新型bnp(1-32)表位以及针对所述表位的抗体的制作方法

专利名称：新型bnp(1-32)表位以及针对所述表位的抗体的制作方法
新型BNP(1-32)表位以及针对所述表位的抗体本申请要求于2007年8月3日提交的美国临时专利申请系列号60/935，269的权 益，所述美国临时专利申请通过援弓I而合并入本文。本发明涉及人脑钠尿肽(BNP)以及人中充血性心力衰竭的体外诊断。更特别地， 本发明涉及在BNP (1-32)分子中存在的新表位，针对所述表位的抗体(特别是20G7单克隆 抗体)，利用此类抗体对BNP (1-32) .proBNP (1-108)及其各自片段进行免疫测定的方法，以 及用于实施所述测定的测试试剂盒。充血性心力衰竭是常见的临床综合征，特别是在老年人中。其通常表现为非特异 性症状的隐匿触发的形式，例如强体力活动时咳嗽，疲劳及出现外周水肿。对于该疾患的严 重度(根据纽约心脏协会(NewYork Heart Association)评级为阶段I至IV NHYA)的诊 断和评估基于对于临床征候及特定的测试和检查(超声心动描记术、闪烁造影术、运动试 验等)的结果所进行的联合解释。由于充血性心力衰竭的严重度以及高额的患者护理费用，该综合征的早期诊断显 然是亟需的，因为这将促成实施适合于避免或延迟所述综合征快速发展成严重的充血性心 力衰竭的治疗。因此，必需鉴定出处于充血性心力衰竭和/或不利预后或后继并发症的风 险中的人。这还将使得能够提议同样的工具用于(快速、简单且有成本效益地)在治疗方 面监测接受治疗的患者。现今，此类用于充血性心力衰竭的诊断、预后和监测的方法是可得 的并且描述在下面，但是已证明它们有些不令人满意并且不是完全能够提供足够信息。急性冠状动脉综合征(ACS)也是当今主要的健康问题。它们包括下列心脏疾病 Q波心肌梗死、具有或不具有ST-段升高的心肌梗死、心肌梗死的威胁或不稳定型心绞痛。ACS的诊断、预后和监测在医学界也是极为重要的。钠尿肽(BNP(l-32)、 NT-proBNP(l-76)和proBNP(1-108))的测定在所述这些应用中是引起高度关注的。同样的也适用于下列情况呼吸困难(以呼吸艰难为特征的疾病)、脑血管意外 (CVA)(也称为“中风”或“卒中”)、以及相关的病理学状态例如与这些病理学状态相关的肾 衰竭和糖尿病。长期以来一直寻找可以预测充血性心力衰竭的症状发生前的标志物。在这方面， 已显示心肌细胞产生并分泌具有排钠利尿活性的肽心房来源的肽，其为由de Bold等 人在大鼠中发现的ANP(心房钠尿肽)(Life Science 1981，vol. 28 (1) :89_94)；和称为 BNP (脑钠尿肽)的房室来源的钠尿肽，其由专利EP 418 308的发明者及Sudoh等人(1988) Nature 332 78-81在猪和人中发现。BNP的前体，preproBNP (1-134)，是所述分子在心肌细胞内的储存形式。所 述前体在其分泌过程之中和/或之后进行切割，从而释放出信号肽和proBNP(1-108)。 proBNP (1-108)为具有以下序列的108个氨基酸的多肽HiPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQTSLEPLQESPRPTGVWKSREVATEGIRGHRKMV LYTLRAPR76S77PKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH108 (SEQ ID NO 1) o它在其分泌过程之前和/或之中在氨基酸Arg7f^nser77之间进行切割，从而 被切割成一方面，BNP，也称为BNP (77-108)或BNP-32，或者甚至BNP (1_32)(在下文中将使用该术语)；和激素原的N-末端部分，8呢(1-76)，也称为？1~08呢的^末端片段或 NT-proBNP(l-76)(在下文中将使用该术语)。BNP(1-32)是该分子的血管活性形式，其为具有以下序列的32个氨基酸的肽
S1Pkmvqgsgcfgrkmdrissssglgckvlrrh32 (seq id no:2)。17个氨基酸形成一个环，所述环通过在两个氧化型半胱氨酸残基(Cltl和C26)之间 的二硫键而闭合，所述环在上游被9个氨基酸(其构成N-末端部分)和在下游被6个氨基 酸(其构成C-末端部分)环绕。所述环的完整性对于获得良好的生物学活性是重要的。在形成该环的17个残基 中，11个在另外2种其他钠尿肽(其为ANP(A型钠尿肽)和CNP(C型钠尿肽))中也是保守 的。NT-proBNP(l-76)由proBNP (1-108)的76个N-末端氨基酸组成，并且具有以下序 列hiplgspgsasdletsglqeqrnhlqgklselqveqtsleplqesprptgvwksrevategirghrkmv LYTLRAPR76 (SEQ ID NO :3)。有趣地，proBNP(1-108)、NT-proBNP(1-76)和BNP(1-32)这 3 种多肽已被证明是 充血性心力衰竭的良好标志物，从而开发出了使用抗体的特殊组合的不同测定法。Tateyama^A (1992)Biochemical andBiophysical Research Communications 185 760-767的最初研究起，proBNP (1-108)已被认为在血液中循 环，因而提出了用于检测proBNP(l-108)的各种不同免疫测定法。因此，专利申请WO 99/13331描述了借助于识别proBNP(l-108)的1_76部分的抗体和抗BNP(1_32)抗体来 进行的proBNP(1-108)的夹心测定法。由于具有被捕获抗体所识别的表位的经切割的 proBNP (1-108)的副产物(即NT-proBNP (1_76))和由于其逐步切割而产生的产物结合到固 相(捕获抗体)上，因而这种类型的测定法缺乏灵敏度。申请WO 2004/14952描述了 proBNP (1-108)的检测，在一方面，所述检测借助于识 别位于NT-proBNP (1-76)和BNP(1_32)的铰链处的序列RAPRSP的表位的抗体(也称为铰 链76抗体)，和在另一方面，所述检测借助于抗BNP (1-32)抗体，以下述方式在这种类型 的测定法中，该测定法仅对激素原有特异性，即与NT-proBNP (1-76)和BNP(1_32)的这两种 形式没有交叉反应性。关于NT-proBNP (1-76)的测定，申请 WO 93/24531 描述了基于 NT-proBNP (1-76) 的检测的充血性心力衰竭的体外诊断方法。然而，申请WO 93/24531中所描述的方法看起 来无法在血液样品中对于NT-pr0BNP(l-76)容易地实施。实际上，所显示的仅有的实例并 非在人血清上实施，而是在通过使用合成肽即肽NT-proBNP (47-64)而获得的标准范围上 实施。为了克服这一缺点，高度复杂的自动化系统由此被证明是必需的。最后，开发出了利用各种抗体的多种BNP (1-32)测定法。例如，专利JP 2 676 114 B2描述了识别BNP (1-32)的环状结构的2种单克隆抗体(KY-hBNPI和KY-hBNPII)，没有其 他细节。另外，专利申请EP 542 255描述了识别组氨酸H32的单克隆抗体，所述组氨酸 H32是ΒΝΡ(1-32)的C-末端K27VLRRH32表位的最后一个氨基酸。BNP(1_32)上存在的其 他表位是已知的序列为 ^PKMVQGSGCiq(SEQID NO :22)、5VQGSGCFGR13(SEQ ID NO :21)禾口15MDRISSSSGLG25(SEQID NO 23)的 3 个表位在申请 WO 97/32900 和专利 US 6，162，902 中也 被描述为是高度免疫原性的。所述文献还描述了针对这些表位的单特异性抗体。2005年，HyTest公司(Turku，Finland)将BNP(1_32)的各种特异性抗体投放于市 场。如 Seferian 等人的文章(Clinical Chemistry53 5,866-873, 2007)中所描述的，这些 抗BNP(l-32)抗体中的一些靶向BNP(1-32)的1-10、11-22、17-23或26-32区域。在通过 用 BNP(l-32)的 nFGRKMDRISSSS22(SEQ ID NO 61)肽免疫 Balb/c 小鼠而获得的 17 种抗体 中，只描述了 24C5和26E2单克隆抗体。然而，它们的表位未被精确地表征仅表明，它们针 对上述的BNP(l-32)的氨基酸11至22的序列。专利申请W0 2006/88700描述了在BNP(1-32)上存在的另一表位。其具有氨基酸 R13(K14) (M15)D16R17I18(SEQ ID NO 24)的序列，所述序列包含在构成人BNP (1-32)的环状结 构的一部分的氨基酸13-20中。该申请还描述了命名为3-631-436的单克隆抗体，所述单克 隆抗体特异性地识别该表位。R13、D16、R17和118这4个氨基酸被描述为对于抗体3-631-436 与该表位的结合来说在功能上有重大意义。位于该表位上游的氨基酸(例如苯丙氨酸Fn 和甘氨酸G12)未被提及。所述BNP(l-32)激素的缺点之一是，其在血浆和血清中是不稳定的。实际上，蛋白 酶类型的酶似乎切割 BNP (1-32)。例如，Shimizu 等人(2002) Clinica Chimica Acta 316 129-135报道了，BNP(l-32)的N-末端部分，更特别地Pro2-Lys3键，会被蛋白酶切割，以 及还有在 C-末端位置处的 Arg3Q-Arg31 键。