从aav制剂中去除污染病毒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及将形状基本为球形的病毒从样品中包含的形状为杆状的病毒分离，其中对包含所述病毒的样品进行过滤。
【专利说明】从AAV制剂中去除污染病毒
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒学和基因治疗的领域。具体地，本发明涉及一种将形状为杆状的污染病毒(例如杆状病毒)从形状基本为球形的病毒(例如腺伴随病毒基因治疗载体)的制剂中去除的方法。
【背景技术】
[0002]在产生用于基因治疗的病毒载体中，由于安全性的缘故而使用复制缺陷型病毒。复制缺陷型病毒能够在体内感染人细胞并将转基因转移到所述细胞中，但其不能在所述细胞中自行复制。通常，这可以通过删除对病毒复制很重要的病毒基因例如和cap基因来完成。这还使得能够纳入目的基因产物来替换病毒基因。为了在宿主细胞内生成病毒颗粒，需要单独提供从所述复制缺陷型病毒中删除的病毒基因，例如通过提供辅助病毒。
[0003]腺伴随病毒(AAV)是非自主复制的病毒,其属于细小病毒科,构成外面有直径为约18-26nm的二十面体结构蛋白外壳的单链DNA分子。野生型AAV病毒可以整合到宿主细胞的基因组中，或者在辅助病毒的存在下在宿主细胞中复制。腺病毒最先被鉴定为可能的辅助病毒。然而，其他对人和动物有致病性的基本为球形的哺乳动物辅助病毒例如疱疹病毒也是适合的。最近这些年，在昆虫细胞中借助于基于杆状病毒的表达系统产生腺伴随病毒(AAV)载体(Urabe et al.[2002]Hum Gene Ther.13 (16): 1935-43)已经日益普遍，这是因为可以容易地放大所述系统的规模，用于基因治疗的工业应用。在该生成系统中，通常使用编码AAV r印基因、AAV cap基因和侧翼有AAV末端反向重复(ITR)的目的基因产物(转基因DNA)的三种重组杆状病毒·。
[0004]与使用辅助病毒或基于病毒的表达系统进行的病毒载体制备相关的显著缺点是形成产物病毒颗粒与辅助病毒的混合群，所述混合群必须要进行进一步纯化。由于污染病毒例如腺病毒或杆状病毒的潜在致病性和/或免疫原性，因此当在基因治疗中使用病毒载体时，必须要避免存在所述病毒或使其减到最少。
[0005]一些除去辅助病毒的方法目前是本领域已知的，然而，它们都各有缺点。这些方法的实例为密度梯度离心或热灭活或其结合。然而，密度梯度离心仅对于相对小的体积是经济上可行的，因此该方法对于工业规模是不可行的。热灭活基于AAV和辅助病毒的热稳定性不同。例如，将腺病毒和AAV的混合群加热到56-65°C，可导致大致上选择性地热灭活所述辅助病毒，而AAV的活性仅有轻微的损失。不幸的是，在样品中仍存在的变性的辅助病毒蛋白，一旦在基因治疗中使用，就能够在患者中弓丨起细胞免疫应答(Smith, C.A.etal.(1996) J.Virol.，70，6733-6740)。
[0006]另外，已经发展了柱色谱方法(包括离子交换色谱(基于阴离子和/或阳离子)和亲和色谱)用于纯化AAV载体。这些方法可导致高度富集的AAV载体制剂，但是不能单独地确认它们表现出足以满足销售的医药产品的监管要求的辅助病毒耗尽。
[0007]最后，在美国专利6，479，273中公开了通过使含有重组的AAV和腺病毒(即，两种基本为球形而直径相当不同的病毒)的溶液一次或多次过滤通过孔径为约50nm的滤膜或孔径为约35nm的滤膜，来实现两种病毒的分离。据公开rAAV具有约25nm的直径，而腺病毒可以说是具有约65_90nm的直径,但更大的直径例如接近IOOnm已经在文献[Kennedyand Parks (2009)Molecular Therapyl7(10):1664-1666 ；Berkowitz (2003)WCBP7th annualmeeting January7-102003, San Francisco, CA]中有报道。然而，污染病毒是在昆虫细胞中借助基于杆状病毒表达系统来生成AAV载体的过程中所产生的，其衍生自所述杆状病毒(baculoviridae),因此是杆状的，长度为约260nm,直径为约20nm。因为(重组的)AAV是基本为球形的，直径为约18-26nm，因此所述杆状病毒部分地(在两个维度中)具有与所述靶病毒相似的大小。
