1.本发明涉及分离基质，并且更具体地，涉及具有多峰配体的吸附性膜基质。
背景技术：
2.生物技术市场是世界制药市场中增长最快的部分，占2012年所有市场销售的20% ($153 bn)。从2002年10%的市场份额的增长被设定为在2012年至2018年之间从$153 bn至$215 bn增长41%。目前市场上有约200种单克隆抗体(mab)产品，并且超过1000种在临床试验中，对该领域技术进步的需求是明显的。在过去的几十年中，工业环境中生物分子的典型发酵效价从0.5 g/l至约3 g/l增长，基于分子生物学的活跃的进步，相信在不久的将来可实现高达10 g/l的水平。然而，尽管下游纯化方法也已经接受了一些研究和开发，但该领域的改进与上游的那些不匹配。
3.治疗性蛋白质的制造需要在加工期间实现高纯度，使得给予的蛋白质基本上没有有害污染物。目前，在工业规模上，色谱法是用于实现高纯度蛋白质的主要方法。从经济角度来看，严重依赖色谱法单元操作是生物分子(例如mab)下游加工进展的关键。色谱法占生物治疗加工的高达60% (re-use of protein a resin：fouling and economics, 2015年3月1日 biopharm international, 第28卷, 第3期, anurag s. rathore, mili pathak, guijun ma, daniel g. bracewell)。
4.这样的色谱分离包括当含有目标分子和杂质的液相与固相接触时，i)目标分子和/或ii)一种或多种杂质与固相结合。目标分子/杂质与固相之间的相互作用可以基于电荷、疏水性、亲和力或其组合。
5.历史上，使用多孔珠的常规填充床色谱法是极其有力的分离工具。这些珠的多孔性质产生用于结合目标或杂质的高表面积。这导致高容量材料，意味着可以使用更少量的吸附剂材料。高容量还增加分离期间实现的浓缩作用，因为与负载悬浮液的相对浓度相比，每单位体积的吸附剂可能结合了更多的目标。这些方面对于工业规模加工是关键的，其中每批需要从可以达到高达20,000 l的液体体积中纯化数千克的材料。多孔珠的典型结合容量在35-120 mg/ml的区域内，这取决于固相的功能性和结合的物质。
6.在基于多孔珠的系统中，目标分子/杂质与固相之间的结合事件取决于到多孔珠中的扩散。因此，在基于多孔珠的系统中停留时间与流速之间存在强相关性。因此，结合容量随着停留时间的减少而下降。这进而伴随着容量的快速降低，其中在基于多孔珠的系统中使用小于2分钟的时间。短停留时间所需的高流速也可能与多孔珠不相容，特别是在其中将许多升珠悬浮液填充到柱中的制造规模下。这里，多孔珠的机械不稳定性会导致压缩或坍塌事件，这进而导致不均匀的柱床。
7.由于流速影响停留时间，关键是使每单位时间可以结合到固相的目标的量最大化。这允许使用较小的吸附剂体积和/或在较短时间内进行分离。该度量可以定义为每单位体积每单位时间结合的克数(mg/ml/min)。以上讨论的多孔珠的典型结合容量和停留时间导致单柱多孔珠系统的总生产能力为约10-120 mg/ml/min。
8.作为基于多孔珠的系统的替代物，可以使用整体料或膜。通过这样的材料的流动是对流的而不是扩散的，并因此它们的结合容量远不如基于多孔珠的系统对流动敏感。这些材料可以在比基于多孔珠的材料高得多的流速下运行，其中典型停留时间在0.2-0.5分钟量级。然而，在动态流动下，对于整体料(10-20 mg/ml)和膜(7.5-29 mg/ml)在目标10%穿透时的典型结合容量低于多孔珠(gottschalk, u. (2008). biotechnol prog, 24(3), 496-503)。通过利用较高的流速，可以在一定程度上弥补整体料和膜材料的较差的结合容量(与基于多孔珠的材料相比)。
9.以上讨论的整体料和膜的典型结合容量和停留时间导致整体料和膜系统的结合事件的总生产能力为约10-145 mg/ml/min。
10.需要色谱法材料，其具有与基于多孔珠的材料相关的高结合容量和用整体料/膜材料可实现的更高的流速。这样的材料将在高流速下提供高容量以实现最大生产能力(mg/ml/min)。
技术实现要素：
11.本发明的一个方面是提供分离基质，所述分离基质提供具有高选择性的快速生物大分子分离。这使用具有共价偶联到支撑物的多个多峰配体的基质实现，其中所述支撑物是包含非织造聚合物纤维的膜，并且其中所述配体能够与目标生物大分子相互作用。
12.本发明的第二方面是提供具有高选择性的快速流通分离方法。这使用从包括一种或多种杂质的负载流体回收纯化的生物大分子的方法实现，其包括以下步骤：a)使所述负载流体通过如上所讨论的分离基质；和b)在所述负载循环期间并任选地在任何基本上等度洗涤期间回收所述基质流出物中的所述纯化的生物大分子。
13.本发明的第三方面是提供具有高选择性的快速结合-洗脱分离方法。这使用从包括一种或多种杂质的负载流体回收纯化的生物大分子的方法实现，其包括以下步骤：a)使所述负载流体通过如上所讨论的分离基质；b)任选地使洗涤流体通过所述分离基质；c)使洗脱液通过所述分离基质；d)在通过所述分离基质之后回收所述洗脱液中的所述纯化的生物大分子；和e)使再生流体通过所述分离基质。
14.本发明的其它合适的实施方案在从属权利要求中描述。
附图说明
15.图1显示本发明的色谱法介质的示意图。
16.图2显示本发明的色谱法介质的示意图。
17.定义术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用，并且被理解为还包括抗体的片段、包含抗体或抗体片段的融合蛋白和包含抗体或抗体片段的缀合物。
18.术语“fc结合多肽”和“fc结合蛋白”分别指能够结合抗体的可结晶部分(fc)的多肽或蛋白，并且包括例如蛋白a和蛋白g，或保持所述结合性质的其任何片段或融合蛋白。
19.术语“间隔基”在本文中是指将配体连接到支撑物的元件。
20.如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有”、“具有”等可以具有美国专利法中归于它们的含义，并且可以指“包括(includes)”、“包括(including)”等；“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”或“基本上由
……
组成(consists essentially)”同样具有美国专利法中归于其的含义，并且所述术语是开放式的，允许存在多于所列举的那些，只要所列举的那些的基本或新颖特征不会因存在多于所列举的那些而改变，但排除现有技术实施方案。
具体实施方式
