出口122连通。回压调节阀162优选为26-1700型调节阀，其可商购自Tescom，美国(EldRiver，MN)。回压调节阀162控制从离开萃取室138获得超临界流体的溶剂的流速，从而将萃取室138内的压力P1保持在预定的压力范围内。放气阀168用于保证安全，其为标准商业用阀，且可与其它商业用阀换用。
溶质优选为不溶或微溶于水的物质。因此，该方法尤其适于制备许多药物化合物，因为其中很多物质不溶或微溶于水，并以胶体悬浮水溶液施用于病人。据估计，市场上的所有药物化合物中约40％不溶或微溶于水，因此特别适于用本发明的方法制备。另外，将胶体悬浮液通过与萃取室138连通的高压过滤器可获得浓缩的湿润粒子。然后浓缩湿润粒子可通过冷冻干燥或真空干燥技术进行干燥，从而获得干燥粉末。
本发明并不限于药物，还可用于其它行业。因此，其它适当的可采用的溶质包括，例如，生物活性物质、医药试剂、营养物质、蛋白质、肽、生物碱、alkyloid、动物和/或植物提取物、抗原、核酸、抗生素、维生素、类脂、聚合物、聚合物前体、颜料、毒素、杀虫剂、病毒物质、诊断辅助物、农用化学剂、染料、炸药、涂料、化妆品、酶和催化剂。
形成不连续相的超临界流体可溶液体或溶剂优选为有机溶剂或油，因此其不溶于或只能部分溶于水。不溶于水的合适优选的有机溶剂包括，例如，甲苯、环己烷和更高级的烷烃。部分溶于水的有机溶剂包括，例如，乙酸乙酯、乙酸丙酯和2-丁酮。
形成连续相的超临界流体不溶的液体优选为水。自然可以理解，水溶性的、水和含水的都是典型的极性溶剂流体的术语，正如水不溶性的、有机溶剂、油等都是典型的非极性溶剂流体的术语。因此，根据本发明，极性流体和非极性流体可分别被水或水溶物和油或水不溶物取代。
优选并如上述所讨论的，表面活性剂用于形成稳定的乳液。本发明中所用的表面活性剂并不要求很高，任何用于形成水包油(o/w)、油包油(o/o)、油包水(w/o)或多相(如，w/o/w等)微乳液和粗滴乳液的常规表面活性剂均可使用。特别适合的表面活性剂为聚氧乙烯一油酸山梨糖醇酯，例如TWEEN-80，其可由ICI Americas，Inc.(Bridgewater，NJ)商购获得。优选地，本发明中所用的表面活性剂将具有适于制备稳定乳液的亲水亲油平衡值(HLB)。
乳液胶束的粒度取决于搅拌速率或乳化器的均化程度以及表面活性剂或溶剂或溶质的浓度。通常，均化程度越高、表面活性剂浓度越高、溶质和溶剂浓度越低，制得的胶束越小。乳化器优选分散搅拌机、超声波喇叭形机、微射流均质机、静态混合器、胶体研磨机、气流式混合机、汽轮混合机，或自发乳化技术。
优选地，表面活性剂用于在乳液液滴中的溶剂和悬浮水相之间形成热力学平衡。超临界流体从乳液液滴中萃取溶剂，使溶质以细小粒子形式沉淀。当超临界流体由乳液中萃取溶剂时，由于过饱和现象而形成粒子。乳液中存在的表面活性剂在粒子形成后不久就使其稳定，因此防止粒子由于团聚而生长。
在本发明的一个优选实施方案中，乳液包括水不溶性溶质，例如，药物。溶质溶解在水不溶性或部分溶解的有机溶剂中。然后含有机溶剂的药物溶液被乳化与一种或多种稳定剂或表面活性剂一起混入含水介质中。可将稳定剂加至有机溶剂相中，或另选择为加至水相中，或加入两种相中，以提高乳液的稳定性。乳液在操作过程中稳定是优选的，以提高该方法形成的粒子的均匀性。但是，使用稳定或不稳定的乳液都可使粒子进行沉淀。因此，使用表面活性剂可任选，并用于提供粒子稳定性和提高粒子均匀性。表面活性剂还可在粒子形成过程中、粒子形成后或既在过程中也在之后抑制粒子之间的团聚。
超临界流体优选为超临界二氧化碳(“CO2”)。但是，合适的另外优选的超临界流体包括水、三氟甲烷、一氧化二氮、二甲醚、直链或支链C1-C6-烷烃、烯烃、醇及其结合。优选的烷烃和醇包括乙烷、乙醇、丙烷、丙醇、丁烷、丁醇、异丙烷、异丙醇等。本发明的另外实施方案中，超临界流体包括接近超临界状态的物质，例如，压缩或液化气体。
