用于清除类风湿因子的血液净化材料及其制备方法

用于清除类风湿因子的血液净化材料及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于清除类风湿因子的血液净化材料及制备方法，属于生物医学【技术领域】。该血液净化材料由固相载体和通过化学偶联固定在固相载体上的配基组成；其中，固相载体为多糖类天然高分子材料，配基为1-胺基-3-（2-（4-吡啶基）-乙基巯基）-2-丙醇，通过化学偶联固定在固相载体上的配基密度为1.4～2.8mmol/g干固相载体。该血液净化材料能够选择性吸附血液中的类风湿因子，对人血清白蛋白、IgG等其它血浆组分的非特异性吸附有限，而且制备成本低、物理化学性质稳定，可作为血液净化装置的吸附填料用于类风湿病人血液中类风湿因子的清除。
【专利说明】用于清除类风湿因子的血液净化材料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于清除类风湿因子的血液净化材料及其制备方法和应用，属于生物医学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]类风湿因子(Rheumatoid factors, RF)是一种IgM型抗变性IgG抗体，已被证实与一系列类风湿类疾病的产生和发展密切相关，如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。对于这些疾病，通过体外清除的方式降低病人血液中类风湿因子的浓度能够明显改善症状，对疾病起到缓解和治疗作用(B.C.McLeod, Introduction to theThird Special Issue:Clinical Applications of Therapeutic Apheresis.J ClinApheresis, 2000, 15 (1_2): 1_5)，所以用于清除类风湿因子的血液净化技术在临床中得到广泛重视。
[0003]血液净化技术是一种人工干预调节血液相关组分的治疗方法。自从上世纪80年代得到开发和应用以来，它已逐渐发展成为一种重要的临床治疗手段。患者的血液被引出体外，经过净化装置后输回体内，在这个过程中净化装置用于去除血液中的代谢废物、致病物质、多余的水份等，以纠正和调理机体内环境失衡，从而达到治疗疾病的目的。
[0004]应用于血液净化的吸附剂一般由两部分组成:作为吸附剂基质的高分子载体材料和利用化学交联固定在载体表面的配基分子。吸附剂基质一般采用亲水性好的多孔材料。良好的吸附剂基质还需要具备物理化学性质稳定、非特异性吸附小以及血液相容性好等特点。目前有多种不同类型的高分子材料可用作血液净化吸附剂的载体基质，包括多糖类天然高分子，如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖等；合成高分子材料，如聚丙烯酰胺、聚酰亚胺、聚乙烯醇等；无机材料，如二氧化硅、多孔玻璃珠等。配基分子通过共价键结合在载体材料上，其结构和性质决定了吸附剂的作用效果。目前用于抗体类分子吸附去除的吸附剂主要采用两种功能配基:生物型和小分子化合物型。
[0005]蛋白A吸附剂是一种典型的生物型血液净化吸附剂，它采用蛋白A作为吸附功能基。蛋白A是一种葡萄球菌细胞壁蛋白，全称葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal ProteinA, SPA)，为单链多肽，分子量4.2kDa。它对人类和其他哺乳动物的多种免疫球蛋白具有可逆的亲和作用，特别是对IgG的Fe区具有较强的结合能力。蛋白A对类风湿因子的结合主要基于其广谱结合免疫球蛋白的能力。目前，蛋白A作为一种典型的亲和配基已被用于临床中自身免疫性疾病患者体内自身抗体和免疫复合物的清除。Prosorba和Immunosorba(Fresenius, Germany)是两种目前应用最为广泛的蛋白A吸附剂,它们分别以娃胶和琼脂糖凝胶作为载体基质，其中Prosorba已获得了美国食品和药物管理局(FDA)的认证，用于治疗特发性血小板减少性紫癜和类风湿性关节炎。国内也有同类产品问世(CN1367181A)。