21.在一个方面，本发明公开了分离基质，其包含共价偶联到支撑物的多个多峰配体。支撑物是包含非织造聚合物纤维的膜，其可以适当地是聚合物纳米纤维，例如纤维素纳米纤维，并且多峰配体能够与目标生物大分子(例如蛋白质、蛋白质缀合物、核酸、病毒颗粒或病毒样颗粒)相互作用。关于支撑物和(纳米)纤维的进一步细节参见下文。配体是共价结合到支撑物的化学部分，直接结合到纤维表面上，或者结合到接枝在纤维表面上的聚合物，如下讨论的。配体可以进一步经由间隔基共价结合到纤维表面或接枝的聚合物。间隔基在分离基质领域是公知的，并且通常可以是具有一个或多个碳原子(例如1-10个碳原子)的有机基团，其将配体连接到纤维表面或聚合物。配体是多峰的，这意味着它们能够经由至少两种类型的相互作用与目标生物大分子相互作用，导致比单一类型的相互作用可以实现的选择性更高程度的选择性。因此，配体可以具有至少两个以下不同的官能度：正电荷、负电荷、疏水基团、能发生π-π相互作用或阳离子-π相互作用的芳族基团、氢键供体、氢键受体、电子供体和电子受体。优选的组合包括正电荷+疏水基团、正电荷+芳族基团、负电荷+疏水基团、负电荷+芳族基团和负电荷+电子供体。配体的量可以是合适的，使得分离基质的配体密度为100-2000
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mol配体/g干燥的分离基质。这提供了与高选择性组合的对目标生物分子的高结合容量。
22.配体在一些实施方案中，多峰配体包含多峰阴离子交换配体，即，具有正电荷和疏水基团和/或芳族基团的配体。多峰阴离子交换配体可以是例如包含具有以下结构的配体r
1-l
1-n(r3)-l
2-r2，其经由氮偶联到支撑物，使得偶联后的叔胺氮是季铵基团，其中：r1是五元或六元的取代或未取代的芳族或脂族环结构、羟乙基或c
1-c4烷基；l1是亚甲基或共价键；r2是五元或六元的取代或未取代的芳族或脂族环结构；l2是亚甲基或共价键；r3是甲基。
23.配体可以特别包含经由氮偶联到支撑物的n-苄基-n-甲基乙醇胺配体，其中在这种情况下，r1是羟乙基，l1是共价键，r3是甲基，l2是亚甲基，并且r2是未取代的苯环。或者，配体可以包含a) n,n-二甲基苄基胺(r1为甲基，l1为共价键，r3为甲基，l2为亚甲基，并且r2为未取代的苯环)，b) 2-(n-(环己基甲基)-n-甲基氨基)乙醇(r1为羟乙基，l1为共价键，r3为甲基，l2为亚甲基，并且r2为未取代的环己基环)，c) 2-(n-(4-(三氟甲基)苄基)-n-甲基氨
基)乙醇(r1为羟乙基，l1为共价键，r3为甲基，l2为亚甲基，并且r2为对-三氟甲基苯基)，d) 2-(n-(3,4,5-(三甲氧基)苄基)-n-甲基氨基)乙醇(r1为羟乙基，l1为共价键，r3为甲基，l2为亚甲基，并且r2为三甲氧基苯基)或e) n-苄基-n-甲基(噻吩-2-基)甲胺(r1为噻吩环，l1为亚甲基，r3为甲基，l2为亚甲基，并且r2为未取代的苯环)。还参见us20150299248，其通过引用以其整体并入本文。
24.或者，多峰阴离子交换配体可以包含具有以下结构的配体n(r6,r7)-r
8-l
3-ar其经由氮n偶联到支撑物，其中：r6和r7独立地为氢、1-6碳烷基或羟乙基；r8是1-6碳烷基或环烷基或乙氧基；l3是共价键、nr9、o或s，其中r9是1-6碳烷基；ar是取代或未取代的芳族或杂芳族环。
25.这样的配体的实例是例如n-苯基-乙二胺、2-苯氧基乙胺、n,n-二甲基-2-苯氧基-乙-1-胺、n,n-二甲基-3-苯氧基-丙-1-胺、n,n-二甲基-2-(2-苯氧基乙氧基)乙-1-胺、2-(甲基(2-苯氧基乙基)氨基)乙-1-醇、2-(3,5-二甲基苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、2-([1,1
’‑
联苯]-4-基氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、n,n-二甲基-2-(对-甲苯氧基)乙-1-胺、2-(4-乙基苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、2-(4-异丙基苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、2-(4-氟苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、2-(2,5-二氟苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、2-(3-氟苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、2-(3,5-二氟苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、2-(3,5-二氟苯氧基)-n,n-二甲基丙-1-胺、2-(3,4-二氟苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、2-(3,4,5-三氟苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、2-(4-(叔丁基)苯氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、n,n-二甲基-2-(萘-1-基氧基)乙-1-胺、n,n-二甲基-2-(全氟苯氧基)乙-1-胺、n,n-二甲基-2-(吡啶-4-基氧基)乙-1-胺、n,n-二甲基-2-(吡啶-3-基氧基)乙-1-胺、2-((2,6-二甲基吡啶-4-基)氧基)-n,n-二甲基乙-1-胺、n,n-二甲基-3-(吡啶-4-基氧基)丙-1-胺、n,n-二甲基-3-苯氧基环丁-1-胺、n,n-二甲基-3-苯氧基环戊-1-胺和n,n-二甲基-3-苯氧基环己-1-胺。还参见wo2019173731和us9669402，其通过引用以其整体并入本文。
[0026]
在某些实施方案中，多峰配体包含多峰阳离子交换配体，即，具有负电荷和疏水基团和/或芳族基团的配体。多峰阳离子交换配体可以例如包含具有以下结构的配体s-r4(cooh)-n(h)-c(o)-r5其经由硫偶联到支撑物，其中：r4是c
2-c6亚烷基；和r5是五元或六元的取代或未取代的芳族或脂族环结构。
[0027]
配体可以特别包含具有以下结构的配体其经由硫偶联到支撑物。
[0028]
或者，多峰阳离子交换配体可以包含共聚物链，所述共聚物链包含衍生自以下的
单元a)结构ch2═
ch-l
4-x1的第一单体，其中l4是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链，和x1是磺酸酯或膦酸酯基团，和b)第二不带电荷的乙烯基酰胺单体。
[0029]