操作过程中，将乳液装入萃取室138中。使超临界流体呈泡状进入萃取室与乳液进行接触。超临界流体从乳液胶束/液滴中汽提或分解溶剂。由胶束中除去溶剂导致过饱和现象，并使溶质沉淀进入连续相，如水中。将溶剂和超临界流体分离开，并从塔顶产物中回收，溶质作为分散固体夹带或悬浮在水相中。从乳液中除去溶剂后，可通过萃取室减压来收集溶质粒子在水中形成的水悬浮液。
另一个优选实施方案中，使用毛细管喷嘴将乳液喷至萃取室中，从而在顶部空间形成乳液液滴。替代实施方案中，喷雾过程中所用的喷嘴为同轴喷嘴或超声喷嘴，或商业上已知的等同物。将超临界流体引入萃取室与乳液液滴接触。可将振动表面或混合器(如，推进型混合器)放置在萃取室中，并进行操作以增大或提高乳液和超临界流体的接触面积。
操作过程中，超临界流体由液滴中汽提或分解溶剂。从液滴中除去溶剂导致溶质在溶剂中过饱和，结果，溶质沉淀进入连续相。各个乳液液滴可产生一个或多个粒子。每个乳液液滴的粒子数量可以调节，如通过液滴粒径、乳液浓度和溶质浓度，和选择操作条件以及溶剂、溶质和超临界流体类型来调节。
优选地，将溶剂和超临界流体分离开，并从塔顶产物中回收，而溶质作为分散固体粒子夹带或悬浮在连续或水相中。通过用纯净的CO2吹扫，可从室中除去溶解在超临界流体中的残余溶剂。一旦除去残余溶剂，则减压萃取室，从而可收集粒子的水悬浮液。
人们认为，液滴中溶剂相和超临界相之间的传质现象导致溶剂中的溶质出现过饱和。过饱和现象又使溶质以微粒形式沉淀进入连续相中。可对有机相和超临界相之间的传质速率进行选择，以使传质进行得非常快。对于将乳液注射到超临界流体中的情况，由于超临界流体介质内的微小液滴进行运动因而使传质速率增大。此外，可加入表面活性剂分子，通过稳定形成的微小核而防止粒子生长。使用此方法获得的粒子平均直径范围通常为纳米至低微米。
可用超过滤或高速离心作用过滤水悬浮液获得高纯度粒子。这种本发明的可选择实施方案可用于沉淀多种基本不溶于连续相(如水)的物质。
在可选择的优选实施方案中，使用含部分水溶性的溶剂和水的溶液制备乳液。溶剂用水饱和，水也被用溶剂饱和。在乳液液滴中的溶剂与悬浮水相之间形成热力学平衡。除了作为抗溶剂外，超临界流体还萃取溶解在水相中的溶剂。萃取打破液滴中有机溶剂和水相之间的热力学平衡，导致有机溶剂由液滴快速传质并进入水相。当超临界流体从乳液中萃取溶剂时，由于过饱和现象形成粒子。
溶剂萃取速率会影响形成粒子的粒度。通常，萃取速率越快，形成的粒子越小。与其它常规技术的萃取速率相比，超临界CO2萃取具有相对较快的萃取速率，因此有助于形成相对较小的粒子。根据本发明方法得到的粒子的直径通常在纳米范围内，或个位数字的微米范围内，还具有窄粒度分布。尤其，制得的粒子的粒度在0.1纳米至1.0毫米的范围内。更尤其，制得的粒子的粒度在0.1微米至400微米的范围内，最优选在1纳米至500纳米范围内。因此，选择参数可决定粒度大小，例如溶剂、溶质和超临界流体类型和其它工艺参数。
本发明尤其适于制备溶质的纳米或微米粒子，其基本不溶于水，且能溶于适当的、通常与水不混溶的有机溶剂中。这种粒子可用于不同产业，例如，在制药业中用于药物粒子加工和粉碎、药物封装和制剂；在制备颜料中用于制备颜料的纳米粒子，还可用于颜料涂层；在电子业中用于制备无机或有机物质的纳米粒子。
根据本发明的方法可以在操作中为间歇工艺或连续工艺。连续工艺中，以与乳液进入萃取室大约相同的速率从萃取室中除去所得固体粒子的液体悬浮液。按照与超临界流体进入萃取室大约相同的速率从萃取室中除去含超临界流体的溶剂。萃取室压力优选保持在大约恒定的压力值下，或在窄压力值范围内。
实施例下列实施例仅为了说明根据本发明的方法和实施方案，其不应对申请构成限制。除非特殊说明，所有组分都商购自通用的化学品供应商，如SigmaAldric，Inc.(St.Louis，MO)和/或Fisher Scientific International，Inc.(HanoverPark，IL)。