Boerrigter 等人(2007) Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 :R897_90 禾口 Hawkridge 等人(2005)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 17442-7已特别地描述了 BNP(1_32)在N_末端位置处的降解。同样地，已报道了一些由内肽酶引起的键切割(Davidson &Struthers (1994) J. Hypertension 13:329-336)。因此，BNP(1_32)的测定法需要特别的警惕(Davidson 等 人(1995)Circulation91 :1276_7 ；Gobinet-Georges 等人(2000) Clin. Chem. Lab. Med. 38 519-23)，并且暗示了抗体的合适选择。最近，几个小组已显示，钠尿肽可能以糖基化和/或截短的形式循环 (Schellenberger (2006) Arch. Biochem. Biophys. 451 160~6 ；Liang 等人(2007) Journal of the American College of Cardiology49 1071-8 ；Lam^A (2007) Journal of the American College ofCardiology 49:1193-292)。关于充血性心力衰竭、ACS、呼吸困难和其他心血管疾病以及CVA和相关的病理学 状态(例如糖尿病和肾衰竭)的早期诊断，对于改善用于检测BNP (1-32)和proBNP(l-108) 的试剂和方法总是存在着需求，特别是考虑到BNP(l-32)的不稳定性的问题。发明描述本发明主要是从发明人的完全出乎意料的发现而得出的，所述出乎意料的发现是 存在于人BNP(l-32)分子中的未知的和未被怀疑的表位以及识别所述表位的特异性单克 隆抗体。与所有的预期相反，他们发现BNP (1-32)的序列FnGRKMDR17(SEQ ID NO 51)构成 了用于产生识别BNP (1-32)的环状结构(氨基酸10-26)的抗体的有益表位，并且他们获得 了称为20G7的单克隆抗体，其特异性地识别所述FnG12RK14MDR17(SEQ ID NO :51)表位。换 言之，所述20G7抗体是对于BNP(l-32)的FnGRKMDR17(SEQ ID NO :51)表位来说特异的单 克隆抗体。
本发明还提供了使用所述20G7单克隆抗体和包含所述抗体的试剂来检测 BNP (1-32)和proBNP(l-108)以及其循环片段的免疫测定方法。实际上，发明人注意到，当合成位于人ΒΝΡ(1-32)的环状区域(氨基酸10_26)中 的肽并且用所述肽免疫小鼠时，一些所得的抗体仅在所述肽含有残基苯丙氨酸Fn、赖氨酸 K14和精氨酸R17的情况下与这种类型的肽反应，并且在国际申请W02006/88700中所描述的 表位之中特别重要的异亮氨酸I18不属于根据本发明的表位。例如，发明人用肽TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO 4)免疫 了一些小鼠， 并且用肽SGCIGRKMDRISTSTAIGCKVL(SEQID NO 5)免疫了另外一些小鼠。他们观察到， 相比于用肽SGCIGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO :5)进行免疫的小鼠而言，在用肽 TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL (SEQ ID NO 4)进行免疫的小鼠中对于BNP ( 1-32)的免疫应答强 得多。应当注意到，在这两种情况下，半胱氨酸均通过链内二硫键而以氧化的形式存在。在将经免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行淋巴细胞融合后，发明人因此能够产 生不同的杂种克隆。特别地，他们获得了称为20G7-15/03/2007(在下文中为方便起见称为 “20G7”)的单克隆抗体，所述单克隆抗体仅识别含有残基苯丙氨酸Fn、赖氨酸K14和精氨酸 R17的BNP (1-32)和proBNP (1-108)的那些肽。事实上，F11, K14和R17这些氨基酸已被证明 对于所述20G7单克隆抗体与BNP (1-32)和proBNP (1-108)以及其各自片段的最佳结合来 说是重要的。分泌20G7-15/03/2007 (20G7)单克隆抗体的杂交瘤在2007年4月13日由Bio-Rad 以登录号CNCM 1-3746保藏于CNCM(国立微生物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes), Institut Pasteur,25, rue du Docteur Roux,75 724 Paris Cedexl5, France)。令人惊讶地和出乎意料地，发明人用所述20G7抗体观察到，残基Fn、K14 和R17—旦单独地或共同地被丙氨酸置换，所述肽的抗原反应性就相比于天然的肽 SGCFGRKMDRISSSSGLGCKVL(SEQ ID NO 6)而言受到相当大的影响；而置换所述表位的其他 氨基酸对于所述肽的抗原反应性几乎没有影响。而且，对于20G7抗体的深入研究显示， 其识别表位 F11GRKMDR17 (SEQ ID NO 51),但不识别序列 A11GRKMDR17(SEQ IDNO 62)、序列 GRKMDR17I18 (SEQ ID NO 52)和序列 C10F11GRKMD (SEQID NO :50)。因此，20G7单克隆抗体识别BNP (1-32)的表位序列F11GRKMDR17 (SEQID NO :51)，但 基本上不识别申请 WO 97/32900 的上述表位 VQGSGCFGR(SEQ ID NO :21)、SPKMVQGSGC (SEQ ID NO 22)和 MDRISSSSGLG (SEQ ID NO 23)，也基本上不识别申请 W02006/88700 的表位 R(K) (M) DRI (SEQ ID NO 24)。因此，本发明涉及携带人BNP (1-32)表位的多肽，其具有式⑴B1-R1-X1-FGRKMDR-X2-R2-B2 (I)其中-B1可以为H或者表示选自下列的官能团或化学基团硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲 胺官能团，氨基羧基基团，生物素基基团和乙酰基基团；-a2可以表示0Η、ΝΗ2官能团或烷氧基基团(如对于本领域技术人员来说将是清楚 的，a2附着至所述多肽的最后一个氨基酸的酸性官能团的羰基(-C0-)部分)；-X1不存在或存在，并且当存在时，其选自C和GC ；
-X2不存在或存在，并且当存在时，其选自I和IS ；卡和R2，可以是相同或不同的，不存在或存在的，并且其表示任何氨基酸或者2至 15个氨基酸的肽链，条件是式(I)的所述多肽不包括含有序列GCFGRKMDRIS(SEQ ID NO 63)的超过11个氨基酸的人BNP (1-32)的任何部分。作为等价的备选方案，式(I)也可如下定义a「(R1)-(G) - (C) -FGRKMDR- (I) - (S) - (R2) _a2其中，a^ayRi和R2如上面所定义的。“表位”或“表位位点”是指这样的氨基酸序列，其被至少一种抗体所识别并且允许 所述抗体特异性地结合至所述氨基酸序列。在优选的实施方案中，和R2可以与载体分子、试剂或标记物分子相偶联。在另一个优选的实施方案中，所述多肽选自ai-SGCFGRKMDR-a2 (SEQ ID NO 33)、a「GCFGRKMDRI-a2(SEQ ID NO :34)、a「CFGRKMDRIS-a2 (SEQ ID NO 35)禾口 arFGRKMDRISS-a2 (SEQ ID NO :36)，其中 和 a2 如上面所定义的。在另一个优选的实施方案中，如上所定义的多肽相应于式(II)arFGRKMDR-a2(II)其中，&1和 如上面所定义的。本发明还涉及如上所定义的多肽的用途，所述用途为用于制备针对人BNP(l-32) 或人proBNP (1-108)以及包含序列TORKMDR(SEQ ID NO 51)的其各自片段的配体。根据本发明，“proBNP(l-108)的片段”是指小于proBNP(1-108)的任何片段，特别 地包括 BNP (1-32)。例如，在 Lam 等人(2007) J. Am. Coll. Cardiol. 49 1193-1202 中所描述 的片段proBNP (3-108)通过用二肽酶进行切割而产生。根据本发明，术语“proBNP (1-108) 的片段”还包括经历了 proBNP(l-108)的至少一种翻译后修饰的任何多肽，所述翻译 后修饰例如为磷酸化、糖基化等等。例如，Schellenberger等人(2006)Arch. Biochem. Biophys. 51 160-6已显示，proBNP (1-108)是完全或部分0-联糖基化的糖蛋白。根据本发明，“BNP (1-32)的片段”是指小于BNP (1_32)的任何片段。在这种情 况中，在文献中也已报道了 BNP(l-32)的降解例如，Lam等人(同上)和Hawkridge等人 (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 17442-7 已描述了片段 BNP (3-32)。术语“proBNP(1-108)” 和 “BNP(1_32)” 以及 “proBNP(1-108)的片段”和 "BNP(l-32)的片段”还包括经历了至少一种翻译后修饰的任何多肽，所述翻译后修饰例如 为磷酸化、糖基化等等。