共聚物链可以是例如乙烯基磺酸酯-共-n-乙烯基吡咯烷酮共聚物链，其中l4是共价键，x1是磺酸酯，并且乙烯基酰胺是n-乙烯基吡咯烷酮。或者，共聚物链可以是乙烯基膦酸酯-共-n-乙烯基吡咯烷酮共聚物链(x1是膦酸酯)或乙烯基磺酸酯-共-n-乙烯基己内酰胺链(乙烯基酰胺是n-乙烯基己内酰胺)。
[0030]
或者，多峰阳离子交换配体可以包含具有以下结构的配体nh-ph-(ch2)
n-x
2-(ch2)
n-coo-其经由氮n偶联到支撑物，其中：ph是苯环，其中nh基在邻位、间位或对位；n为0、1或2；m为1、2、3、4或5；x2选自共价键、s、c(o)nh、nhc(o)、c(o)nhch2c(o)nh和so2。
[0031]
这样的配体的实例是例如p-nh-ph-ch2c(o)nhch2coo-、p-nh-ph-c(o)nhch2c(o)nhch2coo-、o-nh-ph-c(o)nhch2coo-、p-nh-ph-ch2sch2coo-、o-nh-ph-ch2sch2coo-、p-nh-ph-ch2so2ch2coo-、p-nh-ph-ch2coo-和p-nh-ph-(ch2)3coo-。还参见us2015258539，其通过引用以其整体并入本文。
[0032]
此外，多峰阳离子交换配体可以包含具有以下结构的配体r9ch(nh2)cooh其经由氮n偶联到支撑物，其中：r9是芳族基团或c
5-c7非离子脂族基团。
[0033]
这样的配体的实例是例如苯基丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和正亮氨酸。还参见us8530698，其通过引用以其整体并入本文。
[0034]
在一些实施方案中，多峰配体包含金属螯合配体，即，具有至少两种类型的与金属离子形成配位键的基团(例如电子供体基团(例如叔胺)和带负电荷的基团(例如羧酸酯基团))的配体。金属螯合配体可以特别包含具有至少三个羧基和至少一个叔胺(例如至少两个叔胺)的配体。这样的配体的一个实例是具有以下结构的配体其经由酰胺氮偶联到支撑物。另一个实例是具有以下结构的配体其经由硫偶联到支撑物。
[0035]
又进一步的实例包括具有以下结构的配体：经由末端氮偶联到支撑物的nh2(ch2)4ch(cooh)n(ch2cooh)2和经由仲胺氮偶联到支撑物的hoocch2nhch2ch2cn(ch2cooh)2。
[0036]
具有金属螯合配体的分离基质可以进一步包含过渡金属离子，例如结合到配体的ni
2+
离子、co
2+
或cu
2+
离子。这些离子可以结合蛋白质，特别是具有多聚组氨酸标签的蛋白质，用于从复杂混合物中选择性分离这些蛋白质。
[0037]
聚合物纳米纤维本发明的分离基质由聚合物纤维/纳米纤维支撑物形成。每个支撑物由一种或多种聚合物纤维/纳米纤维形成。
[0038]
聚合物纤维/纳米纤维通常是静电纺丝聚合物纳米纤维。这样的静电纺丝聚合物纳米纤维是本领域技术人员公知的，并且例如可以在o. hardick等人, j.mater. sci. 46 (2011) 3890中找到它们的最佳生产条件，其全部内容通过引用并入本文。本发明的方法通常包括静电纺丝聚合物以生产一种或多种聚合物纳米纤维的初始步骤。这可以包括静电纺丝聚合物以生产一个或多个非织造片材或层，每个包含一种或多种聚合物纳米纤维。适当地，一个或多个片材或一个或多个层(10)各自包含多个纳米纤维-纳米纤维融合点(20)，如在图1中说明的。在其连接处的单个纳米纤维(30)之间的层内融合点为片材/层提供机械稳定性，并降低使用期间纳米纤维脱落到液体中的风险。通过控制在静电纺丝过程期间的温度，使得沉积的纳米纤维在凝固之前彼此接触，可以适当地实现融合点。可能特别有利的是，对聚合物溶液进行静电纺丝，在这种情况下，形成的纤维通过溶剂的蒸发而凝固，在凝固之前提供足够的时间用于形成层内融合点。
[0039]
用于本发明的聚合物纤维/纳米纤维通常平均直径为10 nm至1000 nm。对于一些应用，平均直径为200 nm至800 nm的聚合物纳米纤维是合适的。平均直径为200 nm至400 nm的聚合物纤维/纳米纤维可以适用于某些应用。用于本发明中聚合物纤维/纳米纤维的长度没有特别限制。因此，常规的静电纺丝方法可以生产长度为数百米或甚至数千米的聚合物纳米纤维。然而，通常，一种或多种聚合物纤维/纳米纤维的长度为至多10 km，优选10m至10 km。聚合物纤维/纳米纤维可以合适地是单丝纳米纤维，并且可以例如具有圆形、椭圆形或基本上圆形/椭圆形的横截面。
[0040]
一种或多种聚合物纤维/纳米纤维以一个或多个非织造片材的形式提供，每个非织造片材包含一种或多种聚合物纤维/纳米纤维。因此，支撑物通常由一个或多个非织造片材形成，每个片材包含一种或多种聚合物纤维/纳米纤维。包含一种或多种聚合物纤维/纳米纤维的非织造片材是一种或多种聚合物纳米纤维的垫，其中每种纳米纤维基本上随机地取向，即，它没有被制造成使得一种或多种纳米纤维采用特定的图案。包含聚合物纤维/纳米纤维的非织造片材通常通过已知的方法提供，例如在o. hardick等人, j.mater. sci. 46 (2011) 3890中公开的方法。在某些情况下，非织造片材可以由单一聚合物纳米纤维组成。或者，非织造片材可以包含两种或更多种聚合物纳米纤维，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10种聚合物纳米纤维。
[0041]
非织造片材通常面密度为1-40 g/m2，优选5-25 g/m2，在一些情况下1-20或5-15 g/m2。
[0042]
非织造片材通常厚度为5-120
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m，优选10-100
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m，在一些情况下50-90
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m，在其它情况下5-40、10-30或15-25
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m。
[0043]
用于生产在本发明的方法中所用的纤维/纳米纤维的聚合物没有特别的限制，只
要该聚合物适用于色谱法应用即可以。因此，通常，聚合物是适合在色谱法方法中用作色谱法介质(即，吸附剂)的聚合物。合适的聚合物包括聚酰胺(例如尼龙)、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚砜(例如聚醚砜(pes))、聚己内酯、胶原、壳聚糖、聚环氧乙烷、琼脂糖、琼脂糖乙酸酯、纤维素、乙酸纤维素及其组合。优选聚醚砜(pes)、纤维素、乙酸纤维素及其组合。在一些情况下，优选纤维素、乙酸纤维素及其组合。
[0044]