[0008]监管要求,例如由欧洲药品管理局(European Medicine Agency,EMA)对衍生自人或动物来源的细胞系的生物技术产品进行的病毒安全评价(ICH Q5A(R1))，要求生物制药的纯化过程能够去除任何非产品的病毒。去除病毒污染物是通过“病毒清除”或“病毒去除”工艺步骤来进行的，通常通过色谱和/或病毒过滤实现。同样，“病毒灭活”工艺步骤用于减弱潜在的由非产物病毒引起的致病效应。这通常含有极端的物理条件(例如pH、温度)和/或化学条件(例如去污剂、溶剂)。药物产品通常为小于约200kDa的蛋白质，并且“病毒去除”方法很完善。然而，相对新型的产品涉及包含大小为几千kDa的病毒的基因治疗产品，对于该产品“病毒去除”方法还未有据可查。具体地，其中药物产品是球形病毒而病毒污染物是杆状病毒的“病毒去除”方法尚未有记载。
[0009]因此，本领域需要另外的分离/纯化方法，以工业规模应用所述方法在技术上和经济上是可行的，并且所述方法能够从含有AAV的样品(优选获得自基于杆状病毒的表达系统的重组AAV样品)中部分或完全去除基于病毒的表达系统中的非产物病毒。从而降低非产物病毒的潜在致病性和/或免疫原性。具体地，本领域需要另外的分离/纯化方法，其中所述非产物病毒的形状为杆状，其长度是AAV直径的几倍，而直径与所述AAV相似。
【发明内容】
[0010]发明的简要i兑明
[0011]在第一方面,本发明涉及将细小病毒病毒体群与杆状病毒病毒体群分尚的方法，其中所述方法包括在过滤器上过滤包含细小病毒和杆状病毒病毒体的群的样品的步骤，只有所述细小病毒病毒体可以通过所述过滤器。优选地，所述过滤器的额定孔径为30-70nm，更优选30-40nm,又更优选32_38nm,最优选(约)35nm。在优选的实施方案中,所述细小病毒为腺伴随病毒，更优选所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾多衣壳核型多角体病毒(Autographacalifornica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcmNPVX
[0012]在优选的实施方案中，在样品过滤过程中使用的过滤器是病毒过滤器或超滤器。优选地，所述过滤器为表面式过滤器(surface filter)和/`或深度式过滤器(cbpthfilter)。本发明的方法中使用的过滤器优选包含选自如下的材料:铜铵再生纤维素、聚偏二氟乙烯、聚砜(例如聚醚砜，例如修饰的或未修饰的聚醚砜)、聚四氟乙烯、聚丙烯、修饰的或未修饰的聚醚砜、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚酰胺或再生纤维素。在特别优选的实施方案中，本发明的方法中使用的过滤器包含铜铵再生纤维素，优选铜铵再生纤维素中空纤维，更优选其中所述过滤器是 Planova?35 膜(Asahi KASEI ;www.planovafliters, com)。在另一优选的实施方案中，本发明的方法中使用的过滤器为Ultipor? VF级DV50病毒去除过滤器(Pall Corp.;www.pall.com)0
[0013]在本发明方法的实施方案中，使用两个或多个过滤器过滤所述样品。
[0014]在本发明的方法中，所述样品可在过滤步骤之前使用选自如下的方法进行预纯化:密度梯度、预过滤、色谱步骤(优选亲和色谱和/或离子交换色谱)，以及这些方法的结合。优选利用孔径为70-200nm的过滤器来实现预过滤。优选地，要对其实施本发明的方法的样品的PH为6-10，优选7-9，更优选7.5-8.5，最优选约8。在本发明的实施方案中，每Icm2的病毒过滤器表面可过滤l_200ml的样品,优选每Icm2过滤80_120ml。
[0015]本发明的方法优选导致洗脱至少85%的所述细小病毒，并使所述杆状病毒减少至少 51og,即 10*105。
[0016]定义
[0017]本文使用的术语“病毒”或“多种病毒”不仅包括天然存在的病毒或者已经被遗传操作改变的病毒即所谓的重组病毒，还包括病毒颗粒即感染性的和非感染性的病毒、病毒样颗粒(“VLP”)例如W096/11272中的乳头瘤病毒(papillomavirus)样颗粒，和含有核酸但也可以是空的的衣壳，以及其部分，具体是一个或多个优选若干个亚单位或壳粒，尤其是当若干个壳粒连接或结合使得它们组成所述衣壳的至少约50%、优选至少80%、尤其约90%时。具体地，从所述混合物除去的病毒具有基本上非球状的杆状结构，而作为所述药物产品的病毒基本上具有球状优选二十面体的形状。可进一步地理解，术语“病毒”可指该病毒的病毒体群，优选所述病毒的同种群。因此，术语“细小病毒”可指细小病毒体的群体，优选细小病毒体的同质群。因此，术语“细小病毒”可指细胞病毒病毒体的群，优选细小病毒的同质群。
