一种快速提取miRNA的微流控系统的制作方法

本发明属于微机械与微流控，涉及一种快速提取mirna的微流控系统。

背景技术：

1、对于早期的癌症来说，手术切除是首选的治疗方法。因此，癌症的早期诊断对于后续的治疗具有非常重要的意义。

2、近年来，诊断系统的小型化和自动化呈现出日益增长的趋势。实时pcr和实时nasba等分子方法的成功极大促进了这一点，这些技术的敏感性和反应所需要的低体积使其成为小型化方法的对象，并尝试创建全自动诊断盒。目前制造微型诊断盒的尝试使用了多种细胞裂解技术，包括电气、机械、化学和热技术。同时，核酸的纯化方法在很大程度上局限于固相吸附技术。

3、mirna作为生命过程的重要调控分子，与肿瘤的发生和发展有着非常紧密的联系。mirna通过与特定mrna位点杂交来改变基因表达，并与多种细胞功能相关。mirna的失调已被证明在多种癌症和化疗耐药性的发病机制中起着关键作用。因此，从细胞中提取的mirna的相对量的测量可以用作肿瘤诊断和分类的生物标志物。

4、传统的提取mirna通常由三步过程得出。首先，通过机械和/或化学作用裂解细胞。然后，通过吸附到二氧化硅表面，从细胞碎片和其他共释放核酸中纯化释放的mirna，最常见的形式是旋转柱或二氧化硅涂层磁珠。从表面释放后，通过测序或扩增技术(如干环rt-qpcr)检测特定mirna。但是，传统的mirna提取方法自动化程度低、易污染样品且有时会使用有毒的化学试剂。因此将mirna提取集成到微流控芯片上用于自动化检测，可以有效降低人工操作步骤，提高自动化程度。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中传统的mirna提取分析方法效率低下，纯化的步骤多、人工操作多、时间长，易污染样品且有时会用到有毒溶剂，提取效率较低。同时，大多数宏观净化系统需要毫升范围内的样品体积以及大量手动处理和移液步骤，还需要大量的流体操作进行处理，导致了复杂的驱动协议，阻碍了仪器的小型化。本发明提供了一种快速提取mirna的微流控系统，将细胞热电裂解和凝胶电泳集成于一个毫米级的微流控芯片上。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

3、本发明公开了一种快速提取mirna的微流控系统，所述的微流控系统，从微流控芯片上的一侧到另一侧依次为第一电极区域、第一水凝胶区域、裂解室区域、分离水凝胶区域、洗脱室区域、第二水凝胶区域、第二电极区域；所述的第一电极区域包括第一电极和第一电极流体通道；所述的第二电极区域包括第二电极和第二电极流体通道；所述的第一电极、第一电极流体通道、第一水凝胶区域、裂解室区域、分离水凝胶区域、洗脱室区域、第二水凝胶区域、第二电极流体通道和第二电极依次相邻接。

4、具体地，所述的第一电极流体通道、第一水凝胶区域、分离水凝胶区域、第二水凝胶区域和第二电极流体通道的两端为缓冲腔；所述的裂解室区域和洗脱室区域的一端带有缓冲腔；所述的第一电极流体通道的一端带有连接孔，用于连接第一电极；所述的第二电极流体通道的一端带有连接孔，用于连接第二电极；所述的缓冲腔上均带有注射孔，用于注入水凝胶、缓冲液和细胞样品中的任意一种或几种的组合。

5、具体地，所述的第一电极的材质为纯铜、石墨、黄铜或银；所述的第二电极的材质为纯铜、石墨、黄铜或银。

6、其中，所述的第一电极与第二电极的规格可根据微流控芯片的具体尺寸进行设计，非固定规格。

7、具体地，所述的第一水凝胶区域、分离水凝胶区域和第二水凝胶区域中注入水凝胶；所述的裂解室区域、洗脱室区域、第一电极流体通道和第二电极流体通道中注入tris-硼酸电泳缓冲液。

8、进一步地，本发明提供了上述的微流控系统在快速提取细胞中mirna中的应用。

9、其中，所述的微流控系统在快速提取细胞中mirna中的应用，包括如下步骤：

10、(1)将细胞样品注入裂解室区域中，向微流控系统两端的第一电极和第二电极施加高频交流电压裂解细胞，裂解室区域中产生包含mirna的细胞裂解产物；

11、(2)向微流控系统两端的第一电极和第二电极施加直流恒定电流，使得裂解室区域中包含mirna的细胞裂解产物中的mirna穿过分离水凝胶区域向洗脱室区域进行迁移，即实现快速提取mirna。