对于这一类采用蛋白A作为配基的吸附剂，其优点在于利用生物分子间天然的亲和作用，对抗体类分子具有很高的选择性识别能力，能够实现对一大类自身抗体的清除作用，因此可广谱性地用于治疗一系列自身抗体相关的疾病。但其缺点在于蛋白A对IgM型抗体的结合能力要显著弱于对IgG型抗体的结合能力。蛋白A主要作用于IgG的Fe片段，但IgM的Fe片段集中在分子中心部位，暴露程度较低，结合蛋白A的空间位阻较大。因此，蛋白A对类风湿因子的去除效果要低于对其他IgG型自身抗体的去除效果，要想获得较理想的治疗效果，需要很高的治疗强度，这将造成大量正常IgG的损失。此外，作为具有生物活性的蛋白质分子，需要从金黄色葡萄球菌或基因工程菌中获得，其生产成本很高。目前Prosorba吸附柱的市场价约为1000欧元,而一对可切换使用的Immunosorba吸附柱市场价约为10000欧元。同时，蛋白质配基在固定化和保存过程中不稳定，易失活。虽然能够再生，重复使用，但也存在难以在线清洗灭菌的问题和配基分子脱落的隐患。以上这些缺点限制了蛋白A吸附剂在类风湿类疾病治疗中的临床使用。
[0006]除了蛋白A以外，也有报道采用热聚IgG作为吸附类风湿因子的亲和功能基。热聚IgG的应用主要基于IgM型类风湿因子具有结合变性IgG的生物活性，因此通过人工热变性的方式制备的热聚IgG固载于基质材料表面后，也具有选择性去除类风湿因子的能力。但是由于高昂的配基生产成本以及可能存在的安全隐患，此类型的吸附剂仅见于实验室研究，尚未实现工业化应用。
[0007]与生物大分子相比，化学合成的小分子化合物在生产成本和物理化学稳定性上都具有显著优势，所以很多研究也着眼于筛选和设计能够应用于血液净化的小分子配基。
[0008]疏水氨基酸是目前报道和应用最多的用于抗体吸附的小分子基团。日本Asahi医疗公司开发了两种分别以色氨酸和苯丙氨酸为配基的吸附剂材料，商品名分别为Immusorba TR(IM-TR)和Immusorba PH(IM-PH)。这两种吸附剂均以聚乙烯醇微球作为载体基质，色氨酸或苯丙氨酸分子通过氨基基团偶联在基质表面。这两种吸附剂的作用力特点主要基于芳香环和羧基基团，因此推断它们与抗体分子的相互作用综合了疏水作用和静电作用。吸附实验表明M-TR和M-PH对血浆中白蛋白和纤维蛋白原没有可观的非特异性吸附，但对抗-DNA抗体、抗AchR抗体以及抗Clq抗体等自身抗体具有普遍的去除效果，在日本被用于格林巴利综合症、系统性红斑狼疮、重症肌无力等自身免疫性疾病的治疗。中国专利文献CN1666784A中提供了一种利用组氨酸作为吸附基团的吸附剂材料。除此以外，亦有采用聚氨基酸作为吸附基团用在此领域的报道(中国专利文献CN1476908A)。在吸附剂的应用研究方面，也有少量研究证实了这类基于疏水氨基酸的吸附剂对类风湿因子也存在一定程度的吸附去除作用。例如，有人报道了采用苯丙氨酸作为配基偶联于聚乙烯醇微球基质，用于类风湿因子的吸附去除(王为超等，中国生物医学工程学报，2009，28 (4):561-566)。
[0009]此外，发明人所在团队也开发了两种小分子配基用于自身免疫性疾病患者体内自身抗体的吸附去除，包括苯甲酸(中国专利文献CN101185880A)和4-巯基乙基吡啶(J.Ren, et al., J Biomed Mater Res Part A, 2011:98A:589 - 595)。针对类风湿因子的吸附去除，虽然目前已有的小分子配基吸附剂在实验室评价条件下均表现出一定程度的结合能力，但是在进一步的模拟临床治疗的实验评价中效果往往并不理想。主要原因在于，以芳香族氨基酸和4-巯基乙基吡啶为代表的基于小分子配基的吸附剂均是针对IgG型抗体的分子结构特征开发和设计的广谱抗体吸附剂，而IgM型抗体在分子尺度和结构特点上与IgG型抗体具有显著差异:①IgM的分子量是IgG的六倍；②虽然两者具有部分相同的保守序列，但是在分子结构特征上仍存在较大差异。因此针对IgG设计的吸附剂对以IgM为主的类风湿因子并不合适。以4-巯基乙基吡啶为例，虽然我们发现该分子对人血液中多种抗体组分均具有不同程度的吸附能力，但它与非IgG型抗体(如IgM、IgA和IgE)及其复合物的结合能力远不及对IgG的吸附效果。如果用于IgM型类风湿因子的吸附治疗，将面对与蛋白A类似的问题，即类风湿因子吸附能力较弱，如果通过加大治疗强度来提高类风湿因子的去除率，必将导致大量正常IgG的损失，带来免疫功能弱化的风险(J.Ren, et al.，JBiomed Mater Res Part A, 2011:98A:589 - 595)。