在一些实施方案中，基材包含由不同的聚合物形成的一种或多种纤维/纳米纤维。因此，在该实施方案中，基材包含一种或多种不同的聚合物。典型的聚合物如上所定义。
[0045]
通常，本发明涉及由一种或多种乙酸纤维素纤维/纳米纤维形成的支撑物制备的官能化的纤维素分离基质。优选地，所述制备包括提供由一个或多个非织造片材或层形成的基材，每个片材或层包含一种或多种乙酸纤维素纳米纤维。乙酸纤维素易于静电纺丝，通常从乙酸纤维素在一种或多种有机溶剂中的溶液静电纺丝，并且在静电纺丝后可以容易地转化成纤维素。因此，优选地，支撑物由一个或多个非织造片材/层形成，每个片材/层包含一种或多种静电纺丝乙酸纤维素纳米纤维。
[0046]
纤维/纳米纤维的物理改性在本发明的某些优选的实施方案中，提供基材包括在接枝步骤之前，任选地在非织造片材/层中对聚合物纳米纤维进行物理改性。具体地，物理改性可以包括加热和/或压制聚合物纳米纤维/非织造片材/层，优选加热和压制聚合物纳米纤维/非织造片材/层。这些步骤改进材料的结构稳定性。也可以改变压制和加热条件，以改变所得材料的厚度和/或孔隙率。
[0047]
使用聚合物纳米纤维的多个非织造片材能够制备较厚的材料，其具有更大的吸附容量(一旦接枝和官能化)。因此，提供支撑物通常包括提供两个或更多个非织造片材/层，所述片材/层一个在另一个的顶部上堆叠，每个所述片材包含一种或多种聚合物纳米纤维，并且同时加热和压制片材/层的堆叠以融合相邻片材/层的纳米纤维之间的接触点，产生层间融合点。在纤维素分离基质的情况下，提供支撑物通常包括提供两个或更多个非织造片材/层，所述片材/层一个在另一个的顶部上堆叠或折叠，每个所述片材/层包含一种或多种乙酸纤维素纳米纤维，并且同时加热和压制片材/层的堆叠以融合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。因此，官能化的分离基质可以是多个非织造聚合物纳米纤维层的堆叠，其具有使至少两个层彼此键合的多个层间纳米纤维-纳米纤维融合点。
[0048]
用于压制和加热聚合物纳米纤维/非织造片材的优选的加工条件可以在us 20160288089和wo 2015/052465中找到，其全部内容通过引用并入本文。
[0049]
接枝纳米纤维基材本发明基质的制备可以包括接枝步骤，该步骤通常包括从如上提供的支撑物接枝一个或多个中性聚合物链。
[0050]
从基材接枝一个或多个中性聚合物链通常包括任选地在一种或多种催化剂的存在下，从存在于基材上的一个或多个官能团生长一个或多个聚合物链。因此，通常，基材包含一个或多个官能团，优选一个或多个可以从其生长聚合物链的官能团。从一个或多个官能团生长聚合物链是指在来自单独的单体结构单元的一个或多个官能团处构建聚合物。因此，接枝步骤通常包括直接从基材生长聚合物链，而不是将预先形成的聚合物链键合到基材。然而，键合预先形成的聚合物(例如聚缩水甘油)也是一种替代方案。因此，随着聚合的
进行，将单个单体加入到在远处锚定到基材的生长的聚合物链的末端。然后聚合物涂层将包含单点共价束缚到基材的聚合物分子。聚合物分子可以是线性的或支化的，并且甚至是超支化的，在这种情况下，大于50%的单体残基是支化点或末端单体。直接从基材生长聚合物链能够控制聚合物涂层的结构，特别是使用聚合物全部以均匀速率同时生长的聚合策略。这使得能够形成致密且界限清楚的聚合物涂层。因此，当基材是一层或多层在其接合处融合在一起的聚合物纳米纤维时，将形成界限清楚的薄涂层，覆盖芯纳米纤维和单个纳米纤维之间的融合点。涂层可以是保形涂层(conformal coating)，即，遵循纳米纤维和融合点的轮廓。涂层的厚度可以是例如使得涂布的纳米纤维的平均直径为100-1000 nm，例如100-700 nm或200-700 nm。未涂布的纳米纤维的平均直径则可以是例如100-800 nm，例如100-600 nm。一个或多个层的平均孔径可以是例如200-800 nm，并且孔体积分数可以是例如50-90%，例如60-80%。平均孔径和平均纤维直径可以由层的sem图像计算，并且孔体积分数可以由层或基材的总体积(厚度乘以横截面积)和纳米纤维的比重计算。代表性多层乙酸纤维素纳米纤维盘的孔体积计算的具体实例是：盘直径32 mm和盘厚度0.44 mm给出0.354 cm3的总体积。盘的干重是0.165 g，其中乙酸纤维素比重为1.31 g/cm3，得到乙酸纤维素体积为0.126 cm3。因此孔体积分数是(0.354-0.126)/0.354 = 64%。
[0051]
层的孔结构对于性能是重要的，因为需要满足高动态结合容量(大的可及表面和短的扩散路径)和低背压(大的孔和高的孔体积分数)之间的微妙平衡。接枝的纳米纤维层独特地适合于满足这种平衡，它们具有小的纤维直径和高的孔体积分数。当层具有如下孔径时，实现特别好的组合，如使用全氟聚醚润湿液体由毛细管流孔隙率测定法获得的：起泡点孔径为0.9-1.2 μm，例如1.0-1.2 μm；最小孔径为0.2-0.4 μm和/或平均流量孔(mfp)孔径为0.3-0.5 μm。测量应如下文分析方法中详述的进行。
[0052]
为了良好的流动性质，如果在接枝过程之后保持支撑物的开孔结构是有利的。这样，分离基质(10)将具有如在图2中描述的第一侧(40)和第二侧(50)，其通过由接枝的聚合物纳米纤维之间的间隙(间隙体积)形成的开放的且三维连接的孔结构(60)彼此流体连接。该孔结构优选不含或基本上不含接枝聚合物或在接枝过程期间偶然形成的任何均聚物。这可以通过限制在接枝期间加入的单体量来实现，并且没有阻塞孔结构的任何聚合物可以通过测量流速和/或通过电子显微镜通过观察孔结构来容易地检查。接枝聚合方法提供了引入官能化的聚合物的独特可能性，其增加结合容量，而不阻塞孔结构。
[0053]
本发明的接枝层的优点，特别是与水凝胶涂布的膜相比，在于背压基本上与缓冲液电导率和ph无关。这是由于没有显著的溶胀/收缩现象，并且可以表示为使得当ph 5-8的水性缓冲液以0.4s停留时间通过官能化的分离基质时，当缓冲液的电导率在3-90 ms/cm的间隔内变化时(如在22℃下测量的)，官能化的基质上的压降变化小于0.07 mpa/mm床高(介质厚度)。3 ms/cm对应于20 mm乙酸盐或tris缓冲液，而90 ms/cm对应于具有加入的约1m nacl的相同缓冲液。
[0054]
在本发明中，接枝可以包括使式的多个化合物和/或其对映异构体或衍生物反应。
[0055]
最优选地，接枝包括使具有一个或多个可以从其生长聚合物的官能团的支撑物与
式的多个化合物和/或其对映异构体和/或式(i)的其衍生物和/或其对映异构体和/或非对映异构体反应：在其中支撑物由不同的聚合物形成的纳米纤维形成的实施方案中，每种不同类型的聚合物纳米纤维可以在接枝步骤中用不同的聚合物接枝。这可能例如由存在于不同的聚合物纳米纤维上的不同的官能团产生。或者，相同的聚合物可以接枝到支撑物中的每种不同类型的聚合物纳米纤维上。
