一种具有类过氧化氢酶活性的Fe-Ag/CMP纳米聚合物的制备及应用

本发明属于生物分析，具体涉及一种具有类过氧化氢纳米酶活性的双金属纳米聚合物的简单合成及其在过氧化氢检测中的应用。

背景技术：

1、作为活性氧物种之一的过氧化氢(h2o2)，在生物合成、宿主防御和细胞信号传递等生理过程中发挥着重要作用。对于h2o2的检测应用最广泛的方法是基于酶的催化反应，但自然界中的天然酶存在不稳定、易失活、成本昂贵等缺点。目前，研究人员通过模仿天然酶合成出多种多样的纳米酶，包括金纳米颗粒、二氧化铈、氧化石墨烯、碳纳米管等。但已有纳米酶的合成方法复杂、常常表现出生物相容性差及催化性能不足等问题。因此，急需设计、合成出一种新的纳米酶来替代现有的纳米酶。

2、此外，为更好的增强纳米酶的活性，研究发现与单一纳米酶材料相比，双金属纳米酶材料的催化性能显著提高，这主要得益于双金属离子之间的协同效应。众所周知，金属有机框架(mof)中金属节点与有机配体的规则排列，为mofs结构提供了丰富的催化位点，并赋予了mofs材料纳米酶的性质。双金属纳米酶材料主要包括双金属mofs基纳米酶以及负载贵金属纳米粒子的单金属mofs复合物，但mofs基纳米酶往往存在合成方法复杂、生物相容性差的缺点，不能广泛应用于生物医学分析领域。同时，对于负载贵金属纳米粒子的mofs基纳米酶而言，常选择化学还原法原位合成纳米粒子，而常用的还原剂如抗坏血酸、硼氢化钠、柠檬酸钠等都存在一定的化学毒性，无法实现纳米粒子的低成本、无污染、低毒性的绿色合成。

3、配位聚合物(cps)是由金属离子和桥接有机配体形成的功能性有机-无机杂化材料，因其温和的聚合条件、高孔隙率和高客体包封效率而具有广泛的应用。通常生物分子具有多个金属结合位点，用这些配体构建形成的cps具有良好的生物相容性。目前报导的一些生物分子，如核苷酸、氨基酸、肽、和蛋白质等都能被用来构建cps。其中金属核苷酸复合材料因其良好的生物相容性和环保的制备工艺而备受关注。核苷酸具有较高的金属结合亲和力，在金属离子存在的情况下能够自组装成各种结构。若选择一些类酶活性的金属离子与核苷酸类似物进行配位，即可构建催化活性可调、抗恶劣环境稳定性高、组成和结构设计灵活、生物相容性好的纳米酶。

4、其中，单磷酸胞苷(cmp)价廉易得、具有多个配位原子，能与多种具有类酶活性的金属离子进行配位形成具有良好生物相容性的、有纳米酶活性的配位聚合物。且cmp上富含还原性的氨基基团，在不引入外加还原剂的条件下可直接还原金属离子，实现纳米粒子的绿色简单合成。铁离子(fe3+)是一种常见的具有类过氧化氢酶活性的金属离子，例如fe3o4、铁基mof等已经作为纳米酶被投入使用。此外，银纳米粒子(agnps)也具有纳米酶的作用。但是以胶体的形式存在的agnps通常因为其表面能高、密度大的特点容易发生聚集沉淀，从而丧失酶活性。因此，人们通常会选择一种合适的生物模板，并在其上面原位生长银纳米颗粒以改善agnps容易团聚失活的属性。若使用多种配体分子与ag+、fe3+金属离子分别配位，易产生多组分的混合物，且反应后的物质结构对称性下降，稳定性降低。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明公开了一种简易合成类过氧化氢纳米酶的双金属纳米聚合物的制备方法。本发明利用cmp含有多种配位原子，能与多种金属离子同时配位来瞄定fe3+与ag+，再利用氨基官能团的还原性对ag+进行还原，一步合成了具有良好生物相容性的类过氧化氢纳米酶——fe-ag/cmp纳米聚合物。

2、本发明首先提供一种杂化纳米复合物的合成方法，该方法包括如下步骤：

3、步骤(1)制备hepes标准缓冲溶液；

4、步骤(2)在步骤(1)中所得的溶液加入cmp，搅拌均匀使cmp充分溶解。随后剧烈搅拌下依次加入硝酸铁水溶液、硝酸银水溶液，直到无色溶液变淡黄色。其中步骤(2)中所得到的cmp、fe(no3)3、agno3的摩尔比为1:1:(0.25～3)。

5、(3)将步骤(2)中所得混合溶液转移到离心管中，在12000rpm的转速下离心8min收集沉淀，用蒸馏水洗涤3次，最后用4ml的蒸馏水重悬，得到1mg/ml的fe-ag/cmp悬浮液。