[0018]细小病毒科的病毒是小DNA动物病毒。细小病毒科可被分为两个亚科:感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovir·inae)和感染昆虫的浓核病毒亚科(Densovirinae)。细小病毒亚科的成员在本文中被称为细小病毒并包括依赖病毒属。正如可从其属名所推断出的，依赖病毒的成员很独特之处在于它们通常需要与辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染以进行细胞培养中的生产性感染。
[0019]依赖病毒属包括通常感染人(如血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类(如血清型I和4)的腺伴随病毒(AAV)，和感染其他温血动物的相关病毒(例如，牛、狗、马和羊腺伴随病毒)。现在，可以区分在血清学上可区别的类型，所述类型至少包括AAV-l、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8 和 AAV-9。AAV 载体构成外面有直径为 18_26nm (通常约25nm)的二十面体结构蛋白外壳的单链DNA。关于细小病毒和细小病毒科的其他成员的更多信息在 Kenneth 1.Berns, Fields Virology (3d Ed.1996)第 69 章〃Parvoviridae: TheViruses and Their Replication, 〃中有描述。为方便起见,本文将参考AAV进一步例证和描述本发明。然而，应理解，本发明不限于AAV，而是可同样地应用于其他细小病毒。还应理解，本发明扩展到AAV嵌合病毒(含有嵌合的衣壳蛋白)和/或大小同样与野生型细小病毒大小相似(18_26nm的直径)的AAV杂交病毒(或假型病毒)。在W00028004中给出了描述和一些实例。AAV嵌合病毒和/或杂交病毒的实例为例如AAV2/1、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/5.2、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8 和 AAV2/9。
[0020]AAV基因组由编码所述病毒复制所需的蛋白的rep基因和编码所述病毒结构蛋白的cap基因组成。例如，当制备腺伴随载体时，一个或多个复制所需的rep基因(例如r印40、r印52、rep68和/或rep78)或衣壳结构所需的cap基因(例如VP-U VP-2和/或VP-3)在所述病毒中可用转基因代替。需要仍存在于5’和3’末端的ITR区域作为顺式作用元件，用于将所述转基因包装到感染性的重组AAV颗粒中，以及用于复制所述重组AAV基因组的 DNA (Kotin, R.M.(1994) Hum Gene Ther.5 (7): 793-801 )。本文中的“重组细小病毒或AAV载体”(或“rAAV载体”)是指包含一个或多个侧翼有细小病毒或AAV末端反向重复序列(ITR)的目的多核苷酸序列、目的基因或“转基因”的载体。当这种rAAV载体在表达AAVrep和cap基因产物(即AAV Rep和Cap蛋白)的昆虫宿主细胞中存在时，它们可以被复制并包装到感染性的病毒颗粒中。当rAAV载体被纳入到更大的核酸构建体(例如在染色体或另一用于克隆或转染的载体例如质粒或杆状病毒)中时，那么rAAV载体通常被称为“前载体(Pro-vector)”,其可在存在AAV包装功能和必要辅助功能的情况下通过复制和壳体化被“拯救”。
[0021]本文使用的“昆虫细胞”是指使重组细小病毒(rAAV)载体能够复制并且可在培养中维持的昆虫细胞。例如，使用的细胞系可来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、果蝇细胞系或蚊子细胞系，例如白纹伊蚊(Aedes albopictus)衍生细胞系。优选的昆虫细胞或细胞系是来自易被杆状病毒感染的昆虫物种的细胞，包括例如Se301、SeIZD2109、SeUCRl、Sf9、Sf900+、Sf21、BT1-TN-5Bl-4、MG-1、Tn368、HzAml、Ha2302、Hz2E5、High Five