[0056]
典型的官能团包括羟基、氨基和羧基。在其中支撑物由一种或多种纤维素或乙酸纤维素纳米纤维形成的情况下，官能团通常是羟基。
[0057]
在特别优选的实施方案中，官能团是羟基。在这个特别优选的实施方案中，接枝通常在相同步骤中另外使基材上的羟基去保护的条件下进行。
[0058]
通常进行官能团的去保护，使得官能团可以具有从它们生长的一个或多个聚合物链。例如，当分离基质是纤维素分离基质时，通常提供乙酸纤维素支撑物，并且在接枝步骤之前，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素。这包括乙酰化的羟基的去保护以得到羟基。乙酸纤维素向纤维素的转化通常使用水性碱(优选naoh在水:乙醇(更优选水:乙醇2:1)中)，持续大于12小时的时间段，例如12-36小时。取决于条件，转化(皂化)可以是完全的或部分的，导致一定含量的残余乙酸酯基团。优选完全转化，但可以容许至多约5或10
ꢀµ
mol/g干燥的支撑物的残留乙酸酯含量。
[0059]
或者，当色谱法介质是纤维素分离基质时，提供乙酸纤维素支撑物，并在接枝步骤(ii)中在乙酸纤维素转化为纤维素，并且纤维素随后与式的多个化合物和/或其对映异构体和/或式(i)的其衍生物和/或其对映异构体和/或非对映异构体反应两者的条件下处理，以产生接枝的聚合物链。在这样的实施方案中，接枝步骤(ii)通常在水性碱(优选naoh或koh(更优选koh)在水或水:乙醇中(优选在水中))的存在下进行4-6小时的时间段。
[0060]
当分离基质是纤维素分离基质时，基质通常如下制备：(i)提供由一种或多种乙酸纤维素纳米纤维形成的支撑物，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素，(ii)从所得纤维素支撑物接枝一个或多个中性聚合物链，和(iii)使接枝产物与将步骤(ii)的产物官能化为分离基质的试剂接触。
[0061]
或者，基质可以如下制备：(i)提供由一种或多种乙酸纤维素纳米纤维形成的支撑物，(ii)使支撑物经受乙酸纤维素转化为纤维素并且随后一个或多个中性聚合物链接枝到所得纤维素支撑物上两者的条件，和(iii)使接枝产物与将步骤(ii)的产物官能化为分离基质的试剂接触。
[0062]
用于增加基材上的官能团的数量和/或密度的方法是技术人员已知的。
[0063]
当将一个或多个官能团引入到支撑物中时，在步骤(i)和(ii)之间处理支撑物，在进一步的步骤(i-a)中，改性存在于支撑物上的官能团以引入可以从其生长一个或多个聚合物链的官能团，随后是从如此改性的支撑物中生长聚合物链的步骤(ii)。
[0064]
在包括缩水甘油聚合的实施方案中，通常在步骤(i)和(ii)之间处理支撑物以使支撑物上的任何官能团去保护。
[0065]
接枝到支撑物的一个或多个聚合物链适宜地为中性。聚合物链不含有本领域技术人员认为是带电基团(例如下面讨论的带电基团种类)的任何基团。通常，在步骤(ii)中接枝到基材的聚合物链不含有如本文所定义的任何带电基团。
[0066]
聚合物的中性可以通过聚合物是否含有在基本中性ph (例如ph 6-8，典型地ph 6.5-7.5，通常ph 6.75-7.25，或约ph 7)下可电离(即，质子化的或去质子化)的任何基团来评价。典型地，中性聚合物基本上不含有酸性或碱性中心，即，基本上不含有在ph 6-8 (典型地ph 6.5-7.5，通常ph 6.75-7.25，或约ph 7)下质子化或去质子化的官能团。这可以由技术人员通过本领域典型的测定来确定。评估酸度和碱度的典型程序及其理论方面在“acidity and basicity of solids：theory, assessment and utility
”ꢀ
编辑j. fraisard和l. petrakis, nato asi series c, 第444卷, kluwer academic publishers, dordrecht, boston and london, 1994, 尤其是第513页中讨论，其全部内容通过引用并入本文。本文所用的“基本上”是指少于1摩尔%，优选少于0.1摩尔%，甚至更优选少于0.01摩尔%，或甚至少于0.001摩尔%。
[0067]
如上所述，接枝步骤(ii)可以包括使具有一个或多个可以从其生长聚合物的官能团的基材与式的多个化合物和/或其对映异构体反应。
[0068]
缩水甘油聚合是本领域技术人员已知的技术。缩水甘油聚合通常不需要催化剂的存在。然而，聚合可以任选在一种或多种合适的催化剂存在下进行。在这样的实施方案中，通常使用化学或生物催化剂。缩水甘油聚合通常在水性环境中在温和碱性条件下进行。通常，缩水甘油聚合在室温下进行大于约5小时，例如约16小时。缩水甘油聚合后，通常在水中洗涤接枝产物，然后用弱酸洗涤。
[0069]
缩水甘油聚合包括使缩水甘油和/或缩水甘油衍生物从如本文定义的存在于基材上的一个或多个官能团聚合。通常，那些官能团是羟基。因此，通常，步骤(ii)包括使式的多个化合物及其对映异构体和/或它的衍生物和/或其对映异构体和/或非对映异构体与存在于纳米纤维基材上的一个或多个羟基反应。优选地，步骤(ii)包括使式的多个化合物及其对映异构体与存在于纳米纤维基材上的一个或多个羟基反应。
[0070]
缩水甘油聚合不可以避免地导致聚合物链的支化，产生“丛状(bush)”结构。因此，通常，一个或多个聚合物链是支化的，并且如上所讨论的可以是超支化的。缩水甘油聚合物中不同类型的单体残基是：甘油三醚(支化点)、1,2-甘油二醚(线性)和1-或2-甘油单醚(末端)。在许多情况下，三醚和单醚残基占主导地位，产生超支化的聚合物。
[0071]
在第二方面，本发明公开了从包括一种或多种杂质的负载流体回收纯化的生物大分子的方法，其包括以下步骤：
a)使负载流体通过如上所讨论的分离基质；和b)在负载循环期间并任选地在任何基本上等度洗涤期间回收基质流出物中的纯化的生物大分子。
[0072]
该流通方法允许从非结合或非常弱结合的生物大分子中快速去除吸附污染物。如果污染物的量低(例如在前述亲和色谱法步骤之后)，可以纯化大量的生物大分子而没有任何容量问题。典型的实例是在蛋白a或蛋白l亲和色谱法步骤后，使用如上所讨论的具有多峰阴离子交换配体的分离基质，从免疫球蛋白(例如单克隆抗体)中去除聚集体和/或残留的宿主细胞蛋白。有利地，该亲和色谱法步骤可以在包含多个亲和配体(例如蛋白a或蛋白l配体)的分离基质上进行，其共价偶联到包含非织造聚合物(例如纤维素)纤维(例如fibro
tm prisma (cytiva))的支撑物膜。
[0073]