6、进一步地，步骤(1)中所述的hepes标准缓冲溶液的ph为7.4，浓度为0.1mol/l。

7、进一步地，步骤(2)中所述的硝酸银溶液的浓度为5～60mmol/l、硝酸铁溶液的浓度为20mmol/l、cmp溶液的浓度为10mmol/l。

8、进一步地，步骤(2)中所述的混合溶液搅拌条件为室温避光下搅拌120min。

9、本发明所述fe-ag/cmp纳米聚合物的制备方法简单易行，可重复性强；cmp还原的agnps尺寸分布均匀，形态均一。

10、本发明还有一个重要目的是设计了fe-ag/cmp纳米聚合物在检测h2o2中的应用。

11、进一步地，所述的fe-ag/cmp用于检测h2o2的方法为：将合成的fe-ag/cmp悬浮液分别与6～22mmol/l的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液(tmb)、ph为3～11的醋酸钠-醋酸(naac-hac)缓冲溶液以及质量分数为30％的h2o2水溶液在温度为15～65℃下混合10min，使用紫外可见分光光度计测量并记录其吸收光谱的数据。

12、进一步地，所述用于检测h2o2的fe-ag/cmp悬浮液的浓度为0.1mg/ml，tmb溶液的浓度为16mmol/l，naac-hac缓冲溶液的浓度为0.1mol/l，h2o2溶液的浓度为5～600μmol/l。

13、进一步地，所述的naac-hac缓冲溶液的ph为4。

14、进一步地，所述的反应温度为45℃。

15、进一步地，所述的fe-ag/cmp悬浮液与tmb溶液、naac-hac缓冲溶液以及h2o2的水溶液的体积比为1:2:33:4。

16、本发明的有益效果为：

17、1、本发明利用cmp作为生物配体与ag+、fe3+同时配位，并利用氨基基团直接将ag+原位还原成agnps，一步合成了具有类过氧化氢酶活性的fe-ag/cmp纳米聚合物。

18、2、该纳米聚合物合成方法简单，催化活性可调、抗恶劣环境稳定性高、生物相容性好，与单金属纳米酶相比酶活性显著提高，成功克服了天然酶在恶劣的化学环境中容易失活、制备复杂、纯化和储存成本高、耗时长等缺点，实现了对过氧化氢的高灵敏和稳定的检测。

技术特征：

1.一种具有类过氧化氢酶活性的fe-ag/cmp纳米聚合物的制备，其特征在于，该方法包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种具有类过氧化氢酶活性的fe-ag/cmp纳米聚合物的制备，其特征在于，所述步骤(1)中所述hepes标准缓冲溶液的ph为7.4，浓度为0.1mol/l。

3.根据权利要求1所述的一种具有类过氧化氢酶活性的fe-ag/cmp纳米聚合物的制备，其特征在于，步骤(2)中所述的硝酸银溶液的浓度为5～60mmol/l、硝酸铁溶液的浓度为20mmol/l、cmp溶液的浓度为10mmol/l。

4.根据权利要求1所述的一种具有类过氧化氢酶活性的fe-ag/cmp纳米聚合物的制备，其特征在于，步骤(2)中所述的混合溶液搅拌条件为室温避光下搅拌120min。

5.一种用权利要求1～4之一所述的方法制备的fe-ag/cmp纳米聚合物。

6.一种利用权利要求5所述fe-ag/cmp纳米聚合物实现在过氧化氢检测中的应用，其特征在于：fe-ag/cmp用于检测h2o2的方法为：

7.根据权利要求6所述的fe-ag/cmp纳米聚合物实现在过氧化氢检测中的应用，其特征在于：用于检测h2o2的fe-ag/cmp悬浮液的浓度为0.1mg/ml，tmb溶液的浓度为16mmol/l，naac-hac缓冲溶液的浓度为0.1mo l/l，h2o2溶液的浓度为5～600μmo l/l。

8.根据权利要求6所述的一种fe-ag/cmp纳米聚合物实现在过氧化氢检测中的应用，其特征在于：所述的naac-hac缓冲溶液的ph为4。

9.根据权利要求6所述的一种fe-ag/cmp纳米聚合物实现在过氧化氢检测中的应用，其特征在于：其中反应温度为45℃。

技术总结
本发明提供一种具有类过氧化氢酶活性的Fe‑Ag/CMP纳米聚合物的简易合成方法及其在过氧化氢检测中的应用，属于生物分析技术领域。本发明的方法包括如下:（1）制备4‑羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）标准缓冲溶液；（2）在步骤（1）中所得的溶液中加入单磷酸胞苷（CMP），搅拌均匀使CMP充分溶解。随后在剧烈搅拌下依次加入硝酸铁水溶液、硝酸银水溶液，此时无色溶液变淡黄色；（3）将步骤（2）中所得混合溶液转移到离心管中，在12000rpm的转速下离心8min收集沉淀，再用蒸馏水洗涤3次，最后加入4mL的蒸馏水得到1mg/mL的Fe‑Ag/CMP的悬浮液。本发明利用CMP作为生物配体与Ag<supgt;+</supgt;、Fe<supgt;3+</supgt;同时配位，且CMP上具有还原性的氨基基团可直接将Ag<supgt;+</supgt;原位还原成银纳米粒子（AgNPs），一步合成了具有类过氧化氢纳米酶活性的双金属Fe‑Ag/CMP纳米聚合物，实现了对过氧化氢的检测。

技术研发人员：戴志晖,刘华,屠闻文
受保护的技术使用者：南京师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17