实施例1实施例1(a)一使用水不溶性有机溶剂，根据本发明的方法制备聚苯乙烯粒子。
聚苯乙烯(PS)乳液的制备开始，先将0.25g聚苯乙烯(PS)和0.2g SPAN-80(表面活性剂)溶解入20g甲苯中形成溶液。然后将该溶液加入到200g含0.3g TWEEN-80(表面活性剂)的水中形成混合物。使用分散搅拌机，在6000rpm下，经10分钟，使混合物乳化，形成乳液1(a)。
PS粒子的制备实施例1(a)中，将乳液1(a)的4.0mL等分试样装入体积为10mL的萃取室中。将玻璃棉和珠填充到萃取室死体积内，以防止液体在萃取过程中发生夹带，并使减压过程中残余甲苯的再沉淀最小化。然后使超临界CO2通过萃取室底部的0.5μm的不锈钢过滤器板而呈泡状进入萃取室。萃取室压力保持在80巴，温度保持在45摄氏度(℃)，CO2流速保持为0.7毫升/分钟(ml/min)。从该室中萃取的甲苯的量经光电二极管并列UV/VIS检测器测定。90分钟内，几乎所有甲苯都从乳液1(a)中萃取出来(测定残余甲苯为每百万(ppm)20份)。减压萃取室，得到粒子的胶体悬浮水溶液。
PS粒子的分析使用透射电子显微镜对所得胶体悬浮水溶液中的PS粒子的形态进行分析。使用动态光散射仪(DLS)进行粒度分布分析。由透射电子显微镜(TEM)确定，所有情况下，聚苯乙烯粒子均为分离的球形粒子，粒径近乎均匀且在纳米范围内。由DLS结果可知，实施例1(a)中制得的粒子的平均粒度具有体积平均值276纳米(nm)，数量平均值145nm，聚合度分布性为0.26。图2说明了实施例1(a)中制得的聚苯乙烯粒子的体积粒度分布，单位为纳米。
实施例1(b)-1(f)-压力和温度对PS粒度的影响实施例1(b)-1(f)用于确定压力和温度对根据本发明的方法制得的聚苯乙烯粒子粒度的影响。具体地说，实施例1(b)-1(f)是使用乳液1(b)，按下表1中所列的不同压力和温度值下进行制备的。
PS乳液的制备除下面的详述外，其余都按照制备乳液1(a)的相同方式制备乳液1(b)。开始，将0.21g聚苯乙烯和0.2g SPAN-80(表面活性剂)溶解入20g甲苯中形成溶液。然后将溶液加入到200g含0.3g TWEEN-80(表面活性剂)的水中形成混合物。在12,000psi压力(3程)下，使用可商购获得的均化器(型号MY110)乳化混合物形成乳液1(b)。使用DLS得到液滴的粒度分布。乳化液的平均液滴粒度为184nm，标准偏差为34nm。
PS粒子的制备。
除表1所列之外，其余都按照实施例1(a)中相同的方式制得实施例1(b)-1(f)的PS粒子。变化压力和温度以确定压力和温度对PS粒度(见表1)的影响。
PS粒子的分析。
使用DLS对这些试验中得到的粒子进行粒度分析。DLS分析结果列于表1中。表1表明实施例1(b)-1(f)的粒度相对于实施例1(a)有所减小。提高实施例1(b)中的均化程度产生更小的乳液液滴，其反过来导致沉淀之后得到更小的粒子粒度。
表1.使用乳液1(b)，在不同压力和温度值下进行实施例1(b)-1(f)所得到的PS粒子的平均粒度。

实施例2通常，实施例2(a)-2(m)说明了使用部分水溶性的有机溶剂，根据本发明方法制备EUDRAGIT RS(EU)粒子。具体地说，实施例2(a)-2(d)说明了表面活性剂浓度对EU粒度的影响，实施例2(e)-2(h)说明了溶剂浓度对EU粒度的影响，实施例2(i)-2(m)说明了溶液中溶质浓度对EU粒度的影响。
实施例2(a)-2(e)表面活性剂浓度对EU粒度的影响。
EUDRAGIT(EU)乳液的制备开始，先制备EU溶液将5％(w/wEA)的EUDRAGIT RS(EU)溶解入水饱和乙酸乙酯(EA)溶液的第一部分(20g)中，形成EU溶液。然后将此EU溶液加至含聚乙烯醇表面活性剂(PVA)的水饱和EA溶液的第二部分(180g)中，形成混合物。因此，所得浓度为EA10％w/w总量，水为90％w/w总量，EU为5％w/wEA，PVA为1％w/w水。使用分散搅拌机，在3000rpm下，经2分钟，使混合物乳化，形成乳液2。