在第三方面，本发明公开了从包括一种或多种杂质的负载流体回收纯化的生物大分子的方法，其包括以下步骤：a)使负载流体通过如上所讨论的分离基质；b)任选地使洗涤流体通过分离基质；c)使洗脱液通过分离基质；d)在通过分离基质之后回收洗脱液中的纯化的生物大分子；和e)使再生流体通过分离基质。
[0074]
该结合-洗脱方法允许从结合生物大分子(例如目标蛋白)中高效去除吸附和/或非吸附污染物。典型的实例是在蛋白a或蛋白l亲和色谱法步骤后，使用如上所讨论的具有多峰阳离子交换配体的分离基质，从免疫球蛋白(例如单克隆抗体)中去除聚集体和/或残留的宿主细胞蛋白。有利地，该亲和色谱法步骤可以在包含多个亲和配体(例如蛋白a或蛋白l配体)的分离基质上进行，其共价偶联到包含非织造聚合物(例如纤维素)纤维(例如fibro
tm prisma (cytiva))的支撑物膜。
[0075]
另一个实例是如上所讨论的在具有金属螯合配体和过渡金属离子(例如ni
2+
)的分离基质上从细胞培养上清液或裂解物中纯化his标记的蛋白质。
[0076]
上述分离基质允许非常快速的分离循环，并且如果将步骤a)-e)重复数次，例如至少10次或至少20或50次，则是有利的。每个步骤a)-e)的顺序的循环时间则可以小于5分钟，例如小于3分钟或小于2分钟，或0.5-5分钟或1-3分钟。
实施例
[0077]
实施例1在静电纺丝之前，将相对分子量为29,000 g/mol的乙酸纤维素溶液溶解在常用溶剂中，以生产直径在300-600 nm之间的范围内的纤维。纳米纤维生产的优化条件可以在例如o. hardick等人, j.mater. sci. 46 (2011) 3890中找到，其全部内容通过引用并入本文。将约20 g/m2材料的片材层叠，并经受组合的加热和加压处理。
[0078]
根据以下概述的方案将纳米纤维材料衍生化：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)将根据实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44*32 mm*150 mm)放置在含有5 l的0.075 m氢氧化钠在2:1的水:乙醇中的溶液的大烧杯中。将反应混合物在室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
[0079]
洗涤方案a用等体积的去离子水替换反应介质，并循环1小时。再次重复漂洗程序。最后，在从反应容器中去除之前，用等体积的水性乙醇(2:1的h2o:etoh)处理材料。
[0080]
步骤(ii)：缩水甘油聚合将得自(i)的材料悬浮于1 l的0.5 m naoh中。在小心地一次性加入不同量的缩水甘油(15 ml、30 ml、60 ml、120 ml、180 ml)之前，将反应介质循环15分钟。将反应介质在室温下循环16小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
[0081]
洗涤方案b用等体积的去离子水替换反应介质，并循环1小时。此后，用0.01 m hcl替换洗涤介质，将其循环1小时，随后用0.001 m hcl替换并循环1小时。最后，用h2o:etoh的2:1混合物替换介质，将其循环1小时。然后从反应容器中去除衍生化的纳米纤维。
[0082]
实施例2-缩水甘油接枝的dvs官能化的材料根据以下概述的方案将纳米纤维材料衍生化：步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44*32 mm*150 mm)放置在含有5 l的0.075 m氢氧化钠在2:1的水:乙醇中的溶液的大烧杯中。将反应混合物在室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
[0083]
步骤(ii)：缩水甘油聚合将得自(i)的材料悬浮于1 l的1 m naoh中。在一次性加入180 ml缩水甘油之前，将反应介质循环15分钟。将反应介质在室温下循环16小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
[0084]
步骤(iii)：二乙烯基砜衍生化将得自(ii)的材料悬浮于由550ml h2o与溶解于其中的k2co
3 (48.8 g，0.35摩尔)和150 ml乙腈组成的溶液中。在逐滴加入二乙烯基砜(100 ml，0.86摩尔)之前，将反应介质循环15分钟，之后将反应介质再循环1.5小时。然后根据洗涤方案c洗涤材料。
[0085]
洗涤方案c用等体积的温热的(60℃)去离子水:丙酮的1:1混合物替换反应介质，将其循环30分钟。再重复两次洗涤程序。最后，用h2o:etoh的2:1混合物替换介质，将其循环1小时。然后从反应容器中去除衍生化的纳米纤维。
[0086]
实施例3-缩水甘油接枝的dvs官能化的材料的替代方案根据以下概述的方案将纳米纤维材料衍生化：步骤(i)：缩水甘油聚合和皂化通过取ca纳米纤维材料(0.11
×
80
×
50 mm)并将其悬浮在1 l去离子水中，进行ca纳米纤维材料的缩水甘油聚合和皂化。在用另外的1 l去离子水更新之前，将溶剂循环3小时。重复该过程4次后，将纳米纤维材料悬浮在350 ml 1 m koh中。在小心地加入不同量的缩水甘油(100 ml)之前，将反应介质循环60分钟，其中一次性加入25%的缩水甘油，并且在
90分钟内逐滴加入剩余物。将反应介质在室温下循环4小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
[0087]
步骤(ii)：二乙烯基砜衍生化将得自(i)的材料悬浮于由550ml h2o与溶解于其中的k2co
3 (48.8 g，0.35摩尔)和150 ml乙腈组成的溶液中。在逐滴加入二乙烯基砜(100 ml，0.86摩尔)之前，将反应介质循环15分钟，之后将反应介质再循环1.5小时。然后根据洗涤方案c洗涤材料。
[0088]
实施例4 具有n-苄基-n-甲基乙醇胺配体的多峰阴离子交换基质步骤1：用蒸馏水(4
×
600ml)洗涤50个乙酸纤维素盘(32 mm直径，0.9 mm厚度)。去除洗涤溶液，并用350 ml 0.5 m koh溶液替换。在加入100ml缩水甘油之前，用koh溶液用搅拌处理盘10分钟。将反应介质在盘上剧烈搅拌2小时。此后，去除上清液液体，并用蒸馏水(4
×
600ml)洗涤盘，以得到纯净的接枝缩水甘油的纤维素中间体，其不经进一步改性而用于下一步骤。
[0089]
步骤2：从步骤1中取出25个盘并用300 ml 1m koh处理。在将盘搅拌10分钟后，一次性加入30ml烯丙基缩水甘油醚。将所得混合物剧烈搅拌16小时。此后，倾析上清液，并用蒸馏水(4
×
600ml)洗涤盘。纯净的烯丙基化的中间体不经进一步改性而用于下一步骤。
[0090]
