专利名称：能够高效降解二氯甲烷的罗得西亚甲基杆菌h13及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株能够高效降解二氯甲烷的罗得西亚甲基杆菌H13及其应用。
背景技术：
DCM(二氯甲烷)是一类使用非常广泛的化学试剂与溶剂。由于其沸点低 (40. 1°C )、蒸汽压高(20°C时47Pa)，气态排放是其进入环境的主要方式。当前，DCM被认为 是大气污染中毒性较大的卤代烃类物质，在水中的溶解度小，但在脂类中的溶解度较大，容 易在生物体的脂肪组织中积累，具有很强的致癌、致畸、致突变作用，被美国环境保护署列 入129种优先控制的有毒污染物名单。因此探索有效去除DCM的技术对社会和环境有着重 要的意义。多年以来，DCM —度被认为是不可生物降解的物质，在水体及大气环境中广泛存 在。直至后来人们通过实验证明了 DCM可以被微生物降解及矿化，相关的研究才得以进一 步开展。自从1980年Brurmer等首次从工业废水中分离出能以DCM作为唯一碳源和能源 的Pseudomonas sp. DM1以来，迄今报道已相继分离到包括Hyphomicrobium sp. KDM2在内 的10余株具备分解DCM能力的菌株。通过多年的研究，人们充分肯定了微生物降解工业废 气中有机物的效果，具有投资少、运行费用低、能耗小及管理方便等优点，成为低浓度有机 废气(< 2000mg/m3时)治理的一个发展方向。近些年来，出现了许多不同的技术应用于从废气中除去DCM，如焚烧，吸附，湿擦洗 法等，但这些方法在处理相对较低浓度和大流量的DCM时价格非常昂贵。而生物工艺法因 其较低的运行费用、较好的安全性和处理DCM的高效性，所以在处理废气中的DCM方面越来 越受到重视。其中Hatmans等的研究表明用生物滴滤池处理废气中的DCM在技术上是可行 的，当气体空床停留时间(EBRT)为9. 6s时，其实验室DCM的去除率为57. 0%，而当EBRT为 20. 8s时，其实验室去除率可达85. 0%左右。Young等也指出，较高的液相回流率和自动、准 确的控制PH值是生物滴滤池稳定运行的关键因素。但国内鲜见相关的研究报道。迄今尚未有罗得西亚甲基杆菌降解DCM的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有DCM生物降解效率低、微生物世代时间长的问题，提供 了一株能高效降解DCM的菌株及其应用技术。本发明采用的技术方案是一株DCM高效降解菌-罗得西亚甲基杆菌(Methylobacteriumrhodesianum)
H13，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期 2010 年 5 月 20 日，保藏编号CCTCC No :M 2010121。所述罗得西亚甲基杆菌H13菌落特征如下菌体呈短杆状，无芽孢；菌落呈小圆 状、粉色、形态饱满、光滑湿润、易挑起，菌苔沿划线生长；氧化酶、接触酶反应为阳性；精氨 酸双水解酶、硝酸盐还原反应、半乳糖苷酶反应、吲哚反应均为阴性；不能水解淀粉和明胶；糖发酵实验为阴性，革兰氏染色阴性。该菌株的16S rDNA的GenBank登录号为HM245434。本发明还涉及所述的罗得西亚甲基杆菌H13在微生物降解DCM中的应用。 M. rhodesianum H13能利用DCM作为唯一碳源和能源生长，将DCM完全矿化成Cl_、C02和 H20。在纯培养条件下，该菌能在23h内能将5mM DCM完全降解。具体的，所述甲基杆菌H13可用于降解废水或废气中的DCM。优选的，所述降解在pH 5. 5 10.0、温度10°C 40°C、Cr浓度彡1.36M(0 1. 36M，优选0 0. 68M)的条件下进行。实验发现，Cl_浓度为0时，H13菌对DCM的降解效 果和生长情况最好；随Cl_浓度的增加，H13菌的生长延滞期相应延长，且DCM的降解速率 变慢，当CI—浓度高于0. 68M时，H13菌基本不生长，对DCM的降解也很差。用于降解废气中的二氯甲烷时，所述降解可在无机盐培养基中进行，所述无机盐 培养基组成如下4. 5g Na2HP04.12H20、1. 0g KH2P04、1. 8g (NH4) 2S04、0. 2g MgS04.7H20、0. 03g CaCl2 2H20, lmL微量元素，用KH2P04和K2HP04调pH至7. 0，蒸馏水补足至1L ；微量元素溶 液按如下组成配制:1L 蒸馏水中加入 1. 0g FeS04 7H20、0. 02g CuS04 5H20、0. 014g H3B03、