例如，Schellenberger 等人(2006)Arch. Biochem. Biophys. 51 160-6已显示，proBNP (1-108)是完全或部分0-联糖基化的糖蛋白。“针对人BNP (1-32)或人proBNP (1-108)以及包含序列TORKMDR的其各自片段的 配体”是指能够特异性地结合人BNP (1-32)、人proBNP (1-108)或其片段的任何分子。当涉及配体的识别或者配体与靶的结合时，术语“特异的(特异性的)，，是指配体 与靶相互作用，而基本上不与在结构上不类似于所述靶的另一靶相互作用。表位TORKMDR 的“特异性”识别意指，所述配体与包含所述表位的靶的相互作用基本上不牵涉除了所述 表位的那些之外的抗原决定簇，特别是氨基酸。特别地，这意指，所述配体能够结合序列 BNP(l-32)和/或proBNP (1-108)以及其各自片段(包含含有表位TORKMDR的氨基酸)的氨 基酸序列，但不能结合不整体地包含表位TORKMDR的序列BNP (1-32)和/或proBNP (1-108)的氨基酸序列。另夕卜，根据 Laune 等人(2002) Journal of ImmunologicalMethods 267:53-70，一 旦在表位中存在的氨基酸被置换成丙氨酸导致所述表位的抗原性减少至少50%，那么该氨 基酸就被称为是“关键性的”。
此外，一旦在表位中存在的氨基酸被置换成丙氨酸导致所述表位的抗原性减少至 少80%，那么该氨基酸就被称为是“必不可少的”。优选地，特异性地识别根据本发明的表位TORKMDR的配体基本上不与具有序列 VQGSGCFGR(SEQ ID NO :21)、SPKMVQGSGC (SEQ ID NO :22)、MDRISSSSGLG (SEQ ID NO :23)、 RKMDRI (SEQ ID NO 24)和 RKMDRISS (SEQ ID NO 25)的肽相互作用。表述“基本上不与具有序列VQGSGCFGR、SPKMVQGSGC、MDRISSSSGLG、RKMDRI 禾口 RKMDRISS的肽相互作用”意指，所述配体与这些序列中的这个或那个序列的交叉反应少于 20 %，优选地少于10 %，更优选地少于5 %，特别优选地少于2 %。在靶的特异性识别的范围内，大于IO6M-1的结合常数是优选的，大于IO8M-1的结合 常数是更优选的，并且大于IOkT1的结合常数是特别优选的。优选地，残基Fn、K14和R17对于根据本发明的配体与所述表位的结合也是必不可 少的，因为它们被丙氨酸置换的特征在于单克隆抗体与所述表位肽的结合分别丧失82%、 95%和85%。所述单克隆抗体由在2007年4月13日由Bio-Rad以登录号CNCM 1-3746保 藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux,75 724 Paris Cedexl5, France)的杂交瘤产生。优选地，所述配体选自识别该表位的抗体或所述抗体的片段、适体、和通过噬菌体 展示可获得的特异性地识别该表位的多肽。在该情形下，术语“抗体”是指任何多克隆或单克隆抗体。片段SCFV、Fab、Fab，、F(ab，)2以及骆驼科动物(camelids)单链抗体是识别所述 表位的抗体片段的实例。“适体(aptamer)，，是本领域技术人员所熟知的。适体是核苷酸(特别是核糖核 苷酸或脱氧核糖核苷酸)或者肽性质的化合物，其能够特异性地与靶(特别是蛋白质靶) 结合。核苷酸性质的适体及其产生特别地由Ellington等人(1990)Nature 346:818-22 和Bock等人(1992)Nature 355 :564_6进行了描述。肽性质的适体及其产生特别地由 Hoppe-Seyler 等人(2000) J. Mol Med. 78 :426_30 进行了描述。“噬菌体展示”表示用于选择在噬菌体衣壳上表达的并且由插入到衣壳编码基 因中的核酸序列编码的多肽配体的技术。此方法为本领域技术人员所熟知并且特别地描 述于 Scott & Smith (1990) Science249 :386-390，和 Marks 等人(1991) J. Mol. Biol. 222 581-597。优选地，通过噬菌体展示可获得的多肽是scFv型多肽(单链可变片段)。该技术 特别地描述于 Winter 等人(1994) Annu. Rev. Immunol. 12 :433_455。所述配体还可以通过化学合成或者遗传工程来获得。优选地，将如上所定义的多肽用于制备抗体，特别是单克隆抗体。在该情形下，本发明还涉及如上所定义的多肽的用途，所述用途为用于制备分泌 针对人BNP (1-32)或人proBNP (1-108)以及包含序列TORKMDR的其各自片段的单克隆抗体 的杂交瘤。
因此，本发明还涉及用于制备杂交瘤的方法，所述杂交瘤分泌针对人ΒΝΡ(1-32) 或人proBNP (1-108)以及包含序列TORKMDR的其各自片段的单克隆抗体，其中-从用如上所定义的多肽进行免疫的动物(例如小鼠、兔或大鼠)中获取分泌免疫 球蛋白的淋巴细胞的样品，-将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞(例如Sp2骨髓瘤细胞(ATCCCRL-1581))相融合，从而获得杂交瘤。本发明还涉及通过如上所定义的用于制备杂交瘤的方法可获得的杂交瘤。更特别地，本发明涉及于2007年4月13日以登录号CNCM 1-3746保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes, Institut Pasteur,25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)的杂交瘤。
一般地，用于获得杂交瘤和单克隆抗体的方法可依循由iUihler和 Milstein(1975)Nature 256 :495_497所描述的淋巴细胞融合和杂交瘤培养的常规方法。其 他用于制备单克隆抗体的方法也是已知的(例如，Harlow等人(编辑)1988" Antibodies a Iaboratorymanual“ )0还存在有对于该常规方法的备选方法。例如，可以通过使从杂交瘤中克隆的核酸 进行表达来产生单克隆抗体。本发明还涉及对于序列TORKMDR的表位来说特异的配体。优选地，所述配体选自识别该表位的抗体或所述抗体的片段、适体、和通过噬菌 体展示获得的特异性地识别该表位的多肽。更优选地，所述配体由特异性地识别序列TORKMDR的表位的抗体，或者特异性地 识别该表位的所述抗体的片段构成。更加优选地，所述配体由单克隆抗体(特别是由如上 所定义的杂交瘤产生的单克隆抗体)构成。因此，本发明特别地涉及如上所定义的配体，其由单克隆抗体构成，所述单克隆 抗体由于2007年4月13日以登录号CNCM 1-3746保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux,75 724 Paris Cedexl5, France)的杂交瘤产生。进一步地，本发明更特别地涉及如上所定义的配体，其拥有至少一个互补决定区 (CDR)，特别是如上所定义的由单克隆抗体构成的配体的全部CDR，所述单克隆抗体由于 2007 年 4 月 13 日以登录号 CNCMI-3746 保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes, Institut Pasteur,25, rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15，France)的杂交瘤产生。⑶R以及用于从抗体向配体(优选地为另一抗体)转移⑶R 的方法是本领域技术人员熟知的，并且尤其描述于，例如，Nicaise等人(2004)Protein Sciencel3 :1882_1891，或者 Kettleborough 等人(1991) ProteinEngineering 4 :773_783。此外，如上所定义的配体可以与载体分子、试剂或经标记的分子相偶联。本发明还涉及如上所定义的配体，所述配体用于在生物学样品中检测人 BNP (1-32)或人proBNP (1-108)以及包含序列！7GRKMDR的其各自片段。事实上，本发明还涉及用于在生物学样品中检测人ΒΝΡ(1-32)或人 proBNP (1-108)以及包含序列TORKMDR的其各自片段的方法，所述方法包括1)使所述生物学样品与至少一种如上所定义的配体相接触，优选地在允许形成抗原-配体复合物的条件下，和2)检测任何可能已形成的复合物。在本发明的情形下，“生物学样品”或甚至“生物学流体样品”优选地由生物学液体组成，例如血液、血浆、血清、脑脊液、唾液、尿液和泪等(参见，例如Michielsen等人， (2008)Ann Clin Biochem45 :389_94 ;Cortes 等人，(2006)Eur J Heart Fail 8:621-7; Kirchhoff 等人，(2006) J Neurotrauma 23 :943_9 ;Kaneko 等人，(1993) Brain Res 612 104-9)。正如其在这种情况下所表示的，术语“生物学样品”包括所获取的样品以及已经历 了各种处理的样品，所述处理特别地使得所述样品适合用于根据本发明的过程和方法。在优选的实施方案中，上述检测方法包括至少一个另外的步骤，所述另外的步骤 为使所述生物学样品与至少一种另外的配体相接触，所述另外的配体对于人BNP (1-32)或 人proBNP (1-108)和其各自片段来说是特异的，并且具有与根据本发明的配体的特异性不 同的特异性。优选地，所述另外的配体是抗体。本发明还涉及对于个体中至少一种心脏和/或血管病理学状态进行诊断、预后、 风险分级或治疗追踪的方法，所述方法包括下列步骤1)使来自所述个体的生物学样品与至少一种如上所定义的配体相接触，优选地在 允许形成抗原_配体复合物的条件下，2)检测任何可能已形成的复合物，和3)基于步骤2中的检测的结果，确定所述个体中所述病理学状态的诊断、预后、形 成风险或治疗追踪。在特定的实施方案中，如上所定义的方法包括至少一个另外的步骤，所述另 外的步骤为使所述生物学样品与至少一种另外的配体相接触，所述另外的配体对于人 BNP (1-32)或人proBNP (1-108)衍生物来说是特异的，并且具有与根据本发明的配体的特 异性不同的特异性。优选地，所述另外的配体是抗体。优选地，所述病理学状态选自-充血性心力衰竭，-急性冠状动脉综合征，_脑血管意外，-肾衰竭，-呼吸困难，-高血压，-动脉粥样化斑块破裂，-早产新生儿中的动脉导管未闭，和/或-糖尿病。“充血性心力衰竭”是指这样的病理学状态，其中心脏功能的异常是造成心脏不能 充足地泵血以满足机体的新陈代谢需要的原因，和/或其中心脏满足需要但是带有异常高 的充盈压。特别地，它可涉及左和/或右心室衰竭。“急性冠状动脉综合征”特别地是指下列两种类别