步骤3：从步骤2中取出25个盘并悬浮于含有37.5g na2co3和150ml乙腈的500ml h2o中。剧烈搅拌混合物，同时在60分钟内逐滴加入100ml二乙烯基砜。然后将反应混合物剧烈搅拌16小时。此后，倾析上清液液体，并用600ml丙酮:h2o (1:1)洗涤盘3次，并用蒸馏水(1
×
600ml)洗涤。清洁的中间体不经进一步改性而用于下一步骤。
[0091]
步骤4：将来自步骤3的25个盘悬浮于具有其中溶解有12.5g n-溴代琥珀酰亚胺的500ml h2o:乙腈(1:3)溶液中。将混合物剧烈搅拌4小时。此后，倾析上清液液体，并用大量蒸馏水(6
×
600ml)洗涤盘。清洁的中间体不经进一步改性而用于下一步骤。
[0092]
步骤5：将18g n-苄基-n-甲基乙醇胺悬浮于30ml h2o中，并向该混合物中加入6ml丙酮。用5n naoh将溶液的ph调节至ph15。同时，将来自步骤4的25个盘单独放置在6孔板的孔中。向每个盘中加入2.5ml n-苄基-n-甲基乙醇胺溶液。将板在轨道振荡器上轻轻搅动16小时。此后，去除反应混合物，并用蒸馏水(5
×
10ml)洗涤各盘，以得到最终产物，为白色纤维盘。
[0093]
将盘放置在注射器过滤器装置中，并使来自mabselect
tm prisma柱(cytiva, sweden)的含有160 ppm宿主细胞蛋白(hcp)的单克隆igg抗体洗脱液通过盘，停留时间为
1.2秒，并收集流过物。洗脱液的等分试样预先调节至不同的ph和电导率水平。在通过盘后，流过物中的抗体收率和残余hcp含量如表1所示：表1. 用多峰阴离子交换配体的流通测试结果ph电导率(ms/cm)收率(%)hcp(ppm)6.518971117.01099547.53.59926实施例5 具有n-苯甲酰基酰氨基-高半胱氨酸配体的多峰阳离子交换基质步骤1：用蒸馏水(4
×
600ml)洗涤50个乙酸纤维素盘(32 mm直径，0.9 mm厚度)。去除洗涤溶液，并用350 ml 0.5m koh溶液替换。在加入100ml缩水甘油之前，用koh溶液用搅拌处理盘10分钟。将反应介质在盘上剧烈搅拌2小时。此后，去除上清液液体，并用蒸馏水(4
×
600ml)洗涤盘，以得到纯净的接枝缩水甘油的纤维素中间体，其不经进一步改性而用于下一步骤。
[0094]
步骤2：从步骤2中取出25个盘并悬浮于含有37.5g na2co3和150ml乙腈的500ml h2o中。剧烈搅拌混合物，同时在60分钟内逐滴加入100ml二乙烯基砜。然后将反应混合物剧烈搅拌16小时。此后，倾析上清液液体，并用600ml丙酮:h2o (1:1)洗涤盘3次，并用蒸馏水(1
×
600ml)洗涤。清洁的中间体不经进一步改性而用于下一步骤。
[0095]
步骤3：将来自步骤2的盘单独放置在六孔板的孔中。同时，将n-苯甲酰基-dl-高半胱氨酸硫内酯溶液放置在含有27ml h2o的圆底烧瓶中。然后加入4 ml 50% w/v naoh溶液，并将混合物在搅拌下加热至40℃达2小时。此后，将溶液冷却至环境温度。将溶液的ph调节至11.6，并将2.5 ml制备的溶液直接加入到6孔板中的每个盘中。将板在60℃下孵育16小时。此后，倾析上清液，并用蒸馏水(5
×
10ml)洗涤盘，以得到最终产物，为白色纤维盘。
[0096]
用多克隆igg (gammanorm, octapharma)和单克隆igg抗体分析原型在2.4 s停留时间的动态igg结合容量(10%穿透)。容量测试在放置在膜固定器中的单个25 mm穿孔盘上进行，其中在盘上负载在具有不同nacl浓度的50 mm naac缓冲液(ph 5.0)中的0.47 mg/ml igg。
[0097]
表2. 用多峰阳离子交换配体的容量测试结果实施例6 具有聚(乙烯基磺酸酯-共-n-乙烯基吡咯烷酮)配体的多峰阳离子交换基质将如在实施例2中制备的缩水甘油接枝的dvs官能化的材料的32mm直径圆盘(厚度
0.9 mm)放置在烧瓶中。然后将给定量(参见表3)的n-乙烯基吡咯烷酮(vp)、乙烯基磺酸钠盐(30%水溶液) (vsa)和2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐(adba)引发剂加入到每个烧瓶中。通过加入稀释的乙酸将反应混合物的ph设定为6-7。然后加入水使溶液总重量为2.45 g。反应在细胞培养板中进行，该板足够大以容纳直径为32mm的膜。将板放置在加热的振动台上，并将台设定为65℃。接枝反应持续16小时，然后洗涤孔板中的盘。将材料储存在0.2m乙酸钠溶液中。分析原型在2.4 s停留时间的动态igg结合容量(10%穿透)。
[0098]
容量测试在放置在膜固定器中的单个25 mm穿孔盘上进行，其中在盘上负载在50 mm naac缓冲液(ph 5.0)中的0.5 mg/ml多克隆igg (gammanorm, octapharma)。
[0099]
表3用多峰阳离子交换配体的igg容量测试结果样品vpmlvsamladbamgigg容量mg/ml6a1.990.2920506b2.210.2720566c1.950.332045实施例7 具有edta配体的金属螯合基质
1-胺化步骤将三个膜片材(如在实施例2中制备的缩水甘油接枝的dvs官能化的材料) 围绕在网上，然后在烧杯中用3
×
700 ml水洗涤(每次洗涤20分钟)，以去除20%乙醇储存溶液。将围绕网的充分洗涤的片材转移至反应器(500 ml)中，并加入700 ml 25%氨，并将反应混合物在450℃下放置过夜。将围绕网的片材转移至烧杯中并用3
×
700 ml水洗涤(每次洗涤20分钟)。
[0100]
2-配体偶联步骤在烧杯中用6
×
1gv丙酮洗涤来自步骤1的网上的三个胺化的片材，然后转移到反应器中，并加入700 ml丙酮。向反应混合物中加入2.9g二异丙基乙胺(dipea)，并在搅拌下反应5分钟。向反应混合物中加入53 g edta二酐，并将混合物在24-28℃下放置过夜。网上的片材在烧杯中用3
×
1gv丙酮洗涤，然后用3
×
1gv水洗涤，然后用gv 1m naoh放置1小时以水解过量的未反应edta。在烧杯中用6
×
1gv水洗涤网上的片材(每次洗涤20分钟)。
[0101]
将来自配体偶联步骤的片材放入塑料箱中，并在环境温度下在振动台上向箱中加入100 mm niso4溶液15分钟。片材颜色从白色变为蓝绿色/蓝色。
[0102]
让片材表征结合容量。
[0103]
实施例8 具有n,n-二羧甲基-高半胱氨酸配体的金属螯合基质n,n-二羧甲基乙酯高半胱氨酸硫内酯的水解在20 ml具有磁力搅拌棒的小瓶中将n,n-二羧甲基乙酯高半胱氨酸硫内酯0.293 g加入到6.5 ml 1.05 m naoh中，并且水解在室温下进行2.5小时，直到所有配体溶解。
[0104]
nahco