乳液2为实施例2中所用的标准乳液，在实施例2(a)-2(d)中变化PVA浓度，见表2。在实施例2(e)-2(h)中变化溶剂浓度，见表3。在实施例2(i)-2(m)中变化溶液中的EU浓度，见表4。所有其它参数保持恒定。
EUDRAGIT粒子的制备对于实施例2(a)-2(d)，将具有不同表面活性剂浓度的乳液2的4.0mL等分试样装入体积为10mL的萃取室中。将玻璃棉和珠填充到萃取室死体积内，以防止液体在萃取过程中发生夹带，并使减压过程中残余甲苯的再沉淀最小化。
使超临界CO2通过萃取室底部的0.5μm的不锈钢过滤器板呈泡状进入制备萃取室中。使用1ml/分钟的二氧化碳流速。温度和压力保持恒定，分别为80巴和35℃。
从该室中萃取的EA的量经光电二极管并列式UV/VIS检测器测量。30-40分钟内，几乎所有EA都从乳液中萃取出来。减压萃取室，得到EU聚合物粒子的胶体悬浮水溶液。
EUDRAGIT(EU)粒子的分析使用透射电子显微镜(TEM)对实施例2(a)-2(d)中得到的粒子的形态进行分析。应用时，使用动态光散射仪(DLS)测定粒子的流体动力学半径。图3为实施例2(a)中制备的ERDRAGIT RS粒子的TEM显微照片。图3中TEM的放大率为约200,000，并且EU粒子直径在纳米范围内。
出人意料的，提高表面活性剂浓度导致EU粒子数量均值增加。结果列于表2中。
表2.表面活性剂浓度对EU粒度的影响。

实施例2(e)-2(h)-溶剂浓度对粒度的影响。
EU乳液和粒子的制备。
除表3所述之外，其余都按照实施例2(a)-2(d)中相同的方式制得实施例2(e)-2(h)。变化EU溶液与水的比例，或变化乳液浓度，以确定水中的溶液浓度对粒度的影响。按照实施例2(a)-2(d)中相同的方式制备EU粒子。
EU粒子的分析。
按照与实施例2(a)-2(d)相同的方式对实施例2(e)-2(h)中制得的EU粒子进行粒度和形态分析，也就是，分别使用TEM和DLS进行分析。当乳液中的油(EU溶液)浓度增大时，EU粒度也增加。正如表3中所列的结果所示。图4-5分别为在实施例2(f)和2(h)中制备的EU粒子的体积粒度分布图。
表3.乳液中油浓度对EU粒度的影响。

实施例2(i)-2(m)-聚合物浓度对粒度的影响。
EU乳液和粒子的制备。
除表4所述之外，其余都按照实施例2(e)-2(h)中相同的方式制得实施例2(i)-2(m)。变化EU在溶液中的比例，以确定溶液中的EU浓度对粒度的影响。按照实施例2(a)-2(e)中相同的方式制备EU粒子。
EU粒子的分析。
分别使用DLS和TEM，按照与实施例2(a)-2(d)相同的方式对EU粒子进行粒度和形态分析。表4中列出了使用具有不同EUDRAGIT RS浓度的乳液进行沉淀试验所得的结果。出人意料的，增大溶液中的聚合物含量使EUDRAGIT RS的粒度下降。
表4.溶液中的EU浓度对EU粒度的影响。

实施例3实施例3确定聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)微米和纳米粒子的沉淀特性，该粒子根据本发明使用部分水溶性有机溶剂制得。PLGA通常被认为是可生物降解的聚合物。尤其，实施例3(a)-3(d)说明了乳液中溶剂浓度变化对粒度的影响。实施例3(e)-3(g)说明了乳液中聚合物浓度对粒度的影响。实施例3(h)说明了聚合物纳米粒子的沉淀作用，实施例3(i)说明了不将CO2呈泡状进入乳液的情况下，PLGA粒子的沉淀效果。
实施例3(a)-3(d)-溶剂浓度变化的影响。