-伴随ST段持续上斜(即上升)的急性冠状动脉供血不足，其显示出Q波透壁性 梗死的形成，通常相应于急性完全冠状动脉闭塞，以及_不带有ST段上斜(即不带有上升)的急性冠状动脉供血不足，其相应于非Q波 梗死，也称为不稳定型心绞痛，相应于斑块破裂和不完全血栓形成并且需要不同的治疗。“呼吸困难”是指以伴随有阻塞或气密感觉的呼吸艰难为特征的病理学状态。它是 极常见的综合征，其可归因于几种原因。只有系统性的方法才使得合适的治疗成为可能。根据世界卫生组织的定义，“脑血管意外”或“CVA”或“中风”或“卒中”是指这样 的病理学状态，其以脑功能障碍(伴随有持续超过24小时的症状)的局部或全面临床征兆 的快速发展为特征，其可导致没有除血管来源以外的其他明显原因的死亡。上述过程和方法可依照本领域技术人员熟知的各种形式来实施，例如在固相或均 相中，在一步或两步中，通过夹心方法或通过竞争方法。优选地，使用在两种配体(优选为抗体)之间的在固相中的夹心方法，所述两种配 体之一是捕获配体和另一是检测配体。这种类型的免疫测定法是本领域技术人员特别熟知 的。例如，Seferian 等人(2007) Clin. Chem. 53 :866_873 的文章给出了用于测定 BNP (1-32) 和proBNP(l-108)的夹心免疫测定法(或在两个位点处的免疫测量测定法)的实例，在每 种情况下使用一对抗体(一种固定在固相上的抗体和一种在检测中的经标记的抗体)。“捕获配体”是指能够结合存在于生物学样品中的BNP(l-32)和/或 proBNP(1-108)抗原以及其各自片段的配体。生物学样品中该抗原的存在通过检测手段，特别是“检测配体”来揭示。经标记的 检测配体能够通过识别与捕获配体所识别的表位位点不同的表位位点而结合被捕获的抗原。术语“经标记的”是指直接标记和间接标记(例如，借助其自己经直接标记的其他 配体，或者使用经标记的“亲和对”的试剂，例如但不排他地，经标记的抗生物素蛋白_生物 素对等)。在夹心方法的情况下，优选地以这样的方式选择捕获配体，即使得所述捕获配体 特异性地识别在患者的天然抗原上的表位，同时优选地以这样的方式选择检测配体，即使 得所述检测配体特异性地识别在患者的天然抗原上的另一表位。优选地，将捕获配体固定在固相上。作为固相的非限制性实例，可以使用微量培 养板，特别是聚苯乙烯微量培养板，例如由Nunc，Denmark所售的那些。还可以使用固体 颗粒或珠，顺磁珠，例如由 Dynal，Merck-Eurolab (France)(以商标 Estapor )禾P Polymer Laboratories生产的那些，或者甚至聚苯乙烯或聚丙烯试管、玻璃、塑料或硅芯片等。可以使用ELISA测定法、放射免疫测定法或者任何其他检测方法来揭示所形成的 抗原-抗体复合物的存在。因此，对配体(特别是抗体)进行不同类型的标记是可能的(放 射性的、酶的、荧光的等)。所述检测也可通过基于质量累积的新方法例如表面等离子共振(SPR)，通过压电 检测，以及通过质谱法或任何其他被定义为使得能够在第二种经标记的配体不存在下研究 配体_抗原类型相互作用的方法来实施。上述过程或方法的优选实施方式在于，与以经标记的形式存在的至少一种针对 BNP(l-32)的N-末端部分的单克隆或多克隆抗体相组合地，使用固定在固相上的如上所定义的配体。 上述过程或方法的另一个优选实施方式在于，与以经标记的形式存在的至少一种 针对ΒΝΡ(1-32)的C-末端部分的单克隆或多克隆抗体(例如50B7抗体(其对于BNP(1_32) 的肽26-32来说是特异的)，可从HyTest获得)相组合地，使用固定在固相上的如上所定义 的配体。备选地，根据上述方法或过程的另外一个优选实施方式，可以与以固定的在固相 上的形式存在的至少一种针对BNP (1-32)的N-末端或C-末端部分的单克隆或多克隆抗体 相组合地，以经标记的形式使用如上所定义的配体。上述方法或过程的优选实施方式在于，与以经标记的形式存在的至少一种针 对NT-proBNP(l-108)的N-末端部分的单克隆或多克隆抗体(例如16F3抗体(其对于 NT-proBNP的肽13-20来说是特异的)，可从HyTest获得)相组合地，使用固定在固相上的 如上所定义的配体。备选地，上述方法或过程的优选实施方式在于，与以固定在固相上的形式存在的 至少一种针对ProBNP (1-108)的N-末端部分的单克隆或多克隆抗体(例如16F3抗体(其 对于NT-proBNP的肽13-20来说是特异的)，可从HyTest获得)相组合地，以经标记的形式 使用如上所定义的配体。上述方法或过程的另一个优选实施方式在于，与以经标记的形式存在的针 对proBNP(l-108)的序列RAI3R76S77P (SEQ ID NO 55)的单克隆抗体(例如在专利申请 W02004/14952 中，或者在 Giuliani 等人(2006) Clin. Chem. 52 1054-1061 中所描述的)相 组合地，使用固定在固相上的如上所定义的配体。备选地，上述方法或过程的优选实施方式在于，与以固定在固相上的形式存在的 针对proBNP(1-108)的序列RAPR76S77P(SEQ ID NO 55)的单克隆抗体(例如在专利申请 W02004/14952 中，或者在 Giuliani 等人(2006) Clin. Chem. 52 1054-1061 中所描述的)相 组合地，以经标记的形式使用如上所定义的配体。本发明还涉及具有下述通式(III)的多表位校准剂(multi印itopic calibrator)^-E1-L1-E2 [-Llri-Ek] n_t2(III)其中-η是在0和8之间的整数；-k是在3和η+2之间的整数，当η>0时；-E1, E2 和 Ek 彼此不同，一个表示 R1-X1-ToRKMDR-X2-R2 肽序列，其中 \、\2、R1 和 R2 如上文所定义的，并且其他表示选自人proBNP (1-108)的序列的3至15个氨基酸的序列；表示氢原子、乙酰基基团、1至10个氨基酸的肽序列、1至10个N-α乙酰化的 氨基酸的肽序列、生物素基或生物胞素基基团、带有生物素基或生物胞素基基团的1至10 个氨基酸的肽序列、或者线性的氨基烷基(C1-Cltl)羰基链；_t2表示羟基基团、氨基基团、1至10个氨基酸的肽序列、带有末端氨基基团的1至 10个氨基酸的肽序列、或者线性或支化的氨基烷基(C1-Cltl)羰基链(如对于本领域技术人 员来说将是清楚的，t2附着至该E1Ji链的最后一个氨基酸的酸性官能团的羰基(-C0-)部 分)；
-L1和Lk，可以是相同或不同的，并且其表示肽链的连接基团。优选地，上述的多表位校准剂相应于下述通式(IV)t1-E1-L1-E2-L2-E3-t2(IV)其中，Ε” EyEpLpLyt1禾口、如上所定义的。优选地，上述的多表位校准剂相应于下述通式(V)I1-E1-L1-E2-I2(V)其中，E”E2、L”、和t2如上所定义的。 使用上述的标准物(或校准剂)来建立用于测定BNP (1-32)、proBNP (1-108)和/ 或前述其片段之一的标准曲线。所述校准剂的优点之一特别是其稳定性。优选地，当用于测定BNP(1-32)时，根据本发明的双表位标准物包含根据本发明 的表位TORKMDR，和选自proBNP(l-108)的氨基酸77-108的序列的另一个不同的表位。优选地，当用于测定proBNP(l-108)时，根据本发明的双表位校准剂包含根据本 发明的表位TORKMDR，和选自proBNP(1-108)的氨基酸1_76的序列的另一个不同的表位，以 确保proBNP (1-108)的特异性。优选地，当用于测定BNP(1-32)时，根据本发明的三表位校准剂包含根据本发明 的表位R1-X1-ToRKMDR-X2-R2,和选自proBNP (1-108)的氨基酸77-108的序列的两个另外的 不同表位。优选地，当用于测定proBNP(l-108)时，根据本发明的三表位校准剂包含根据本 发明的表位R「X1-FGRKMdR-X2-R2,和选自proBNP (1-108)的氨基酸1-108的序列的两个另 外的不同表位。