(Invitrogen, CA, USA)和戲presSF+* (US6, 103, 526; Protein Sciences Corp., CT, USA)。
培养中昆虫细胞的生长条件和在培养中昆虫细胞中异源产物的产生在本领域是熟知的，并且在例如以下的关于昆虫细胞分子工程的参考文献中有所描述。在昆虫细胞中进行分子工程和表达多妝的方法在例如Summers and Smith.1986.A Manual of Methodsfor Baculovirus Vectors and Insect Culture Procedures, Texas AgriculturalExperimental Station Bull.N0.7555，College Station,Tex.；Luckow.1991.1n Prokopet al., Cloning and Expression of Heterologous Genes in Insect Cells withBaculovirus Vectors’Recombinant DNA Technology and Applications, 97-152 ；King, L.A.and R.D.Posseej 1992，The baculovirus expression system, Chapman andHall,United Kingdom;0’ Reilly, D.R.，L.K.Miller, V.A.Luckowj 1992，BaculovirusExpression Vectors: A Laboratory` Manual, New York;W.H.Freeman andRichardson, C.D.，1995，Baculovirus Expression Protocols, Methods in MolecularBiology, volume39;US 4, 745, 051; US2003148506 ;以及 W003/074714 中描述。
【具体实施方式】
[0022]可以使用基于杆状病毒的表达系统在昆虫细胞中产生重组rAAV，在所述表达系统中，用三种带有AAV载体以及rep和cap功能的重组杆状病毒感染所述昆虫细胞。当培养所述感染的昆虫细胞时，所述AAV非结构蛋白基因和所述AAV结构蛋白基因被表达，所述转基因DNA被复制，并且所述重组AAV颗粒(rAAV颗粒)被包装和组装。所述rAAV颗粒含有一种或多种在两个末端的侧翼有ITR区域的单链DNA形式的目的基因产物(转基因)。同时，所述重组杆状病毒在这些细胞中复制，该复制过程通常在几天后所述被感染的细胞裂解和死亡时结束。所得的病毒(杆状病毒和rAAV颗粒)或者部分地释放到细胞培养上清物中，不然就保留在所述裂解的细胞中。由于这一原因，通常使用本领域技术人员已知的细胞破碎方法将所述细胞破碎，例如交替冻融或借助于酶法水解(例如用胰蛋白酶)，目的是实现基本上完全释放所述病毒，或者通过洗涤剂裂解。
[0023]与使用基于病毒的表达系统例如基于杆状病毒的表达系统或使用辅助病毒系统制备病毒载体相关的明显缺点是形成产物病毒颗粒和非产物病毒的混合群，该混合群必须进行进一步的纯化。为方便起见，本文使用的词“辅助病毒”是指在AAV的产生中使用的“真正的”辅助病毒例如腺病毒或疱疹病毒，或者是指杆状病毒，即使尚不清楚所述杆状病毒是否确实提供辅助功能或只是在所述昆虫细胞中递送所述AAV基因。由于杆状病毒的潜在致病性或免疫原性，因此当在基因治疗中使用病毒载体时，应该避免有杆状病毒污染。
[0024]因此，本发明提供了一种分离/纯化的方法，所述方法适用于例如获得经监管部门批准的细小病毒产物，以工业规模应用所述方法在技术上和经济上是可行的，并且所述方法能够展示出包含杆状外形的病毒颗粒和基本为球形的病毒颗粒的病毒样品中的杆状病毒的减少(优选耗尽)，尤其是当所述杆状病毒颗粒与所述细小病毒颗粒具有相似的直径(即所述杆状病毒颗粒在两个维度上相似，但在第三个维度上不相似并且必须更大)时，使得能够降低所述辅助病毒的潜在致病性和/或免疫原性。本领域技术人员应理解，通过过滤技术使非产物病毒和产物病毒的混合物(两种病毒在两个维度上具有相似的大小)分离(优选高水平地分离)，是具有挑战性的并且是不太可能的。