PLGA乳液的制备按照表5所列，制备具有不同EA浓度和恒定PVA和PLGA浓度的乳液3(a)-3(d)。将聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)溶解在用乙酸乙酯(EA)饱和的水中，按表5中所示的比例形成溶液。将溶液加入到计量好的0.5％(w/w)的聚乙烯醇(PVA)水溶液中，形成混合物。用分散搅拌机，在5000rpm下，经3分钟，乳化混合物，分别形成乳液3(a)-3(d)。
PLGA粒子的制备。
按照下列方法制备实施例3(a)-3(d)的粒子。将乳液3(a)-3(d)的4.0ml等分试样分别装入萃取室中。用与实施例2中制备粒子的方式相似制备PLGA粒子，除以下过程萃取室保持在恒定的操作压力和温度下。CO2通过萃取室的流速保持恒定。具体地说，所用压力为80巴，温度为45℃，CO2流速为1ml/分钟。使用光电二极管并列式UV/VIS检测器测定从萃取室中萃取的溶剂量。EA萃取完全结束后，减压萃取室，得到粒子的胶体悬浮水溶液。
PLGA粒子的分析。
在所有实施例3(a)-3(d)中，60分钟后几乎全部EA被从乳液中萃取出来，所有情况下残余EA确定都小于100ppm。分析之前，洗涤和过滤粒子以从悬浮水溶液中除去PVA。
使用扫描式电子显微镜(SEM)分析所得胶体悬浮水溶液中的PLGA粒子的形态。图6为实施例3(a)中所得的PLGA粒子的SEM显微照片。由于尺寸为1微米，因此该PLGA粒子为亚微细粒，不聚结，形状为球形，且具有窄粒度分布。使用动态光散射仪(DLS)进行粒度分布分析。使用具有不同溶剂或EA浓度的乳液进行沉淀试验，结果列于表5中。出人意料的，增加乳液中EA的相对百分数导致PLGA粒子的数量均值和体积均值下降。
表5.从具有不同EA浓度的乳液中得到的PLGA粒子的粒度。

实施例3(e)-3(g)-PLGA聚合物浓度变化的影响。
PLGA乳液的制备。
除下列乳液具有如表6中所列的不同PLGA浓度和恒定PVA和EA浓度之外，按照与乳液3(a)-3(d)相同的方式制备乳液3(e)-3(g)。
PLGA粒子的制备。
按照与实施例3(a)-3(d)所使用的相同方式，制备实施例3(e)-3(g)中的粒子。
PLGA粒子的分析分别使用DLS和SEM，按照与实施例3(a)-3(d)相同的方式对实施例3(e)-3(g)中制得的PLGA粒子进行粒度和形态分析。使用不同PLGA浓度乳液进行沉淀试验的结果如表6所示。图7-8分别为实施例3(e)和3(f)中制备的PLGA粒子的体积粒度分布图。直径在纳米范围内。
表6.不同PLGA浓度对粒度的影响。

实施例3(h)-乳液均化作用对粒度的影响。
聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)乳液的制备将4.01g聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)溶解在40.1g用乙酸乙酯(EA)饱和的水中。将溶液加入到160g 0.5％(w/w)的聚乙烯醇(PVA)水溶液中形成混合物。用分散搅拌机，在5000rpm下，经3分钟，使混合物乳化，然后在14,000psi(3程)下用可商购的微射流均质机(型号M110-L)均化形成乳液3(h)。
PLGA粒子的制备。
将乳液3(h)4.0mL的等分试样装入萃取室中。按照与实施例3(a)中制备粒子的相似方式制备PLGA粒子。萃取室保持在恒定的操作压力和温度下。CO2通过萃取室的流速保持恒定。具体地说，所用压力为80巴，温度为45℃，CO2流速为1ml/分钟。使用光电二极管并列UV/VIS检测器测定从萃取室中萃取的溶剂量。在EA完全萃取后，减压萃取室，得到粒子的胶体悬浮水溶液。
PLGA粒子的分析。
使用扫描式电子显微镜(SEM)对实施例3(h)中所得粒子的胶体悬浮水溶液的粒度和形态进行分析。使用动态光散射仪(DLS)测定PLGA粒子的流体动力学直径。实施例3(h)中得到的粒子的DLS分析表明所得粒子的平均体积直径和数均直径分别为217nm和117nm。图9为实施例3(h)中制得的纳米粒子的显微照片。
