用于体外溶血栓药物效果分析的双层微流控芯片及制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于体外溶血栓药物效果分析的微流控芯片及制备方法。该芯片以弹性聚二甲基硅氧烷为材料，采用塑模法制备，芯片为双层结构，含有一条主管道、四个进液孔和两个微阀门。通过在芯片主管道内模拟人血管中血栓团块的真实状态，仅需要微量的血液和溶血栓药物即可实现对药物溶栓效果的分析。本发明具有结构简单、制造成本低、样品消耗少和检测精度高的特点，适合于溶血栓药物的溶栓效果分析及药物筛选的应用。
【专利说明】
用于体外溶血栓药物效果分析的双层微流控芯片及制备方法
技术领域
[0001]本发明属于生物医学检测分析领域，具体涉及一种用于体外溶血栓药物效果分析的双层微流控芯片及制备方法，并提供了该芯片的制备方法。
【背景技术】
[0002]血栓为血管内表面由于血液的凝固或血液成分相互粘结而形成的固体质块，血栓类疾病一般是由于凝血、抗凝和纤溶系统失衡或凝血机制被过度激活而形成的。血管内产生的血栓会导致血流速度变慢或瘀滞、心血管内膜损伤甚至血液性质的改变，从而导致多种严重疾病的发生如心肌梗塞和脑卒中等，极大地危害着人类健康。因此，针对体内已形成的血栓，就需要尽快利用药物进行溶栓治疗。现有的溶栓药物多为纤维酶原激活物或类似物，被激活的纤维酶可以将血栓中的纤维蛋白从精氨酸-赖氨酸键上分解成可溶性产物，如链激酶和组织纤维溶酶原激活剂等。
[0003]为了研究血栓的形成机制以及对溶栓药物进行直观的药效评价，就需要建立有效的体外血栓及溶栓模型，用以在活体外模拟血栓的形成和溶栓过程。通过向血栓模型中施加溶栓药物，再利用已有的溶栓产物检测方法，如重量测定法、长度测定法、溶解产物D-二聚体浓度测定法和体外测定仪法等，就可以快速、高效地对药物的溶栓效果进行分析。
[0004]当前已有的体外血栓模型均是采用合适的动物或人类的血液为原料，将血液进行静置自凝或加入凝血酶处理使其形成血液凝块，相应的技术方法主要分为静止模型法和流体模型法，对应的设备有血栓环(环形塑料管)和硅胶管(人工血管)等。但目前已有的这些血栓及溶栓模型技术方法均存在较大的缺陷:(I)静止模型法将静置凝固后的血液凝块放置在特定容器中，滴加溶栓药物进行处理后，使其干燥再计算重量的差值。但是，这种方法在称重过程中产生的误差极大。此外，体积巨大的血液凝块和静态溶栓过程也与人体血管内的真实流体内环境有很大区别，静态的血栓溶解反应与处在血流流体状态下的溶栓反应有很大不同，很难考虑到影响血栓的多种因素，进而影响整体溶栓评价结果的可信度；(2)流体模型法采用蠕动栗、硅胶管或聚乙烯袋及血栓装置，可以初步模拟人体血液循环的动力学模型，但该类模型的组成和制作较为复杂、操作繁琐且重复性较差，不利于临床上的大规模普及应用。因此，为了满足现代溶栓机制及溶栓药效研究的需要，目前亟需建立一种操作便捷和精确度高的新型体外血栓及溶栓模型。
[0005]近年来，微流控芯片技术在生物医学应用领域发展迅速，通过在芯片内构建微型反应单元和操控单元，可以突破很多常规方法的技术瓶颈，开发出实用性很强的产品。目前，利用微流控芯片来进行体外微血管血栓模拟和溶栓分析的研究尚处于空白。本发明的微流控芯片具有结构简单、操作便利和试剂消耗少的特点，可以满足溶栓药物效果评价的需要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种用于体外溶血栓药物效果分析的双层微流控芯片及制备方法，并提供该芯片的制备方法。
[0007]本发明的技术方案为:
[0008]—种用于体外溶血栓药物效果分析的双层微流控芯片，该双层微流控芯片包括液体流通管道层和微阀门控制层;所述的液体流通管道层包括一个氟化油/溶栓药物进液孔