[0025]因此，在第一个方面，本发明涉及一种将样品中的两种病毒体群分离的方法，优选其中一种病毒体群包含形状基本为球形的病毒体，另一种病毒体群包含形状为杆状的病毒体，所述方法包括将包含两种病毒体群的样品在只有所述形状基本为球形的病毒体能通过的过滤器上过滤的步骤。优选地，所述形状为杆状的病毒的纵横比为至少4:1。还优选所述形状为杆状的病毒的直径与所述基本球状的病毒的直径相差不多于12nm。优选所述基本为球形的病毒是细小病毒，所述形状为杆状的病毒是杆状病毒。特别地，本发明涉及一种用于将细小病毒病毒体群与杆状病毒病毒体群分尚的方法，其中所述方法包括将包含细小病毒病毒体群和杆状病毒病毒体群的样品在只有所述细小病毒病毒体能通过的过滤器上过滤的步骤。
·[0026]本文中使用的术语“分离”不暗示将待分离的两种颗粒从所述样品中回收。本文中使用的术语“分离”是指将杆状外形的病毒颗粒从所述样品中部分或完全除去，从而减少基本为球形的病毒颗粒的样品中杆状外形病毒的污染。因此，分离可理解为意指纯化所述样品中的基本为球形的病毒颗粒。在杆状病毒和细小病毒的情形中，可以说本文中使用的术语“分离”是指从所述样品部分或完全除去所述杆状病毒，从而减少包含细小病毒的样品中所述杆状病毒的污染。在该情形中，分离意指纯化所述样品中的细小病毒。
[0027]过滤是物理操作，其用于通过引入介质将例如固体与大小不同的固体或与流体分离，所述介质只有尺寸小于给定的尺寸限制的固体或只有流体能够通过。样品中过大的固体保留在进料中。流体，包括已经通过过滤器的固体，可被称为滤出物或渗透物。
[0028]应用于本发明的“病毒除去”方法是通过“过滤”来实施的，也被称为“病毒过滤”。“病毒过滤”应理解为借助于过滤器例如病毒过滤器或超滤器将药物产品与病毒污染物分离。应理解，所述药物产品本身也可为病毒，例如病毒(基因治疗)载体。
[0029]病毒过滤是其中使用纳米级额定孔径的膜的过滤技术。病毒过滤器和超滤器通常包含额定孔径的范围为30纳米-1微米或截留分子量(MWCO)范围为10000-750000道尔顿，优选范围为10000-500000道尔顿，更优选范围为10000-100000道尔顿的膜。过滤器的类
型分类取决于膜结构、材料和供应商。用途的类型也可确定所述分类。可以在正切流动过滤(TFF)型式(也称为交叉流过滤；在再循环过程中包含样品的进料流体与过滤器平行，并且只有一部分所述包含样品的进料流体用于渗透物产生，最大部分的所述进料流体会离开所述模块而不穿过所述过滤器)中使用超滤器，或者使用所述超滤器作为死端过滤器(deadend filter)(样品全部通过所述过滤器)。术语是本领域技术人员非常熟知的。
[0030]病毒过滤通常在膜上方使用压力差:跨膜压(跨膜压降)为0.02_0.8MPa、优选0.02-0.1MPa0压力差可由施加给样品的流速(即通过泵)产生。当在TFF型式中操作过滤器时，还可通过如下方法给样品加压:
[0031]在膜前通过压缩渗余物管线(line)或者在膜后(即在渗透物中)通过使用泵。这些操作可被本领域技术人员很容易地确定。
[0032]在本发明的一个优选的实施方案中，形状基本为球形的病毒体群是二十面体对称并且直径约为18-25nm的病毒体。因此,在本发明的一个优选的实施方案中，形状基本为球形的病毒体的群是细小病毒优选腺伴随病毒的群。
[0033]形状的“纵横比”是其较长的维与其较短的维的比值。因此，对于对称的物体，其可仅用2个测量值来描述，例如杆的长度和直径。作为替代或者与本发明的任何其他实施方案结合，在本发明的优选实施方案中，形状为杆状的病毒的纵横比为至少4: 1、优选至少5: 1、更优选至少6: 1、至少7: 1、至少8:1、至少9:1、至少10:1、至少11:1、至少12:1或约13:1。在使用本发明的方法分离的杆状外形的病毒体(例如杆状病毒)的群中，优选所述病毒体的直径为18-30nm，更优选20_27nm、更优选20_25nm、更优选20_23nm，长度为 70nm_300nm、优选 80nm-280nm、90nm-260nm、100nm_260`nm、120nm_260nm、140nm_260nm、160nm-260nm> 180nm-260nm>200nm-260nm>220nm-260nm>240nm-260nmo 更优选地，所述病毒体的直径为20-23nm，长度为180_280nm，尤其直径为约20nm，长度为约120_260nm。