结果说明均化作用和液滴尺寸影响所得粒子的粒度。因此，通过选择参数，如转子速度、剪切力、剪切类型、均化时间、各种参数排列等可控制粒度。
实施例3(i)-单一或减少的界面对PLGA粒度的影响。
按照与实施例3(g)相同的方式进行实施例3(i)，且还使用乳液3(g)，但是，并未通过过滤器板使CO2呈泡状进入萃取室内并进一步通过乳液，而是将超临界CO2引入萃取室顶部，且未通过乳液就将其移出顶部。也就是，超临界CO2沿单一或减少的界面表面积与乳液接触，并且未呈泡状通过或溶解通过乳液。
PLGA粒子的分析。
按照与实施例3(h)相同的方式对PLGA粒子进行分析。PLGA粒子的平均体积均值为2408纳米(nm)，数量均值为656纳米(nm)。图10为实施例3(i)中制得的PLGA粒子的体积粒度分布图，平均直径在纳米范围内。
实施例4根据本发明的优选实施方案沉淀醋酸胆固醇酯(水不溶性类固醇)纳米粒子。下列实施例中，使用微细喷嘴将CA乳液注入含有超临界CO2的萃取室中。
醋酸胆固醇酯(CA)乳液的制备实施例4(a)-4(c)中，将计量量的醋酸胆固醇酯(CA)溶解在10.0g水饱和的EA中形成溶液。然后将该溶液加入到EA饱和的90.0g、1％(w/w水)PVA的水溶液中形成混合物。使用分散搅拌机，在5000rpm下，经3分钟，使混合物均化形成表7中所列的乳液4(a)-4(c)。
醋酸胆固醇酯(CA)粒子的制备。
使用与图1所示装置100相似的装置制备CA纳米粒子，区别在于通过喷嘴将乳液喷入室中，喷嘴是通过侧壁伸入而不是通过入口146。所用装置的部件由体积为100毫升的沉淀室组成。用HPLC泵将乳液4(a)-4(c)注入沉淀室中。用加热套使沉淀室维持恒温。压力和温度参数分别为100巴和40℃。
以连续方式操作实施例4(a)-4(c)的方法。在希望的操作温度下，用超临界二氧化碳将沉淀室加压至希望的操作压力。二氧化碳流过沉淀单元的流速保持恒定，为1 6ml/分钟。以恒定流速1.0ml/分钟，通过50-微米的喷嘴将实施例1中制备的乳液喷射入沉淀室中。由于乳液自由喷射入沉淀室，其自动成为小液滴，用超临界二氧化碳连续从液滴中萃取出EA。由于对EA的萃取，溶质粒子从溶液中沉淀出来。
乳液流进入沉淀室保持10分钟，之后用新鲜二氧化碳吹洗沉淀室120-180分钟，从而从沉淀室中洗涤过量残余EA。然后缓慢减压沉淀室，直至其达到环境压力，收集CA粒子的水悬浮液并分析。
醋酸胆固醇酯(CA)粒子的分析。
使用DLS确定实施例4(a)-4(c)中所得粒子的粒度分析。使用SEM对CA粒子的形态进行分析，如图11中的SEM显微照片所示。粒子显示为均匀的，并具有小球或圆柱形。CA粒子具有窄粒度分布。乳液中CA浓度上升，则CA粒度也增大。实施例4(a)-4(c)中，平均粒度和CA含量之间的关系如图12所示，结果列于表7中。图13为实施例4(a)中制得的CA粒子的体积重量分布图。表7.CA粒子制备参数，其中CA浓度是变化的。

实施例4(d)-4(f)-不同CO2密度的影响。
CA乳液的制备。
按照与乳液4(b)相似的制备方式制备乳液4(d)-4(f)。
醋酸胆固醇酯(CA)粒子的制备。
按照与实施例4(a)-4(c)中相似的粒子制备方式制备实施例4(d)-4(f)中的粒子，只是使用表8中所列的不同二氧化碳浓度。
醋酸胆固醇酯(CA)粒子的分析。
不受超临界二氧化碳密度的影响而获得基本均匀的粒度。因此，减小对超临界流体密度的关注，可获得和保持粒度均匀性。结果列于表8。
表8.CA粒子制备参数，其中变化CO2密度。

实施例4(g)-4(k)-溶剂和溶质浓度对粒度的影响。
醋酸胆固醇酯(CA)粒子的制备。
除了下述不同外，按照与实施例3(a)中相同的方式制备实施例4(g)-4(k)。实施例4(g)-4(k)中，如表9所示制备乳液4(g)-4(k)。变化CA浓度和EA浓度，以确定溶剂和溶质浓度对粒度的影响。使用可商购的微射流均质机(如，型号M110-L)在14.5Kpsi和3程下均化乳液4(g)-4(k)。加入PVA达0.5w/wH2O。对实施例4(g)-4(k)相应地使用乳液4(g)-4(k)。