1、一个血液进液孔2、一个氟化油/溶栓药物出液孔3、一个血液出液孔4和一条主管道5;进液孔I和进液孔2位于主管道5—侧，出液孔3和出液孔4位于主管道5另一侧;所述的主管道5为光滑平直凹槽，长度为15.0mm，宽度为1.5mm，深度为40.0ym；所述的微阀门控制层包括两个微阀门6，两个微阀门6通过控制气压控制液体流通层中主管道5的开启或闭合，微阀门6的阀门管道长度为3.0mm，宽度为400μηι，深度为40.Ομπι。
[0009]所述的双层微流控芯片的材料为玻璃或光学透性良好且具有弹性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)。所述的液体流通管道层和微阀门控制层的两层PDMS分别经过紫外照射I小时灭菌后，采用等离子体处理90秒，再相互对接进行不可逆的封接键合而成。所述的微流控芯片内的主管道和微阀门的数量均可根据待分析溶血栓药物的检测通量需要而增加或减少。
[0010]利用氟化油和新鲜血液(无需添加抗凝剂)，在微阀门的控制下，在微流控芯片的主管道内形成如下状态:管道的半侧是血液凝块而另半侧是空腔，以此可以模拟人血管内血栓团块的真实状态。将待分析的溶血栓药物流动注入芯片主管道对血栓团块进行溶解，由于微流控芯片内的管道与人血管的尺寸接近，因此在芯片管道内的药物溶栓效果更接近于人血管内的真实情况。将溶血栓产物进行洗脱收集，从而对药物的溶血栓效果进行分析。
[0011]本发明的微流控芯片可以显著降低试剂、血液和药品的消耗量;芯片内的微阀门可与计算机控制系统相连接对芯片内的液体进行精确操控。
【附图说明】
[0012]图1为微流控芯片结构图。
[0013]图中:I氟化油/溶栓药物进液孔;2血液进液孔;3氟化油/溶栓药物出液孔;4血液出液孔;5主管道;6微阀门。
【具体实施方式】
[0014]图1所示为用于体外溶血栓药物效果分析的微流控芯片结构图，主要包含一条液体流通主管道和两个微阀门。通过将氟化油和新鲜血液(血液中无需加入抗凝剂)分别由附图1所示的I号孔和2号孔注入芯片内，并充满整个主管道(图1中标号为5)，两种液体在管道内保持层流状态，待充满整个管道并分别到达3号孔和4号孔后，向两个微阀门(图1中标号为6)中增加气压(不超过20psi )，使得主管道被阀门封闭。室温静置15分钟待血液凝固后，同时开启两个微阀门，通过I号向主管道内增加气压，使得氟化油经由3号孔排出芯片，即形成主管道的半侧为凝固后的血液凝块(图1中标号为5中的阴影部分)，而另半侧为空气(图1中标号为5中的空白部分)。将待检测的溶栓药物溶液通过I号孔注入充满主管道并充满整个管道后，向两个微阀门(图1中标号为6)中增加气压封闭主管道，置于37°C静置，使得溶栓药物与血液凝块发生溶栓作用。待反应完成后，重新开启两个微阀门，通过I号孔注入空气，将溶栓药物与血液凝块作用后的产物溶液排出主管道并收集，收集的溶液可进行纤维蛋白原降解产物测定等后续的常规检测，从而分析溶栓药物的溶栓效果。
[0015]芯片所有的管道和微阀门均以PDMS为材料进行制备，具体方法为:
[0016]1.硅片制备:将单晶硅片置于Piranha溶液(30%双氧水和98 %浓硫酸按体积比3:7体积混合)，煮沸清洗30分钟后，置于180°C烘焙10分钟。
[0017]2.PDMS涂胶:将负光刻胶倾倒于硅片表面的中心位置，利用旋涂机进行I分钟甩涂，甩涂转速为1800转/分钟。
[0018]3.前烘焙:将单晶硅片先于95°C静置6分钟，再于63°C静置3分钟。
[0019]4.紫外曝光:将带有液体流通通道和微阀门结构的掩膜板分别置于硅片表面，紫外曝光5分钟(曝光波长365nm)。