3 1m溶液向25 ml蒸馏水中加入0.786 g碳酸氢钠并搅拌，直到所有碳酸氢盐溶解。
[0105]
dvs活化的盘的制备将如在实施例2中制备的12 dvs活化的盘放置在固定器中，并用500 ml水洗涤20分钟4次，以去除 20%乙醇储存溶液。
[0106]
固定将水解的配体溶液转移至烧杯中，并用碳酸氢盐溶液重复漂洗小瓶以尽可能多地从小瓶中取出。测量ph为9.94。将一半量倒入烧杯中并使用50% naoh将ph调节至11.8。剩余的一半用浓盐酸调节至ph 8.13。使用钳子将经洗涤的dvs活化的纳米纤维盘放置在6孔板中。
[0107]
a：3ml配体溶液，ph 11.8，一式三份b：1.5 ml配体溶液+1.5 ml蒸馏水，ph 11.8，一式三份c：3ml配体溶液，ph 8.1，一式三份d：1.5 ml配体溶液+1.5 ml蒸馏水，ph 8.1，一式三份将板包裹在封口膜中，并在室温和90 rpm下放置在振荡器上过夜(17.2h)。a和b盘立即变黄，而ph 8.1似乎不受影响。
[0108]
所有盘都有一定的黄色，ph 8.1小于ph 11.8。从孔中去除盘，并放置在1l烧杯中使用塑料网的洗涤装置中，并用6
×
800 ml水洗涤。控制溶液的ph为约7。将盘放置在6孔板中并储存在冰箱中的水中。
[0109]
将盘负载镍离子，并a)用纯his-标记的绿色荧光蛋白(gfp-his) (0.3 mg/ml)，b)用掺入gfp-his的大肠杆菌上清液，和c)用掺入gfp-his的单克隆抗体cho细胞培养物上清
液进行评价。
[0110]
a)纯gfp-his将10 ml gfp-his溶液样品负载到放置在注射器过滤器装置中的盘上。实验在四种不同的流速(1、5、10和20 ml/min)下进行。表4显示用咪唑洗脱的gfp-his的收率数据。
[0111]
表4. gfp-his溶液流速(ml/min)面积产量(mg)收集的体积(ml)浓度(mg/ml)收率(负载的%)124472.9135.70.51297517622.0986.00.349701012941.5406.00.257512010521.2536.00.208401(重复)23422.7886.00.46593b)掺入gfp-his的大肠杆菌上清液将gfp-his加入到大肠杆菌培养物中，以得到gfp-his浓度为100 μg/ml，并将培养物在20 000 rpm下超速离心20分钟。将50 ml以10 ml/min流速负载到注射器过滤器装置中的盘上，并用咪唑缓冲液洗脱gfp-his。收率数据示于表5中。
[0112]
表5. 掺入gfp-his的大肠杆菌上清液流速(ml/min)面积产量(mg)收集的体积(ml)浓度(mg/ml)收率(负载的%)1041212.45120.20649c)掺入gfp-his的cho细胞培养物上清液将500 ml cho细胞上清液在20 000 rpm下超速离心30分钟并掺入6.4
ꢀµ
g/ml gfp-his。然后将500 ml以10 ml/min流速负载到注射器过滤器装置中的盘上，并用咪唑缓冲液洗脱gfp-his。收率数据示于表6中。
[0113]
表6. 掺入gfp-his的cho细胞上清液流速(ml/min)面积产量(mg)收集的体积(ml)浓度(mg/ml)收率(负载的%)108692.55.50.46678对于cho细胞培养物实验，时间和缓冲液消耗为：以10 ml/min负载500 ml-50分钟以10 ml/min洗涤50个柱体积-5分钟以5 ml/min洗脱15个柱体积-5分钟总计：1小时，65 ml为了比较，使用填充床柱(histrap excel 5 ml, cytiva)结果是：以5 ml/min负载500 ml
ꢀ‑
1小时40分钟以5 ml/min洗涤30个柱体积-30分钟以5 ml/min洗脱10个柱体积-10分钟总计：2小时20分钟，200 ml分析方法确定动态结合容量使负载材料通过
ä
kta pure系统(ge healthcare)上包含在固定器内的所选官能化的纳米纤维盘。将该材料在确定的膜体积/分钟流速(mv/min)下负载，直到在固定器出口
之后的浓度超过通过uv流动池确定的负载浓度的10%。考虑到系统和固定器装置的死体积，通过在unicorn软件(ge healthcare)中的色谱分析确定在10%穿透时负载到盘上的蛋白质的总量。对于阴离子交换材料，负载材料是在10 mm tris (ph 8)中1 mg/ml bsa。对于阳离子交换材料，负载材料是在乙酸钠(ph 4.7 mm)中1 mg/ml溶菌酶。
[0114]
确定流动阻力使用
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kta pure系统(ge healthcare)确定跨所选官能化的纳米纤维材料的压降(δp)。使10 mm tris (ph 8)缓冲液通过包含在固定器内的官能化的纳米纤维盘。记录δ柱压(δp)等于0.5 mpa时的流速。
[0115]
通过毛细管流动分析的孔径测量所用的设备是porolux
tm 100测孔仪(ib-ft gmbh, berlin, 德国)，并且方法在表7中给出。有关测量原理的进一步细节可以在制造商的网站http://www.ib-ft.com/measurement_principle.html上找到。
[0116]
从测量中获得的三种孔径是最小孔径、平均流量孔(mfp)孔径和起泡点孔径(最大孔径)。
[0117]
表7：毛细管流孔隙率测定法毛细管流孔隙率测定法的结果以及来自sem图像的纳米纤维平均直径的估计示于表8中。可以看出缩水甘油q和缩水甘油dvs蛋白a样品中接枝的聚合物的存在不影响纤维网络的整体结构，即，接枝涂层具有保形性质并且非常薄。如果引入过大量的接枝聚合物，则可能在纳米纤维之间形成聚合物材料，不利地影响材料的流速性能。
[0118]
表8 孔径和纳米纤维直径
ꢀ
平均纤维直径(
µ
m)最小孔(
µ
m)mfp(
µ
m)起泡点孔(
µ
m)无接枝q0.65
ꢀꢀꢀ
缩水甘油q0.63
ꢀꢀꢀ
缩水甘油dvs蛋白a0.610.2340.3991.09本书面描述使用实例来公开本发明，包括最佳模式，并且还使本领域任何技术人员能够实践本发明，包括制造和使用任何装置或系统以及执行任何结合的方法。本发明的可专利范围由权利要求限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其它实例。如果这样的其它实例具有与权利要求的字面语言没有不同的结构要素，或者如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差异的等同结构要素，则这样的其它实例旨在处于权利要求的范围内。正文中提到的所有专利和专利申请通过引用以其整体并入本文，如同单独并入一样。