醋酸胆固醇酯(CA)粒子的分析。
实施例4(g)-4(k)的CA粒子的粒度列于表9中。图14(a)、14(b)和14(c)为实施例4(g)-4(k)中CA和EA的体积(平均)粒度(纳米)对浓度(百分率w/w总量)的多维图。
表9.实施例4(g)-4(k)中组分浓度。

实施例5三软脂酸甘油酯乳液的制备实施例5(a)中，将5％w/w的三软脂酸甘油酯(液体)溶解于20.0g氯仿中。使用5％w/w的卵磷脂作为表面活性剂并溶解于氯仿中。然后将三软脂酸甘油酯溶液加至180.0g含0.25g甘胆酸钠的水中形成混合物。在500巴下，使用分散搅拌机，在5000rpm下均化该混合物1程(pass)，然后在1300巴下，使用可商购的微射流均质机(型号M110-L)均化3程，形成乳液5(a)。
三软脂酸甘油酯粒子的制备按照与前述实施例中基本相同的方法进行实施例5(a)。操作压力为80巴，操作温度为35℃。二氧化碳流速为1ml/分钟。
三软脂酸甘油酯粒子的分析按照与前述实施例中基本相同的方法制备、收集和分析三软脂酸甘油酯粒子。结果列于表10。图15为实施例5(a)中制得的CA纳米粒子的SEM显微照片。图16为实施例5(a)中制备的三软脂酸甘油酯粒子的数均粒度分布图，图17为同一粒子的体积平均粒度分布图。图16-17表明数均和体积平均粒度分布都在小于50纳米的范围内。
表10.三软脂酸甘油酯粒子制备结果。

此处描述的方法和实施方案只是具有权利要求中所述的发明要素的结构、系统和方法的实施例。所写的说明可使本领域熟练技术人员进行和使用具有替代要素的实施方案，该实施方案同样相应于权利要求中所述的发明要素。因此本发明的范围包括与权利要求的语言描述没有差别的其它结构、系统和方法，还包括与权利要求的语言描述无实质差别的其它结构、系统和方法。
权利要求
1.一种制备粒子的方法，包括乳液与超临界流体接触，该乳液具有连续相和不连续相，不连续相包括在其中溶解了溶质的溶剂，溶质通常不溶于连续相中，不连续相中的溶剂可溶于超临界流体中；和将溶剂由乳液的不连续相中萃取并进入超临界流体中以使溶质发生沉淀，从而形成悬浮在连续相中的溶质粒子。
2.权利要求1中所定义的方法，其中不连续相为非极性溶剂，连续相为水。
3.权利要求1中所定义的方法，其中溶质包括生物活性物质或药物。
4.如权利要求1中所定义的方法，其中溶质包括聚合物。
5.如权利要求4中所定义的方法，其中聚合物为可生物降解的聚合物。
6.如权利要求1中所定义的方法，其中在连续操作步骤中，溶质粒子悬浮在连续相中。
7.如权利要求1中所定义的方法，其中粒子平均直径从约0.1纳米至约1.0毫米。
8.如权利要求7中所定义的方法，其中粒子平均直径从约0.1微米至约400米。
9.如权利要求8中所定义的方法，其中粒子平均直径从约1纳米至约500纳米。
10.权利要求1中所定义的方法，其中乳液进一步包括表面活性剂。
11.如权利要求1中所定义的方法，其中超临界流体包括二氧化碳。
12.如权利要求1中所定义的方法，其中溶质选自包括医药试剂、营养物质、蛋白质、肽、生物碱、生物碱、动物和/或植物提取物、抗原、核酸、抗生素、维生素、类脂、聚合物、聚合物前体、颜料、毒素、杀虫剂、病毒物质、诊断辅助物、农用化学剂、染料、炸药、涂料、化妆品、酶和催化剂的组中。
13.如权利要求1中所定义的方法，其中粒子基本上为球形。
14.如权利要求1中所定义的方法，其中连续相为水或水溶性物质。
15.如权利要求1中所定义的方法，其中不连续相包括非极性溶剂或部分水溶性有机溶剂。
16.如权利要求1中所定义的方法，进一步包括选择溶质在溶剂中的浓度，以获得希望的粒度的步骤，其中溶质浓度增大导致粒度增大，溶质浓度减小导致粒度减小。