优选地，在上述校准剂中，R1-X1-FGRKMDR-X2-R2表示选自下列的肽序列 SGCFGRKMDR(SEQ ID NO 33)、GCFGRKMDRI (SEQ ID NO 34)、CFGRKMDRIS (SEQ ID NO 35)、 FGRKMDRISS(SEQ ID NO :36)、FGRKMDR(SEQ ID NO :8)、SFGRKMDRISS (SEQ ID NO 64)禾口 CFGRKMDRISSSSGLGCK(SEQ ID NO :65)。优选地，所述不同于R1-X1-FGRKMDR-X2-R2 的序列选自 JRSPKMVQG(SEQ ID NO 56)、APRSPKMV (SEQ ID NO 57)、SGLGCKVL (SEQ IDNO 58)、SPKMVQGSG(SEQ ID NO 59)、 YTLRAPRSPKMVG (SEQ ID NO 60)、YTLRAPRSPKMV (SEQ ID NO 66)、YTLRAPRSPKMVQG (SEQ ID NO 67)、SGLGCKVLRRH(SEQ ID NO 68)和 SGLGCKVLR(SEQ ID NO 69)。优选地，根据本发明的多表位校准剂选自由下列式定义的多表位校准剂Ac-YTLRAPRSPKMV-LrSFGRKMDRISS-NH2 ；Ac-YTLRAPRSPKMV-LrCFGRKMDRISSSSGLGCK-NH2 ；Ac-YTLRAPRSPKMVQG-LrFGRKMDR-NH2 ；Ac-FGRKMDR-LfSGLGOKVLRRH-OH ；Ac-Fgrkmdr-L1-Sglgokvlr-NH2 ；Ac-Spkmvqgsg-L1-Fgrkmdr-Nh2 ；Ac-YTLRAPRSPKMV-LfFGRKMDR-I^-SGLGOKVLRRH-OH ；禾口Ac-Ytlraprspkmv-L1-Fgrkmdr-L2-Sglgokvlr-NH2 ；其中Ac表示乙酰基基团，和C*表示用乙酰胺基甲基封闭的半胱氨酸。优选地，L1和L2表示
-NH-(CH2)5-C0-。该基团特别地可以源自称为氨基己酸的偶联剂。当EpE2和E3存在时，所述校准剂被称为三表位的；当仅Ei和E2存在时，那么所述 校准剂被称为双表位的。此外，本发明还涉及用于检测人BNP(1-32)或人proBNP(1-108)以及包含序列 FGRKMDR的其各自片段的试剂盒，所述试剂盒至少包含-如上所定义的配体；和-如上所定义的多表位校准剂和/或如上所定义的多肽。在特别的实施方案中，上述试剂盒还包含阳性生物学对照样品。优选地，根据本发明的试剂盒至少包含由于2007年4月13日以登录号CNCM 1-3746 保藏于 CNCM(Collection Nationale de Culturesde Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux,75 724 Paris Cedex 15, France)的杂交瘤所产生的 单克隆抗体。下面的实施例和附图举例说明本发明，而不限制本发明。附图描述

图1显示了 20G7抗体与固定的十五肽的反应性，这些十五肽代表了 BNP(l-32)的 序列(从左至右，分别为 SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO: 17)，并且通过Spot技术来合成。图2显示了 20G7抗体与表位TORKMDR的结合的丙氨酸扫描分析(用丙氨酸置换 所述肽的每个残基)的结果，并且显示了残基F、K和R的重要性。图3描绘了在浓度渐增的可溶性肽存在下，抗体20G7和24C5与BNP(l-32)的结合 的抑制，所述可溶性肽的序列为SEQ ID NO 51( “AA11-AA17”，菱形)、SEQ ID NO 62( “突 变的 AA11-AA17”，圆形)或 SEQ ID NO 9( “缺失的 AA11-AA17”，三角形)。图4显示了 11A8抗体与表位TORKMDR的结合的丙氨酸扫描分析(用丙氨酸置换 所述肽的每个残基)的结果，并且显示了残基F、G、K和R的重要性。图5呈现了通过20G7抗体所检测的BNP(1_32)的标准范围。图6呈现了通过20G7抗体所检测的重组proBNP(1-108)的标准范围。图7显示了在充血性心力衰竭患者中，在通过20G7抗体所进行的BNP(1_32)和 proBNP(1-108)的检测之间的相关性。图8显示了在来自患有NYHA I类(图8A)、NYHA II类(图8B)和NYHA III 类(图8C)充血性心力衰竭的受试者的样品中，在通过20G7抗体所进行的BNP(l-32)和 proBNP(1-108)的检测之间的相关性。图9显示了在来自健康受试者的样品中，在通过20G7抗体所进行的BNP(1_32)和 proBNP(1-108)的检测之间的相关性。图10显示了在来自患有肾衰竭的受试者的样品中，在通过20G7抗体所进行的 BNP(l-32)和proBNP(1-108)的检测之间的相关性。图11显示了在缺血性中风和对照的含柠檬酸盐的血浆样品中，BioPlex 2200proBNP浓度。有凹槽的框显示了最小值、25th百分位值、50th百分位值、75th百分位值和 最大值。
图12显示了在来自患有急性冠状动脉综合征的受试者的样品中，在通过20G7抗 体所进行的BNP(1-32)和proBNP(l-108)的检测之间的相关性。图13显示了在通过免疫测定法来进行的糖基化的proBNP(1-108)的测定和未糖 基化的proBNP (1-108)的测定之间的相关性，所述免疫测定法使用固定的铰链76抗体和用 于揭示的根据本发明的20G7抗体。 图14和15分别显示了，通过使用BioPlex 2200装置而获得的双表位校准剂 CaliproBNPl 和 CaliproBNP3 的标准范围。图16显示了通过免疫测定法而获得的双表位校准剂CaliproBNP5、 proBNP(1-108)和BNP(1_32)的标准范围，所述免疫测定法使用固定的多克隆抗体L21016 和用于揭示的根据本发明的20G7抗体。图17显示了以两种免疫测定法形式而获得的三表位校准剂CaliproBNP6和 proBNP(1-108)的标准范围一种基于铰链76抗体的固定化和用于揭示的根据本发明的 20G7抗体(空心和实心的圆形)；和第二种基于铰链76抗体的固定化和用于揭示的针对位 于BNP (1-32)的C-末端部分的表位的抗体(空心和实心的三角形)。
实施例实施例1 肽的合成材料和方法通过本领域技术人员熟知的标准方法来制备合成肽。该方法的实例为 Merrifield合成法，该合成法由于其可被容易地实施而是有利的(Merrifield，(1963)； R. C. Sheppard (1971) ；Atherton 等人(1989))。Perspective 的"Pioneer，，合成仪，或者 ABI 的“433A”合成仪可用作自动合成仪。所述肽还可以通过均相合成来获得。下述合成通过使用“Fmoc”化学(9_芴基甲氧基羰基)在Pioneer合成仪中进行 在每个步骤中，过量(以比率“试剂的摩尔数/树脂上可被取代的基团的摩尔数” =5)添加 试剂(即经保护的氨基酸和偶联活化剂(TBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3_四甲基 脲鐺四氟硼酸盐)/H0Bt(N-羟基苯并三唑))。在合成过程结束时，通过三氟乙酸溶液(试 剂K)将肽与树脂分离开。然后，在冷却的醚溶液中使所述肽沉淀，冻干，并随后通过HPLC 进行纯化。以这样的方式，发明人合成了包含下列氨基酸序列的肽SEQ ID NO 4 :Ac-TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVLCys-C0NH2,SEQ ID NO 5 5 :Ac-SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL-CysC0NH2SEQ ID NO 6 :Ac-SGCFGRKMDRISSSSGLGCKVL-CysC0NH2SEQ ID NO 7 :Ac-SGCFGRKMDRIATSTAIGCKVL_CysC0NH2SEQ ID NO 8 :Ac_FGRKMDR-C0NH2SEQ ID NO 9 :Ac_GRKMDR-C0NH2SEQ ID NO 10 :Ac-FGRKMD_C0NH2SEQ ID NO: 11 :Ac-RKMDRI_C0NH2。实施例2 免疫原的制备将肽与载体蛋白相偶联以用于进行免疫为了用这些肽免疫小鼠，必需通过不同的官能团(硫醇、胺、醛等)将所述肽与载体蛋白例如KLH(匙孔血蓝蛋白)、甲状腺球蛋白或BSA(牛血清白蛋白)相偶联，以使所述 肽更具有免疫原性。用于将所述肽连接至所述蛋白质的偶联试剂可以是异双官能的或者同 双官能的。最常用的试剂是BS3、sSMCC、SPDP、戊二醛等。所使用的偶联方法牵涉作为化学偶联剂的双官能sSMCC(Pierce，# 22322)分子， 其具有NHS酯官能团和马来酰亚胺基团；和作为载体蛋白的KLH(Pierce，#77600)。2-a. KLH 的活化方法:将20mg KLH溶解在2ml磷酸盐缓冲盐水(20mM磷酸盐，0. 9MNaCl pH7. 2)中，以便 获得10mg/ml的终浓度(不涡旋振荡)。平行地，将4mg sSMCC用400 yl注射用水进行溶 解，以获得10mg/ml的终浓度。随后，将2ml KLH(20mg) % 200 u 1 sSMCC (2mg)相混合，并 将该混合物在室温(20°C )下温育1小时并同时缓慢搅拌(每分钟20转)。2-b.使经活化的KLH脱盐方法PD10 Sephadex TM G_25m柱(Ge healthcare,USA,ref 17-0851-01)用磷酸盐缓 冲盐水(20mM磷酸盐，0. 