[0010]从本质上讲，4-巯基乙基吡啶作为专门针对IgG型抗体开发的吸附功能基，它与IgG的作用位点主要集中在IgG的Fe片段，其中疏水作用和π-π共轭发挥了重要作用。对于Fe片段被包裹在分子内部的IgM，4-巯基乙基吡啶的作用能力很难有效体现出来。因此要提高对IgM类抗体的吸附选择性，实现对类风湿因子的选择性吸附去除就需要专门针对IgM的分子结构特征进行配基分子的全新设计和结构优化，使其在空间结构和作用力上更适合IgM。

【发明内容】

[0011]本发明的目的在于提供一种用于清除类风湿因子的血液净化材料及其制备方法。该血液净化材料应对人血液中的类风湿因子具有较好的选择性和较高的吸附容量，并具有稳定的物理化学性质和相对低廉的生产成本。
[0012]本发明的发明人针对IgM的结构特征进行了配基分子设计，通过计算机分子对接结合实验筛选，最终确定了一个全新的长链多官能团化合物:1_胺基-3- (2- (4-吡啶基)-乙基疏基)-2-丙醇(1-amino-3- (2- (pyridin-4-yl) ethylthio) propan-2-ol)作为IgM的选择性结合配基。1-胺基-3- (2- (4-吡啶基)-乙基巯基)-2-丙醇分子与现有技术中使用的配基(苯甲酸、芳香族氣基酸、4_疏基乙基吡唳)相比，在疏水杂环基团的基础上引入了多个富电子基团(羟基、胺基)。分子对接结果显示，其与IgM型抗体的结合能力要显著高于IgG型抗体；而作用位点分析表明，这些富电子基团更倾向于结合IgM的Fab片段，在IgM的外表面具有更多有效结合位点。由于IgM分子大小约为IgG的6倍，多个Fab片段暴露于分子表面，强化配基分子与Fab的结合将会显著增强配基与IgM以及类风湿因子的作用能力。同时，IgM具有更大的表面积，与吸附IgG分子相比，实现对IgM以及类风湿因子有效吸附所需要的配基密度会更低。通过合理控制偶联基团密度，便可实现吸附剂对IgM和IgG的区分。基于以上两方面的因素，在优选配基的基础上通过进一步优化配基固载反应条件，确定了一个适用于选择性清除人血液中类风湿因子的吸附材料合成方案。
[0013]上述配基分子1-胺基-3- (2- (4-吡啶基)-乙基巯基)-2-丙醇的结构式如下
所示:
[0014]
【权利要求】
1.一种用于清除类风湿因子的血液净化材料，其特征在于，该血液净化材料由固相载体和通过化学偶联固定在固相载体上的配基两部分组成；固相载体为交联多糖，配基为1_胺基_3_ (2- (4-卩比唳基)-乙基疏基)_2_丙醇,通过化学偶联固定在固相载体上,配基密度为1.4?2.8mmol/g干固相载体。
2.根据权利要求1所述的血液净化材料，其特征在于，所述固相载体采用多孔微球的形式，其胶孔透过分子量为150000?5000000Da。
3.一种权利要求1或2所述的血液净化材料的制备方法，其特征在于: (O活化固相载体:用羰基二咪唑活化，其加入量为0.9?1.5g/10mL湿固相载体，反应在丙酮中进行，15?30°C反应I?2h，产物用丙酮洗涤； (2)偶联配基:向含有等体积羰基二咪唑活化的固相载体和丙酮的混悬液中添加5-10倍体积的1-胺基-3- (2- (4-吡啶基)_乙基巯基)-2-丙醇，20-35°C反应2_3h，然后分别用丙酮、0.1M HCl溶液、0.1M NaOH溶液、去离子水清洗； (3)后处理:使用pHIO?13的NaOH溶液，对步骤(2)得到的偶联了配基的固相载体进行处理，水解固相载体上未与配基反应的源自羰基二咪唑的活性基团。
4.一种权利要求1或2所述的血液净化材料的应用，其特征在于，所述的血液净化材料作为血液净化装置的吸附填料用于类风湿病人血液中类风湿因子及其它IgM型自身抗体和循环免疫复合物的清除。
【文档编号】B01J20/24GK103933947SQ201410143222
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】贾凌云, 任军 申请人:大连理工大学