0.lOg MnS04 4H20、0. lOg ZnS04 7H20、0. 02gNa2Mo04 2H20、0. 02g CoCl2 6H20。本发明的有益效果主要体现在提供了一株能高效降解DCM的菌株，该菌株为好 氧革兰氏阴性杆菌，能够以DCM为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物，为生物法净 化含DCM废水及废气的工程应用奠定了基础。
图1为H13菌的生长曲线及Cl_浓度的变化曲线。图2为不同pH对H13菌降解DCM的影响。图3为不同温度下菌体浓度及DCM浓度随时间变化情况。图4为不同Cl_浓度对DCM降解菌的影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 :M. rhodesianum H13的分离与鉴定(1)样品采集及驯化现场采集台州某医药厂污水处理池的活性污泥，以DCM为唯一碳源和能源，进行 驯化、富集。数月后，经富集后的活性污泥，接种到含50mL无机盐培养基的250mL密封盐水 瓶中，以DCM作为唯一碳源和能源，继续培养、富集。实验需恒温(30 士 1°C)，并保持在好氧 条件下进行。无机盐培养液成分1L蒸馏水中加入4. 5g Na2HP04 12H20、1. 0gKH2P04、
1.8g(NH4)2S04、0. 2g MgS04 7H20、0. 03g CaCl2 2H20，lmL 微量元素溶液。微量元素溶液成分1L蒸馏水中加入 1. 0g FeS04 '7^0,0. 02gCuS04 '5^0,0. 014g H3B03、0. lOg MnS04 4H20、0. lOg ZnS04 7H20、0. 02gNa2Mo04 2H20、0. 02g CoCl2 6H20。(2)菌株分离与鉴定将在盐水瓶中经过多次传代富集的混合菌液，进行稀释涂布，依据菌体群落的差异性，挑取单菌落。对单菌落进行多次划线分离后，再接至以DCM为唯一碳源和能源的无机 盐培养液中，测试降解活性。选择具有DCM降解能力的纯菌，进一步分离纯化，获得有DCM 降解活性的菌株H13。菌株H13细胞呈短杆状，无芽孢；菌落呈小圆状、透明、粉色、形态饱满、光滑湿润， 易挑起，菌苔沿划线生长；革兰氏染色呈阴性。经API细菌鉴定系统获得H13的生理生化特征为氧化酶、接触酶反应为阳性；精 氨酸双水解酶、硝酸盐还原反应、半乳糖苷酶反应、吲哚反应为阴性；不能水解淀粉和明胶； 糖发酵实验为阴性。上述特征与文献(常见细菌鉴定手册)编录的甲基杆菌属的生理生化性状相吻 合。该菌株经16S rDNA同源性分析，H13与M. rhodesianum的亲缘关系最近，相似度达99%。 结合以上生理生化特征，因此确定本实验获得的DCM降解菌为M. rhodesianum。实施例2 :M. rhodesianum H13 降解 DCM 的特性接种M. rhodesianum H13 种子液(0D6QQ = 0. 186) 2mL 于 50mL 无机盐培养基，加入 DCM使初始DCM浓度为5mM，置于温度为30°C、转数为160r/min的摇床中培养，每隔一定时 间取样检测。结果见图1。随着反应的进行，菌体浓度逐渐增大；至23h时，DCM被完全降 解，菌体浓度达到0D6QQ = 0. 192。本实施例说明降解菌M. rhodesianum H13可利用DCM作 为唯一碳源和能源进行生长，并且具有高效降解DCM的能力。调节反应体系pH 分别为 5. 5,6. 0,6. 5,6. 8,7. 0,7. 2,7. 5,8. 0,8. 5,9. 0、 9. 5、10.0。在各反应体系中的加入DCM使初始浓度为5mM;接入初始0D_ = 0. 186的 M. rhodesianum H13种子液2mL，置于恒温摇床里振荡(30°C，160r/min)，18h后取样测其降 解率，结果见图2。在pH5. 5 10. 0，微生物均能降解DCM并伴随细胞浓度的增加。随着pH 从5. 5增大到10. 0，菌体浓度及DCM降解率均先增大后减小，M. rhodesianum H13降解DCM 的较适宜的pH值为7. 0。本实施例说明菌株H13在中性和偏碱性的较宽pH范围内能较好 得降解DCM，为其在不同pH环境的应用提供了保证。控制反应体系pH为7. 0，加入DCM使初始浓度为5mM，添加初始0D6(1(1 = 0. 186的 M. rhodesianum H13 种子液 2mL，分别置于温度为 25°C、30°C、37°C摇床(转数 160r/min) 中恒温振荡，定时取样检测M.rhodesianumH13菌体浓度和DCM残留浓度。结果见图3。 M. rhodesianum H13在25°C、30°C、37°C都能够较好地生长，且能较快地降解DCM。