9M NaCl pH7. 2, lOOmM EDTA)进行平衡。将2ml经活化的KLH置于 柱上，随后用3. 5ml补充了 0. 9M NaCl，pH7. 2和lOOmM EDTA的20mM PBS缓冲液开始洗脱； 收集500 yl级分。对于稀释至1/25的每个级分在280nm处测量光密度(0D)，然后鉴定出 包含经活化的KLH的级分并依照Beer-Lambert定律进行测量0D = e C1，其中0D是光密 度，￡ = 1. 499，C是浓度，和1 = lcm ；可以测定出经活化的KLH的浓度，并减少至在磷酸 盐缓冲盐水中的7. 4mg/ml。2-c.将所述肽与所述经活化的KLH相偶联方法:将10mg冻干的肽溶解在1ml Milli-Q水(其在超声粉碎器中脱气)中以获得 10mg/ml的终浓度，然后将其与7. 4mg经活化的KLH(即1ml在2_b中获得的溶液)相混合。 将该混合物在室温(20°C )下温育2小时并同时缓慢搅拌(20rpm)。随后，引入处于20mM PBS缓冲液+0.9M NaCl pH7. 2中的浓度为5mg/ml的半胱氨酸溶液以获得在肽/KLH溶液中 ImM的终浓度，并将整个混合物在室温(20°C )下温育20分钟并同时缓慢搅拌(20rpm)。2-d.经偶联的肽的表征^^ 然后，如下通过 Bradford 方法(Bradford M.，Anal. Biochem.，1976 ；72 248-54) 来测定经偶联的肽的浓度制备50至1000 u g/mLKLH的标准范围，以便从在595nm处的0D 测定出我们的样品中的KLH浓度。为了产生该标准范围并施行该测定法，将50 y L的每一 点的样品稀释在1. 5mL考马斯蓝(Bio-Rad, #1856210)中。在测定了浓度之后，向KLH-偶联的肽中添加PBS以将经偶联的肽的浓度带至lmg/ mL0实施例3 小鼠的免疫和单克隆抗体的产生3_a)小鼠的免疫为了产生单克隆抗体，使用下列肽之一免疫十只小鼠(Balb/c品系雌性，5周龄， ref :SIFE055,Charles Rivers,MA,USA) :Ac-TGCFGRKMDRISTSTAIGCKVL-Cys-C0NH2(SEQ IDNO 4) Ac-SGCYGRKMDRISTSTAIGCKVL-CysC0NH2 (SEQ ID NO :5)，所述肽依照实施例 2 与 KLH 相偶联(每种肽使用5只小鼠)。为了第一次注射，制备在弗氏完全佐剂(Sigma，#F_5881)中稀释至1/2的100 y g KLH-偶联的肽(浓度为lmg/ml)的乳剂，并且将200 y L所述乳剂(即100 y g肽)皮下 注射入每只小鼠中。以20天的间隔，向每只小鼠中以皮下方式，然后以腹膜方式进行3次 200 ii L的KLH-偶联的肽(即100 y g肽)和弗氏不完全佐剂(Sigma, #F-5506)的乳剂的
加强注射。在最后一次加强注射后20天，和在已通过ELISA方法评估了所获得的抗体(依照 下面描述的实施例4)之后，保留具有最大的针对BNP(l-32)的反应的小鼠以便依照下面的 实验方案进行超免疫-皮下注射200ii L用PBS稀释至1/20的lmg/mL的肽-KLH，-等待45分钟，-在与第一次注射不同的位点处，皮下注射200ii L用PBS稀释至1/20的lmg/mL 的肽-KLH，-等待45分钟，-在与先前的注射不同的位点处，皮下注射200iiL用PBS稀释至1/10的lmg/mL 的肽-KLH，-等待30分钟，-腹膜内注射100ii L用PBS稀释至lmg/mL的异丙嗪(2. 5%非那根，可注射溶液， UCB)，-等待15分钟，-在与先前的注射不同的位点处，腹膜内注射200iiL用PBS稀释至3/10的lmg/ mL 的肽-KLH。在这些免疫之后，发现用肽SEQ ID NO :4进行免疫的小鼠S2产生抗血清，当使用 下面实施例4中所描述的用于检测抗体的实验方案时，所述抗血清对于BNP(l-32)是非常 具有反应性的。随后，使来自所述小鼠的脾脏的淋巴细胞经历淋巴细胞融合，所述淋巴细胞 融合依照下面3b中所描述的实验方案来进行。3-b)单克隆抗体的产生依照Kiihler和Milstein的众所周知的实验方案(1975) (Nature56 =495-497)来 进行经免疫的小鼠S2的脾细胞与骨髓瘤SP2细胞(ATCCCRL-1581)的淋巴细胞融合。因此，发明人能够产生不同的杂种克隆。特别地，他们获得了被定名为 20G7-15/03/2007(在下文中为方便起见称为“20G7”)的单克隆抗体。分泌所述 20G7-15/03/2007 (20G7)单克隆抗体的杂交瘤于2007年4月13日以登录号CNCM 1-3746 保藏于 CNCM(FrenchNational Collection of Cultures of Microorganisms, InstitutPasteur, 25, rue du Docteur Roux,75 724 Paris Cedex 15, France)。不言而喻，可以使用本领域技术人员所熟知的用于获得单克隆抗体的其他实验方 案。实施例4 检测抗BNP(1_32)抗体以评估在免疫过程中小鼠的应答4. 1.材料
使用下列试剂-Maxisorp 96-孔平底微量培养板(Nunc，Denmark)-PBS (磷酸盐缓冲盐水)缓冲液，pH7. 4，Gibco 片剂，ref 18912-014 (Invitrogen)-BNP(l-32)合成肽(Sigma-Aldrich，USA，#B_5900)或-proBNP(1-108)(在大肠杆菌(E. Coli)中产生的重组蛋白质，HyTest，Finland)- Tween 20 (Sigma-Aldrich, USA, #P1379)-在兔中产生的并与过氧化物酶相偶联的抗小鼠IgG二抗，(Sigma，USA, #A9044)-H202 (0 . 04%，在0. 1M柠檬酸盐缓冲液，pH4中)-0PD (邻苯二胺，Sigma, USA, #P8412)-WlM (H2S04,4N)-来自在实施例3中经免疫的小鼠的血清。4.2.方法和原理在固体支持物上进行ELISA测试以检测小鼠血清样品中抗BNP(l-32)抗体的存在。通过吸附将一些抗原固定在96-孔微量培养板的孔穴中。在其余的自由位点被饱 和和封闭后，温育所述免疫血清，并且可能存在的抗体(“Ac”)与所述抗原(“Ag”)结合 并形成Ag-Ac复合物。使用与酶相偶联的免疫缀合物(抗小鼠IgG抗体)来检测该复合 物，在该情况下，所述酶是HRP (辣根过氧化物酶)，其将无色的底物转化为指示所需抗体的 存在的有色产物。最终的有色产物的形成通过在490nm处进行光密度读取(0D)来进行定 量。依照本领域技术人员所熟知的该方法，所获得的0D表明在所测试的小鼠血清样品中抗 体的存在(高0D)或不存在(低0D)。存在有本领域技术人员所熟知的该测试的许多变化 形式(抗原捕获，竞争测定法 )。1)将抗原固定在微量培养板上将每种抗原，BNP (1-32)或proBNP (1-108)，以0. 5 y g/mL的终浓度溶解在PBS中， 然后通过于4°C温育过夜依照100 y L/孔将其固定在Maxisorp微量培养板上。在用PBS o. i%Tween 20 (pbs-t)进行3次洗涤后，用含有牛奶(半脱脂的)的o. i%pbs-t溶 液(lOOyL/孔)使微量培养板饱和，然后将其于37°C温育1小时。2)由小鼠产生的抗体的免疫学检测用0. PBS-T洗涤微量培养板三次。随后，将来自先前经免疫的小鼠的每种血清 用含有0.1%牛奶(半脱脂的)的0. 1%PBS-T稀释十倍，然后依照lOOiiL/孔进行放置， 并且于37°C温育两小时。再次用0. PBS-T将微量培养板洗涤三次，然后在含有0. 1% 牛奶(半脱脂的)的0. PBS-T中稀释至1/3，000的与过氧化物酶相偶联的缀合物存在 (依照100 y L/孔)下于37°C温育1小时。最后，用0. 1% PBS-T将微量培养板洗涤三次， 然后依照100 u L/孔放置过氧化物酶底物。将微量培养板于室温下在黑暗中放置20分钟。 通过每孔中添加50 ii L硫酸(H2S04，4N)来终止酶促反应，随后测量每个孔中在490nm处的 0D。通过使用用于检测抗体的该方法，发明人发现，来自小鼠S2(用肽SEQ ID NO :4进 行免疫的)的血清对于BNP(1-32)和proBNP(1-108)是非常具有反应性的。在随后在来自 所述超免疫小鼠的淋巴细胞和Sp2骨髓瘤之间进行的淋巴细胞融合之后，该方法还使得可能鉴定出产生重要的单克隆抗体的杂交瘤产生所述20G7单克隆抗体的20G7杂交瘤。实施例5 :20G7单克隆抗体的表位表征5.1.根据“Spot”技术来讲行的表位表征5. 1. 1.材料设备和试剂全部列在C. Granier，S. Villard，D. Laune (Mapping and Characterization of Epitopes using the SPOTmethod.Cells/Cell Biology :A Laboratory Handbook,第三版(第 1 卷)，第 62 章，编辑Julio Celis, Elsevier, 2005)中。5. 1. 2 方法将“SPOT”或“表位作图”方法用于表征所述20G7单克隆抗体的表位。 Frank (Tetrahedron, 1992 ；48 :9217_32)所描述的该方法允许在纤维素膜上合成大量的具 有在官能化的支持物(氨基聚乙二醇-纤维素)上预先确定的序列的肽，并测试所述肽对 于可溶性配体(在本情况下为20G7抗体)的反应性。5. 1. 2. 1.肽的合成整个肽合成过程(氨基酸活化，化学反应等)详细描述于Molina等人 (Pept Res. 1996，Vol. 9 :pl51_5)禾口 C. Granier, S.Villard, D.Laune (Mapping and Characterization of Epitopes using theSPOT method.Cells/Cell Biology :A Laboratory Handbook,第三片反(第 1 卷)，第 62 章，编辑Julio Celis, Elsevier, 2005) 中。以重叠的十五肽(SEQ ID NO 12至20)的形式完整地合成了 BNP(1_32)序列，其 中采用两个氨基酸的偏移SEQIDNO12SPKMVQGSGCFGRKM