17.如权利要求1中所定义的方法，进一步包括选择不连续相在连续相中的浓度，以获得希望的粒度的步骤，其中不连续相浓度增大导致粒度增大，不连续相浓度减小导致粒度减小。
18.如权利要求1中所定义的方法，进一步包括将乳液喷射入超临界流体中形成乳液液滴的步骤，该液滴含有连续和不连续相部分，其中将溶剂由不连续相中萃取出来的步骤后，粒子沉淀并悬浮在连续相的液滴中。
19.如权利要求20中所定义的方法，进一步包括选择乳液的液滴尺寸，以获得希望的粒度的步骤，其中液滴尺寸增大导致粒度增大，液滴尺寸减小导致粒度减小。
20.如权利要求20中所定义的方法，其中通过喷嘴喷射入乳液，从而使乳液喷洒至超临界流体体积内，且喷嘴为毛细管喷嘴、同轴喷嘴或超声喷嘴。
21.如权利要求20中所定义的方法，其中接触步骤包括使用混合器来增大乳液液滴与超临界流体之间的接触面积，混合器为振动表面和推进式混合器，从而增大溶剂由乳液液滴到超临界流体的传质速率。
22.如权利要求1中所定义的方法，进一步包括选择乳液中不连续相的液滴尺寸，以获得希望的粒度的步骤，其中不连续相液滴尺寸增大导致粒度增大，不连续相液滴尺寸减小导致粒度减小。
23.如权利要求1中所定义的方法，其中接触步骤包括将乳液和超临界流体泵入室中；沿着表面积减小的界面边界使乳液与超临界流体接触在一起，其中通过界面边界将溶剂由不连续相萃取至超临界流体中；并且从室中移出超临界流体和溶剂，从而为了萃取溶剂使超临界流体不呈气泡通过乳液。
24.如权利要求1中所定义的方法，进一步包括将极性溶剂分散在非极性溶剂中，或将非极性溶剂分散在极性溶剂中形成乳液的步骤，从而形成水包油、油包水、油包油或多相乳液，其中如此形成的乳液为微乳液、粗乳液或粗乳液中的微乳液。
25.如权利要求26中所定义的方法，其中乳液的形成步骤是使用微射流均质机、超声波喇叭形机、分散搅拌机、静态混合器、胶体研磨机、气流式混合机、汽轮混合机，或自发乳化技术进行来进行的。
26.如权利要求1中所定义的方法，进一步包括过滤悬浮粒子形成粒子的浓缩滤饼，冷冻干燥滤饼获得干燥粒子的步骤。
27.如权利要求1中所定义的方法，其中超临界流体为超临界或接近超临界状态，且主要由二氧化碳、水、三氟甲烷、一氧化二氮、二甲醚、直链或支链C1-C6-烷烃、链烯烃、醇或其结合组成。
28.如权利要求1中所定义的方法制得的粒子，其中粒子不溶于或微溶于水，且悬浮在连续水相中，其中粒子直径从约1纳米至约100微米，粒子不含、或基本不含残余量的不连续相和超临界流体，且粒子包括溶质，其中溶质选自包括生物活性物质、医药试剂、营养物质、蛋白质、肽、生物碱、alkyloids、动物和/或植物提取物、抗原、核酸、抗生素、维生素、类脂、聚合物、聚合物前体、颜料、毒素、杀虫剂、病毒物质、诊断辅助物、农用化学剂、染料、炸药、涂料、化妆品、酶和催化剂的组中。
29.一种装置，包括使乳液与超临界流体接触的设备，乳液具有连续相和不连续相，不连续相包括在其中溶解了溶质的溶剂，溶质通常不溶于连续相中，不连续相中的溶剂溶于超临界流体；和将溶剂由乳液的不连续相萃取并进入超临界流体中，以使溶质过饱和，从而形成悬浮在连续相中的溶质粒子的设备。
全文摘要
一种制备微米粒子和纳米粒子的方法，使用超临界流体源(112)，从来自(114)的乳液萃取其中溶解了溶质的溶剂。将欲沉淀的溶质溶解在溶剂中形成溶液，将溶液分散在不混溶或部分混溶的液体中，以在乳液源(114)处形成乳液。在容器(110)中，使用超临界流体通过从乳液中萃取溶剂而制得粒子。该方法可制备基本不溶于水的粒子的水悬浮液，该方法中使用的、开始时形成乳液的溶剂可由容器开(120)和(122)回收并循环。
文档编号B01J19/00GK1665576SQ03815675
公开日2005年9月7日 申请日期2003年6月20日 优先权日2002年7月3日
发明者普拉蒂哈什·查托帕迪亚, 鲍里斯·Y.·舍昆夫, 杰弗里·S.·塞晋尔, 罗伯特·W.·赫夫 申请人:费罗公司