其中30°C 为菌株生长及DCM降解较适宜的温度。另外，当温度低至10°C或高于40°C时，DCM的降解 仍可进行，但速度比较缓慢。分别控制初始反应体系Cr浓度分别为0M、0. 017M、0. 17M、0. 34M、0. 68M、1. 02M、 1. 36M，加入DCM使初始浓度为5mM，添加初始OD600 = 0. 186的M. rhodesianum H13种子液 2mL。定时检测菌体浓度和DCM残留浓度。由图4可知，当C1—浓度为0M时，H13菌对DCM 的降解效果和生长情况最好；随Cl_浓度的增加，H13菌的生长延滞期相应延长，且DCM的 降解速率变慢。当CI—浓度高于0.68M时，H13菌基本不生长，对DCM的降解也很差。本实 施例说明H13菌能在CI—浓度为0M 0. 68M时生长。实施例3 :M. rhodesianum H13 净化 DCM 废气在有机玻璃生物滴滤塔内的聚丙烯填料表面上，用M. rhodesianumH13菌悬液接 种和挂膜，用无机盐培养基作为生物滴滤塔内H13菌的营养液进行循环喷淋，液体喷淋量10X10—3 12X10_3m7h，pH6. 5 7. 5，控制温度30°C左右，连续通入DCM气体，进口浓度 5 500mg/m3，停留时间30 45s。挂膜30天后，生物滴滤塔对DCM的净化效率可达80 % 99%。
权利要求
1.一株二氯甲烷高效降解菌——罗得西亚甲基杆菌(Methylobacteriumrhodesianum) H13，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期 2010 年 5 月 20 日，保藏编号CCTCCNo :M 2010121。
2.如权利要求1所述的罗得西亚甲基杆菌H13，其特征在于所述罗得西亚甲基杆菌 H13菌落特征如下菌体呈短杆状，无芽孢；菌落呈小圆状、粉色、形态饱满、光滑湿润、易挑 起，菌苔沿划线生长；氧化酶、接触酶反应为阳性；精氨酸双水解酶、硝酸盐还原反应、半乳 糖苷酶反应、吲哚反应均为阴性；不能水解淀粉和明胶；糖发酵实验为阴性，革兰氏染色阴 性。
3.如权利要求1所述的罗得西亚甲基杆菌H13在微生物降解二氯甲烷中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述甲基杆菌H13用于降解废水中的二氯甲焼。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述甲基杆菌H13用于降解废气中的二氯甲焼。
6.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述降解在pH5.5 10.0、温度101 40°C、Cl—浓度< 1. 36M的条件下进行。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述降解在无机盐培养基中进行，所述 无机盐培养基按如下组成配制4· 5g Na2HPO4 · 12H20、1. OgKH2PO4,1. 8g (NH4) 2S04、0. 2g MgSO4 ·7Η20、0· 03g CaCl2 ·2Η20，ImL 微量元素，用 KH2POjP K2HPO4 调 pH 至 7· O，蒸馏水补足至 IL ；微量元素溶液按如下组成配制=IL蒸馏水中加入1. Og FeSO4 · 7H20、0. 02gCuS04 · 5H20、 0. 014g Η3Β03、0· IOg MnSO4 · 4Η20、0· IOg ZnSO4 · 7Η20、0· 02g Na2MoO4 · 2Η20、0· 02g CoCl2 · 6Η20。
全文摘要
本发明提供了一株能高效降解DCM的菌株——罗得西亚甲基杆菌(Methylobacterium rhodesianum)H13，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国，武汉，武汉大学，430072，保藏日期2010年5月20日，保藏编号CCTCC NoM 2010121。该菌株为好氧革兰氏阴性杆菌，能够以DCM为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物，为生物法高效净化含DCM废水及废气的工程应用奠定了基础。
文档编号B01D53/84GK101993839SQ20101023498
公开日2011年3月30日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者庄庆丰, 於建明, 朱润晔, 陈东之, 陈建孟 申请人:浙江工业大学