SEQIDNO13KMVQGSGCFGRKMDR
SEQIDNO14VQGSGCFGRKMDRIS
SEQIDNO15GSGCFGRKMDRISSS
SEQIDNO16GCFGRKMDRISSSSG
SEQIDNO17FGRKMDRISSSSGLG
SEQIDNO18RKMDRISSSSGLGCK
SEQIDNO19MDRISSSSGLGCKVL
SEQIDNO20RISSSSGLGCKVLRRo
还合成了下列的其他肽
SEQIDNO:21VQGSGCFGR
SEQIDNO:22SPKMVQGSGC
SEQIDNO:23MDRISSSSGLG
SEQIDNO:24RKMDRISEQ ID NO :25RKMDRISS。还以重叠的十肽(SEQ ID NO 1个氨基酸的偏移SEQ ID NO 26 SPKMVQGSGC
26至48)的形式合成了 BNP(l-32)序列，其中采用
SEQIDNO27PKMVQGSGCF
SEQIDNO28KMVQGSGCFG
SEQIDNO29MVQGSGCFGR
SEQIDNO30VQGSGCFGRK
SEQIDNO31QGSGCFGRKM
SEQIDNO32GSGCFGRKMD
SEQIDNO33SGCFGRKMDR
SEQIDNO34GCFGRKMDRI
SEQIDNO35CFGRKMDRIS
SEQIDNO36FGRKMDRISS
SEQIDNO37GRKMDRISSS
SEQIDNO38RKMDRISSSS
SEQIDNO39KMDRISSSSG
SEQIDNO40MDRISSSSGL
SEQIDNO41DRISSSSGLG
SEQIDNO42RISSSSGLGC
SEQIDNO43ISSSSGLGCK
SEQIDNO44SSSSGLGCKV
SEQIDNO45SSSGLGCKVL
SEQIDNO46SSGLGCKVLR
SEQIDNO47SGLGCKVLRR
SEQIDNO48GLGCKVLRRH。
还合成了七肽的选集(SEQ ID NO 49至53)，其中采用1个氨基酸的偏移
SEQIDNO49GCFGRKM
SEQIDNO50CFGRKMD
SEQIDNO51FGRKMDR
SEQIDNO52GRKMDRI
SEQIDNO53RKMDRIS。
5. 1.2. 2.免疫学测试
下面关于免疫反应性的测试已详细描述于Laune等人(J. Immunol. Methods2002, Vol. 267(l),p53-70)中。简而言之，其原理如下。通过三次TBS浴(tris-缓冲盐水
PH7. 0)使膜再水化，每次持续时间为10分钟，并随后通过在15ml 10%饱和缓冲液(“封闭 缓冲液”，Roche)和5%蔗糖(在TBS o. i%Tween 20(TBS-T)中)存在下在室温下温育 过夜进行饱和，同时进行搅拌。在将膜用0. 1%TBS-T以10分钟洗涤三次之后，将所述膜在 待测抗体(在该情况下是20G7)和与碱性磷酸酶相偶联的缀合物(用饱和缓冲液稀释)存 在下于37°C温育90分钟，同时进行搅拌。在将膜用0. 1 % TBS-T洗涤两次并然后用CBS (柠 檬酸盐缓冲盐水)洗涤两次(每次浴持续10分钟)之后，添加碱性磷酸酶底物并依据信号 出现的速度在室温下将膜温育1至30分钟。
5. 1.2. 3.结果
在本情况下，以重叠的十五肽(SEQ ID N0:12至20)的形式完整地合成了 BNP(l-32)序列，其中采用两个氨基酸的偏移。如图1中所示的，当将所述肽与纯化的20G7 抗体相接触时，个连续的肽与所述抗体反应，并且其共有的序列为FnGRKMDR17(图 1)SEQIDNO13K M VQGSGCFGRKMDR
SEQIDNO14VQGSGCFGRKMDR ]S
SEQIDNO15GsGCFGRKMDR ]SSS
SEQIDNO16GCFGRKMDR ]SSSSG
SEQIDNO17FGRKMDR ]SSSSG为了确保只有这个模式实际参与所述抗体与BNP(l-32)的结合，还合成了更短 的肽(十肽(SEQ ID N0:26至48)和七肽(SHQ ID NO :49至53))，其中采用仅一个氨基 酸的偏移，以便确认和验证所述表位。在每个实验中，由20G7所鉴定的共有的肽序列为 FnGRKMDR17(对于十肽而言，SEQ ID NO 33至36 ；和对于七肽而言，SEQ ID NO 51)。为了确定哪些残基对于该表位的识别来说是关键性的和必不可少的，将最小序列 FnGRKMDR17的每个残基连续地用丙氨酸(A)进行置换，以便根据“丙氨酸扫描”方法来评估 每个独个残基的参与程度，所述“丙氨酸扫描”方法是众所周知的并且已进行了描述(Laime 等人，见上)。如图2中所示的，当分别将残基Fn、K14和R17置换为丙氨酸时，结合下降82%、 95%和85%，这表明这些残基是必不可少的。位置11、14和17处的这些氨基酸对于所述表位被20G7单克隆抗体识别来说是必 不可少的。这些数据是多次(n = 4)重复实验的平均值。由于这个原因，因而清楚的是， 根据本发明的包含必不可少的Fn、K14和R17氨基酸的表位FnGRKMDR17不同于在专利申请 W02006/88700中所识别出的表位，所述专利申请W02006/88700公开了另一个表位(R13(K14) (M15) D16R17I18)，其的重要氨基酸是 R13、D16、R17 和 118。为了更好地理解这些残基对于20G7抗体的结合过程的贡献作用，用具有相近的 生物化学性质的氨基酸置换了氨基酸Fn、K14和R17。例如，用其他芳香族氨基酸(色氨酸和 酪氨酸)置换了 Fn。由这些“同源”氨基酸组成的序列以相同方式被20G7抗体识别这一事 实暗示，正是该肽在位置11处的芳香族性质对于抗体结合来说是必不可少的。关于K14和 R17，将它们都置换成精氨酸和赖氨酸以研究氨基酸的侧链及正电荷的存在的影响。在该情 况下还发现，置换是有效地保守的，因为保持了与20G7的结合，因而强调了正电荷的重要 性。相同的情况不适用于得自HyTest的24C5抗体，它具有不同的必不可少的残基。使用Spot方法，用20G7抗体测试了也在膜上合成的人BNP(l-32)的肽序列 VQGSGCFGR、SPKMVQGSGC、MDRISSSSGLG、R13KMDRUPR13KMDRISS2(i(SEQ ID N0:21 至 SEQ NO: 25)。因为对于20G7的结合来说必不可少的残基不存在，因此所述抗体根本不结合所述肽， 结果是20G7展示出少于2%的与这些肽的交叉反应。5. 2.用可溶性肽进行表征在第二步中，为了确保肽FnGRKMDR17确实是20G7抗体的表位，以可溶的形式合成 该序列以便进行在该肽和BNP(1-32)之间的竞争测定法。平行地，为了确认Fn残基在与 20G7抗体的结合中的高度贡献，还以可溶的形式合成了另外两种肽(在一种中F被置换为A，在另一种中F被简单地删除)。此外，用Hytest的24C5抗体进行了类似的竞争测定法， 以证明该残基的重要性对于20G7抗体来说是特异的。1-SEQ ID NO 51 天然表位的序列FnGRKMDR172-SEQ ID NO 62 该表位的经突变的序列AnGRKMDR173-SEQ ID NO 9 缺失了残基 Fn 的序列G12RKMDR175. 2. 1.材料-Maxisorp 96-孔平底微量培养板(Nunc，Denmark)-PBS (磷酸盐缓冲盐水)缓冲液，pH7. 4，Gibco 片剂，ref ； 18912-014 (Invitrogen)-BNP(l-32)合成肽(Sigma-Aldrich，USA，#B_5900)一 Tween 20(Sigma-Aldrich，USA, #P1379)-20G7 单克隆抗体(Bio-Rad)-24C5 单克隆抗体(HyTest，Turku, Finland)-在兔中产生的并与过氧化物酶相偶联的抗小鼠IgG二抗，(Sigma, USA, #A9044)-H202 (0 . 04%，在0. 1M柠檬酸盐缓冲液，pH4中)-0PD (邻苯二胺，Sigma, USA, #P8412)-硫酸(H2S04，4N)。5. 2. 2.方法该免疫测定法的原理与4. 2中所描述的相同。简而言之，将合成的BNP(l-32)在 PBS缓冲液中进行稀释，以便以0. 5 y g/ml直接固定在Maxisorp微量培养板上。在缓冲液 /血清中制备每种可溶性肽AA11-AA17(天然的、突变的或缺失的)的20至10，000ng/ml的 标准范围，并将其与100 yl单克隆抗体溶液(20G7或24C5抗体)相混合，以在含有0.1% 牛奶(半脱脂的)的PBS o. i%Tween 20(pbs-t)中的o.syg/mi的终浓度。然后，通过 用过氧化物酶标记的抗小鼠缀合物来检测所述抗体的结合。将20G7抗体的应答强度与得 自HyTest的24C5单克隆抗体的应答强度相比较。