[0034]本发明的杆状外形病毒体的群优选为属于杆状病毒科的病毒体群。杆状病毒科名称的提出是由于它们的病毒体是杆状的，该名称衍生自拉丁文baculum=手杖、拐杖、探杆。研究得最透彻的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾单核型多角体病毒(AcmNPV)，其形状不对称，直径为大约20至120-260nm(即，在两个维度上为约20nm，在第三个维度上为约120_260nm，或替代地并且更优选地表达为:直径为约20nm，长度为约120-260nm)。被分类为杆状病毒科的属的病毒为 α 杆状病毒(Alphabaculoviruses)、β 杆状病毒(Betabaculoviruses)、δ杆状病毒(Deltabaculoviruses)和Y杆状病毒(Gammabaculoviruses),它们的成员各自是鱗翅目昆虫 NPV (Lepidopteran NPV)、Ledidopteran GV、膜翅目昆虫 NPV (HymenopteranNPV)和双翅目昆虫NPV (Dipteran NPV)。因为一些杆状病毒已经被确定具有不同的基因组长度，这表明了，作为对在80kb-160kb之间变化的基因组长度的响应，衣壳长度可以是灵活的。可使用本发明的方法从如本文别处所定义的细小病毒病毒体群分离的杆状细菌的实例在表 I 中提供(基于 G.F.Rohrmann 的 Baculovirus Molecular Biology ;第二版；2011年 I 月 26 日；第 I章,Introduction to the baculoviruses and their taxonomy")。
[0035]表1.选择的杆状病毒的基因组大小和预测的ORF含量*
[0036]
【权利要求】
1.一种将细小病毒病毒体群从杆状病毒病毒体群分离的方法，其中所述方法包括在过滤器上过滤样品的步骤，所述样品包含细小病毒和杆状病毒病毒体的群，其中所述过滤器的额定孔径为30-70nm。
2.权利要求1的方法，其中所述细小病毒为腺伴随病毒。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)多衣壳核型多角体病毒(AcmNPV)
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述过滤器为病毒过滤器或超滤器。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述过滤器为表面式过滤器和/或深度式过滤器。
6.前述权利要求任一项的方法，其中所述过滤器包含选自如下的材料:铜铵再生纤维素、聚偏二氟乙烯、聚砜、聚四氟乙烯、聚丙烯、修饰的或未修饰的聚醚砜、乙酸纤维素、硝酸纤维素、硝酸纤维素、聚酰胺或再生纤维素。
7.前述权利要求任一项的方法，其中所述过滤器的额定孔径为30-40nm。
8.前述权利要求任一项的方法，其中所述过滤器的额定孔径为32-38nm。
9.权利要求6-8任一项的方法，其中所述过滤器包含铜铵再生纤维素，优选铜铵再生纤维素中空纤维，更优选其中所述过滤器是Planova35膜或Ultipor DV50过滤器。
10.前述权利要求任一项的方法，其中使用两个或多个过滤器过滤所述样品。·
11.前述权利要求任一项的方法，其中所述样品在过滤步骤之前使用选自如下的方法进行预纯化:密度梯度、预过滤、色谱步骤，优选亲和色谱和/或离子交换色谱，以及这些方法的结合。
12.权利要求11的方法，其中借助于孔径为70-200nm的过滤器实现预过滤。
13.前述权利要求任一项的方法，其中所述样品的pH为6-10，优选7-9，更优选7.5-8.5，最优选约8。
14.前述权利要求任一项的方法，其中每Icm2的病毒过滤器表面过滤l_200ml的样品，优选每Icm2过滤80_120ml。
15.前述权利要求任一项的方法，其中洗脱了至少85%的所述细小病毒并且所述杆状病毒的滴度减少了至少51og。
【文档编号】B01D61/00GK103857790SQ201280049899
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2011年9月8日
【发明者】W·T·J·M·C·赫尔门斯, J·P·史密斯 申请人:尤尼克尔Ip股份有限公司