12、具体地，步骤(1)中，所述的高频交流电压为240～280vrms。

13、具体地，步骤(1)中，向微流控系统两端的第一电极和第二电极施加高频交流电压时，所述的第一电极为阳极，所述的第二电极为阴极。

14、其中，步骤(1)中，当施加高频交流电压时，交流电压产生在液体中的焦耳加热导致细胞裂解。

15、具体地，步骤(2)中，所述的直流恒定电流为120～200ma，优选为160ma。

16、具体地，步骤(2)中，向微流控系统两端的第一电极和第二电极施加直流恒定电流时，所述的第二电极为阳极，所述的第一电极为阴极。

17、有益效果：

18、本发明提出的一种快速提取mirna的微流控系统，针对mirna提取，将细胞热电裂解和凝胶电泳集成于一个毫米级的芯片上，通过热电裂解裂解细胞，并使用凝胶电泳纯化步骤纯化rna。在一个集成微流控芯片中组合两个步骤缩短了两个步骤之间的时间框架，从而保护rna免受酶降解。同时可以在小体积和低浓度情况下提取出细胞中的mirna，通过在微流体室中集成电泳致动电极，可以定义精确的样品体积。

技术特征：

1.一种快速提取mirna的微流控系统，其特征在于，所述的微流控系统，从微流控芯片上的一侧到另一侧依次为第一电极区域、第一水凝胶区域(3)、裂解室区域(4)、分离水凝胶区域(5)、洗脱室区域(6)、第二水凝胶区域(7)、第二电极区域；所述的第一电极区域包括第一电极(1)和第一电极流体通道(2)；所述的第二电极区域包括第二电极(9)和第二电极流体通道(8)；所述的第一电极(1)、第一电极流体通道(2)、第一水凝胶区域(3)、裂解室区域(4)、分离水凝胶区域(5)、洗脱室区域(6)、第二水凝胶区域(7)、第二电极流体通道(8)和第二电极(9)依次相邻接。

2.根据权利要求1所述的微流控系统，其特征在于，所述的第一电极流体通道(2)、第一水凝胶区域(3)、分离水凝胶区域(5)、第二水凝胶区域(7)和第二电极流体通道(8)的两端为缓冲腔(10)；所述的裂解室区域(4)和洗脱室区域(6)的一端带有缓冲腔(10)；所述的第一电极流体通道(2)的一端带有连接孔，用于连接第一电极(1)；所述的第二电极流体通道(8)的一端带有连接孔，用于连接第二电极(9)；所述的缓冲腔(10)上均带有注射孔，用于注入水凝胶、缓冲液和细胞样品中的任意一种或几种的组合。

3.根据权利要求1所述的微流控系统，其特征在于，所述的第一电极(1)的材质为纯铜、石墨、黄铜或银；所述的第二电极(9)的材质为纯铜、石墨、黄铜或银。

4.根据权利要求1所述的微流控系统，其特征在于，所述的第一水凝胶区域(3)、分离水凝胶区域(5)和第二水凝胶区域(7)中注入水凝胶；所述的裂解室区域(4)、洗脱室区域(6)、第一电极流体通道(2)和第二电极流体通道(8)中注入tris-硼酸电泳缓冲液。

5.权利要求1～4任意一项所述的微流控系统在快速提取细胞中mirna中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述的高频交流电压为240～280vrms。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，向微流控系统两端的第一电极(1)和第二电极(9)施加高频交流电压时，所述的第一电极(1)为阳极，所述的第二电极(9)为阴极。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述的直流恒定电流为120～200ma。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，向微流控系统两端的第一电极(1)和第二电极(9)施加直流恒定电流时，所述的第二电极(9)为阳极，所述的第一电极(1)为阴极。

技术总结
本发明属于微机械与微流控技术领域，涉及一种快速提取miRNA的微流控系统，该微流控系统包括细胞热电裂解模块与凝胶电泳洗脱模块。细胞热电裂解模块使用高频交流电压产生焦耳热导致细胞热电裂解，裂解出的细胞产物用于凝胶电泳，凝胶电泳洗脱模块通过使用直流恒定电流洗脱miRNA，完成miRNA的快速分离过程。微流控系统中使用水凝胶作为分离层，通过微加工制造工艺进行加工制造。本发明的微流控系统，将细胞热电裂解和凝胶电泳集成于一个毫米级的芯片上，缩短了两个步骤之间的时间框架，从而保护RNA免受酶降解，同时可以在小体积和低浓度情况下提取出细胞中的miRNA。

技术研发人员：胡晓靖,邵君,杨晨
受保护的技术使用者：江苏集萃医工交叉技术研究所有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12