一种核孔蛋白接枝均孔聚碳酸酯仿生蛋白传输膜及其制备方法与流程

本发明涉及生物分离领域，具体地说是一种核孔蛋白接枝均孔聚碳酸酯仿生蛋白传输膜及其制备方法。

背景技术：

蛋白质药物是在蛋白质水平对疾病进行诊断、预防和治疗，广义的蛋白质药物包括所有化学本质为蛋白质或多肽的产品，如激素、生长因子/细胞因子、蛋白酶、受体分子、单克隆抗体及抗体相关分子、部分蛋白或多肽疫苗等。与以往小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成功率高、安全可靠，已成为医药产品中重要组成部分。然而，天然存在的蛋白质，或者通过发酵、培养或合成的蛋白质，在初始阶段总是由多种成分组成，须经分离和纯化后才能在医药、食品等领域中应用。因此，蛋白质的高效率和选择性分离研究具有重要的理论意义和实际应用价值，成为现代药物分析、生命科学、生物工程及至化学工程研究的热点。

目前用于蛋白质分离的手段主要是色谱，包括凝胶色谱、离子交换色谱、高效液相色谱等。然而这些技术所需的设备昂贵且处理量小，难以实现工业化生产应用。近年来，亲和色谱以其良好的分离性能被广泛应用于蛋白、核酸，多肽等生物大分子的分离纯化，该方法基于配基与目标生物分子间的相互识别作用，如抗体与抗原、糖与凝集素、酶与底物等，来达到分离目的，是目前大分子分离机制中最有效的手段之一，然而其操作易受传质限制、处理量少、同酸酯膜浸泡于1，6-己二异氰酸酯溶液中，在60℃下反应10min使表面端羟基转变为异氰酸酯-nco基团；(3)配置质量分数为5％的对苯二胺的乙腈溶液，将表面经二异氰酸酯处理的膜浸泡于对苯二胺溶液中，在60℃下反应10min使膜表面胺基化；(4)将双功能蛋白交联剂4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(smpb)溶解于ph值为7.4的磷酸缓冲盐溶液中，smpb的浓度为2mmol/l，然后把表面带有活性胺基的聚碳酸酯膜置于smpb溶液中于室温下反应15min，即得马来酰亚胺功能化的聚碳酸酯膜；(5)将核孔蛋白(nsp1)储备液溶解于ph为7.4的pbs缓冲溶液中，nsp1的浓度为0.2mg/ml，然后将马来酰亚胺功能化的聚碳酸酯膜浸泡于nsp1溶液中反应20min，即得核孔蛋白接枝均孔聚碳酸酯仿生膜。

将核孔蛋白修饰聚碳酸酯膜固定于如图1所示的扩散池中间并将左右两室隔离，右室放入待分离蛋白(核浆转运蛋白kaps95或牛血清蛋白bsa)样品溶液(原液，蛋白浓度为0.5mg/ml)，左室放入缓冲溶液，两室体积均为5ml。根据浓差原理，蛋白质将透过膜从右室向左室扩散。为了扩大两室的浓度差，将左室通过管道外接一个体积较大的稀释池(1000ml)，以增大浓差驱动力，使蛋白质能更快速的向左室扩散。在不同实验时刻分别从左右两室取样，并用酶标仪测试蛋白质浓度。扩散24h后，左室kaps95的浓度从0mg/ml提高到0.22mg/ml，而相同条件下bsa几乎不向左室扩散。结果表明该核孔蛋白接枝均孔聚碳酸酯仿生膜对kaps95蛋白具有选择性，有望应用于蛋白质的选择性分离。

实施例2

(1)采用过硫酸钾氧化聚碳酸酯均孔膜，将过硫酸钾配成质量浓度为20％的水溶液，将聚碳酸酯均孔膜浸泡于过硫酸钾溶液中于80℃下反应5h，即得表面羟基化的聚碳酸酯膜；(2)配置质量分数为5％的甲苯2，6-二异氰酸酯的乙腈溶液，将表面羟基化的聚碳酸酯膜浸泡于甲苯2，6-二异氰酸酯溶液中，在60℃下反应10min使表面端羟基转变为异氰酸酯-nco基团；(3)配置质量分数为5％的间苯二胺的乙腈溶液，将表面经二异氰酸酯处理的膜浸泡于间苯二胺溶液中，在60℃下反应10min使膜表面胺基化；(4)将双功能蛋白交联剂4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(smpb)溶解于ph值为7.4的磷酸缓冲盐溶液中，smpb的浓度为2mmol/l，然后把表面带有活性胺基的聚碳酸酯膜置于smpb溶液中于室温下反应15min，即得马来酰亚胺功能化的聚碳酸酯膜；(5)将核孔蛋白(nsp1)储备液溶解于ph为7.4的pbs缓冲溶液中，nsp1的浓度为0.2mg/ml，然后将马来酰亚胺功能化的聚碳酸酯膜浸泡于nsp1溶液中反应20min，即得核孔蛋白接枝均孔聚碳酸酯仿生膜。

将核孔蛋白修饰聚碳酸酯膜固定于如图1所示的扩散池中间并将左右两室隔离，右室放入待分离蛋白(核浆转运蛋白kaps95或牛血清蛋白bsa)样品溶液(原液，蛋白浓度为0.5mg/ml)，左室放入缓冲溶液，两室体积均为5ml。根据浓差原理，蛋白质将透过膜从右室向左室扩散。为了扩大两室的浓度差，将左室通过管道外接一个体积较大的稀释池(1000ml)，以增大浓差驱动力，使蛋白质能更快速的向左室扩散。在不同实验时刻分别从左右两室取样，并用酶标仪测试蛋白质浓度。扩散24h后，左室kaps95的浓度从0mg/ml提高到0.18mg/ml，而相同条件下bsa几乎不向左室扩散。结果表明该核孔蛋白接枝均孔聚碳酸酯仿生膜对kaps95蛋白具有选择性，有望应用于蛋白质的选择性分离。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种核孔蛋白接枝均孔聚碳酸酯仿生蛋白传输膜及其制备方法。该方法包括以下步骤：(1)采用等离子体辐照或过硫化物氧化使聚碳酸酯均孔膜表面羟基化；(2)表面羟基化的聚碳酸酯膜与二异氰酸酯反应使表面端羟基转变为异氰酸酯(‑NCO)基团；(3)经二异氰酸酯处理的膜再与二胺反应，使膜表面胺基化；(4)表面胺基化的膜与双功能蛋白交联剂4‑(p‑马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯反应使膜表面具有高活性马来酰亚胺；(5)核孔蛋白(NSP1)末端的巯基(SH)与膜表面的马来酰亚胺键合将核孔蛋白接枝到聚碳酸酯均孔膜表面，制得核孔蛋白接枝均孔聚碳酸酯仿生膜，该仿生膜可用于选择性传输蛋白质。

技术研发人员：王明霞;严峰;曹越超;李晓丹;宋健;王文昭
受保护的技术使用者：天津工业大学
技术研发日：2018.12.10
技术公布日：2019.03.01