[0020]5.硅片显影:利用丙二醇甲醚酯酸酯对曝光后的单晶硅片进行显影10分钟后，用异丙醇和去离子水清洗表面，氮气吹干。
[0021 ] 6.液体流通层构建:将聚二甲基硅氧烷单体和固化剂按照体积比5:1混合，倾倒在经三甲基氯硅烷处理后的液体流通层硅片模具表面，在恒温加热器上进行80°C烘烤固化40分钟，形成液体流通层芯片。
[0022]7.微阀门控制层构建:将聚二甲基硅氧烷单体和固化剂按照体积比20:1混合，倾倒在经三甲基氯硅烷处理后的微阀门控制层硅片模具表面，80°C烘烤固化40分钟，形成微阀门控制层芯片。
[0023]8.芯片键合:将固化后的两层PDMS分别与硅片模具剥离，经打孔后，用氧离子体处理表面2分钟后，进行对合封接，再与玻璃基片贴合，80°C烘烤12小时，可形成键合牢固的完整芯片。
【主权项】
1.一种用于体外溶血栓药物效果分析的双层微流控芯片，其特征在于，该双层微流控芯片包括液体流通管道层和微阀门控制层； 所述的液体流通管道层包括一个氟化油/溶栓药物进液孔(I)、一个血液进液孔(2)、一个氟化油/溶栓药物出液孔(3)、一个血液出液孔(4)和一条主管道(5);氟化油/溶栓药物进液孔(I)和血液进液孔(2)位于主管道(5)—侧，氟化油/溶栓药物出液孔(3)和血液出液孔(4)位于主管道(5)另一侧；所述的主管道(5)为光滑平直凹槽，长度为15.0mm，宽度为1.5mm，深度为40.0ym ； 所述的微阀门控制层包括微阀门(6)，微阀门(6)通过控制气压控制液体流通层中主管道(5)的开启或闭合;所述的微阀门(6)的阀门管道长度为3.0mm，宽度为400μηι，深度为40.0ym; 所述的双层微流控芯片的材料为玻璃或聚二甲基硅氧烷聚合物PDMS; 所述的微流控芯片内的主管道(5)和微阀门(6)的数量根据待分析溶血栓药物的检测通量确定。2.制备权利要求1所述的双层微流控芯片的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)制备硅片:将单晶硅片置于Piranha溶液中煮沸清洗30分钟后，在180°C条件下烘焙10分钟;所述的Piranha溶液为30 %双氧水和98 %浓硫酸按照体积比3:7混合而成的溶液； 2)PDMS涂胶:将负光刻胶倾倒于硅片表面的中心位置，用旋涂机进行I分钟甩涂，甩涂转速为1800转/分钟； 3)前烘焙:将步骤2)得到的单晶硅片在95°C条件下静置6分钟后，再在63°C条件下静置3分钟； 4)紫外曝光:将带有液体流通通道和微阀门结构的掩膜板分别置于硅片表面，紫外曝光5分钟，所述的紫外波长为365nm; 5)硅片显影:利用丙二醇甲醚酯酸酯对曝光后的单晶硅片进行显影10分钟后，用异丙醇和去离子水清洗表面，氮气吹干； 6)构建液体流通层:将聚二甲基硅氧烷单体和固化剂按照体积比5:1混合后，倾倒在经三甲基氯硅烷处理后的液体流通层硅片模具表面，在80°C条件下烘烤固化40分钟，形成液体流通层芯片； 7)构建微阀门控制层:将聚二甲基硅氧烷单体和固化剂按照体积比20:1混合后，倾倒在经三甲基氯硅烷处理后的微阀门控制层硅片模具表面，在80°C条件下烘烤固化40分钟，形成微阀门控制层芯片； 8)芯片键合:将固化后的液体流通层和构建微阀门控制层分别与硅片模具剥离，经打孔后，用氧离子体处理表面2分钟后，进行对合封接;再与玻璃基片贴合，80°C烘烤12小时，形成键合牢固的双层微流控芯片。
【文档编号】B01L3/00GK105944774SQ201610318026
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】蒋西然, 李灵, 李文利, 刘丹梅, 王旭东, 周晓娅
【申请人】大连理工大学