对于每种可溶性肽，测定在所述可溶性 肽存在下相应于BNP (1-32)识别的减少的抑制百分比，以便确定1)序列FnGRKMDR17有效地 代表了 20G7抗体表位，和2)残基Fn对于BNP(l-32)被20G7识别来说是必不可少的。5.2.3.结果图3描绘了在浓度渐增的可溶性肽(天然的SEQ ID NO :51，突变的SEQ ID NO 62，缺失的:SEQ ID NO 9)存在下，单克隆抗体(20G7或24C5)与BNP(1_32)的结合的抑制 百分比。非常值得注意的是，在突变的(SEQ N0 62)或缺失的(SEQ N0 9)可溶性 AA11-AA17肽存在下，在BNP(1-32)的识别方面本发明的20G7抗体的表现与24C5抗体明 显不同。添加突变的(AnGRKMDR17)或缺失的(G12RKMDR17)可溶性肽不抑制BNP(1_32)被 20G7识别，无论所添加的肽的浓度如何(直至20 y g/ml)，而当添加天然肽(相应于序列 SEQ ID N0:51的FnGRKMDR17)时，观察到完全抑制。这个实验证实了残基Fn在20G7抗体 与BNP(l-32)的结合中的重要性，这与24C5抗体的情况相反。实施例6 其他抗BNP (1-32)单克隆抗体的表位表征——与20G7抗体相比较6. 1.材料、方法和实验方案使用与实施例5中所描述的相同的硝化纤维素膜和相同的反应条件来研究这些抗体。6. 2.结果因此，发明人获得了一系列下面经表征的单克隆抗体20G7、llA8、17F10、Mabl、 Mab2和Mab3。如表1中所显示的，这些其他单克隆抗体具有与本发明的单克隆抗体20G7 相同的表位，即TORKMDR，但是相比于20G7而言，这些其他单克隆抗体具有不同的必不可少
的氨基酸。表1-单克隆抗体的表征 图4例如显示了关于11A8抗体的丙氨酸扫描分析(用丙氨酸连续置换序列 FnGRKMDR17的每个残基以评估每个残基的单独的意义，在上面在5. 1. 2. 3中所描述的方法) 的结果。四个残基(F、G、K和R)的置换导致序列FnGRKMDR17&结合的显著丧失，这证明它 们对于与BNP(l-32)的结合来说是必不可少的。实施例7 通过表面等离子共振技术来表征单克隆抗体的抗体_抗原相互作用7. 1.材料- BIAcore 2000 & 3000 分析仪(Pharmacia，Uppsala，Sweden)-BNP (1-32)(合成肽，Sigma，USA, #B_5900)-proBNP (1-108)(大肠杆菌中产生的重组蛋白质，HyTest，Finland)-抗Fc 片段抗体(Sigma，USA)-单克隆抗体2067、1认8、17卩10(810-1^(1，]\&11116818 Coquette, France)-pbs缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)，ph7. 4。7. 2.方法7. 2. 1.原理使用BIAcore 2000 & 3000分析仪(其原理基于表面等离子共振技术(spr)) 来确定20G7单克隆抗体及其他单克隆抗体与BNP(1-32)或proBNP(1-108)的相互作用的 动力学和亲和力。发明人遵循了制造商的说明书。表面等离子共振sra技术(BIAcore , Pharmacia)以其整体描述在Ferri社es 等人(2000, FEBS Letters, 479 (3) 99-105)中。通过使用抗Fc片段抗体将单克隆抗体固 定在生物传感器或固体表面上，同时使可溶性抗原(BNP(l-32)或proBNP(1-108))在室温 下以恒定的流速以渐增的浓度(0. 001256至0. 125ug/ml)在生物传感器的表面上进行循 环。检测到信号时所处的角度与隐失波在其中进行传播的介质的折光指数成正比。折光指数的变化表示为共振单位(RU，其中1000个共振单位相应于lng固定的蛋白质/mm2活 性区域)。抗原和单克隆抗体之间的相互作用和亲和力的定量通过下列方式来进行评估 通过使用制造商的软件 BIAevaluation(BIAcore ，Pharmacia，Uppsala, Sweden)进行 总体数据处理来计算缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。以mol/1表示的平衡解离 常数(KD = kd/ka)反映了抗原BNP (1-32)或proBNP (1-108)对于所述单克隆抗体的亲和 力。7. 2. 2.结果表2显示了抗BNP单克隆抗体(包括20G7)与所述两种重组抗原BNP(1_32)和 proBNP(1-108)之间的相互作用的特征。表2-各种抗BNP单克隆抗体与抗原BNP(l-32)和proBNP (1-108)之间的相互作 用 表2概括了不同的特征(缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)值，其允许计算 出BNP(l-32)或proBNP(1-108)与单克隆抗体之间的相互作用的平衡解离常数(以M表示 的KD))。相互作用的这些结果证实了用BNP(l-32)和proBNP(1-108)测定法获得的数据， 因为20G7单克隆抗体展示优异的缔合常数(ka)和低的解离常数(kd)，这允许其以1. 70-10M 的优异的亲和常数为特征，该亲和常数对于BNP (1-32)和proBNP (1-108)是相同的(表2)。对于其他单克隆抗体也提供了实例(11A8和17F10)，它们的亲和常数在nM范围内 (2 X 1(T10 至 9. 35 X 1(T10M，表 2)。实施例8 使用20G7单克隆抗体的BNP (1-32)测定法8. 1.材料-Maxisorp 96-孔平底微量培养板(Nunc，Denmark)-PBS (磷酸盐缓冲盐水)缓冲液，pH7. 4，Gibco 片剂，ref 18912-014 (Invitrogen)-BNP (1-32)合成肽(Sigma-Aldrich，USA, #B_5900)-proBNP (1-108)(在大肠杆菌中产生的重组蛋白质，HyTest，Finland)一 Tween 20 (Sigma-Aldrich, USA, #P1379)
-通过用靶向BNP(1-32)的区域1_10的免疫原对兔进行免疫而获得的L21016兔 多克隆抗体，其表位为BNP (1-32)的序列S1PKMV5 (SEQID NO 54)-20G7 单克隆抗体(Bio-Rad)
-24C5 和 26E2 单克隆抗体(HyTest，Turku, Finland)-在兔中产生的并与过氧化物酶相偶联的抗小鼠IgG抗体缀合物，(Sigma，USA, #A9044)-0· 04% H2O2，在0. IM柠檬酸盐缓冲液，pH4中-OPD (邻苯二胺，Sigma，USA, #P8412)-硫酸(H2SO4,4N)。8. 2.方法和原理起初，在缓冲液/血清中由合成的BNP (1-32)制备BNP (1-32)的20至10，OOOpg/ ml的标准范围。所述测定法基于在微量培养板上的夹心ELISA原理，其中使用L21016兔多克隆 抗体(Bio-Rad)用于在固相上进行捕获，其表位是BNP (1-32)的序列S1PKMV5，并且以每孔 100 μ 1 5μ g/ml溶液通过被动吸附而固定。使用100 μ 1单克隆抗体溶液(20G7、24C5或26E2抗体)作为检测试剂，所述单克 隆抗体溶液为以0.5 μ g/ml的浓度在含有0.1%牛奶(半脱脂的)的PBS ο. i%Tween 20 (PBS-T)缓冲液中的溶液。因此，将20G7的应答强度与24C5和26E2单克隆抗体的应答 强度进行比较。表3概括了 BNP (1-32)的分析测定法的结果，其表示为490nm处的光密度(OD)，并 且是在标准浓度的ΒΝΡ(1-32)存在下通过所述抗体而获得的。表3-在使用不同抗体的BNP (1-32)的分析测定法过程中获得的OD值 值得高度注意的是，24C5和26E2这两种抗体的表现与本发明的20G7抗体相当不 同。因此，这些结果证实，在后一种测定法形式中，对于BNP (1-32)测定法，20G7比24C5和 26E2抗体更适合得多。图5中所显示的且用20G7单克隆抗体获得的标准范围从20至10，000pg/ml是线 性的(r2 = 0. 96)。24C5和26E2这两种商业抗体在检测BNP(1_32)方面不是非常有效或 者根本无效，即使在高浓度的分析物的情况下(表3)。实施例9 在夹心ELISA中单克隆抗体的互补性的研究9. 1.材料-Maxisorp 96-孔平底微量培养板(Nunc，Denmark)，其通过识别BNP (1-32)的序 列SiPKMV5(SEQ ID NO 54)的L21016兔多克隆抗体(Bio-Rad)进行预先准备-PBS (磷酸盐缓冲盐水)缓冲液，pH7. 4，Gibco 片剂，ref 18912-014 (Invitrogen)- Tween 20 (Sigma-Aldrich, USA, #P1379)-BNP (1-32)合成肽(Sigma-Aldrich，USA, #B_5900)-proBNP (1-108)(在大肠杆菌中产生的重组蛋白质，HyTest，Finland)-以从0.001至1 ii g/ml的不同浓度制备的20G7抗体(其针对表位 FnGRKMDR17 (SEQ ID NO 8))-0. 5 u g/ml 的单一浓度的 50B7 单克隆抗体(HyTest，Finland)，其识别 BNP (1-32) 的C-末端部分。-在兔中产生的并与过氧化物酶相偶联的抗小鼠IgG二抗，(Sigma, USA, #A9044)-0. 04% H202 (在 0. 1M 柠檬酸盐缓冲液，pH4 中，Sigma, USA)-0PD (邻苯二胺，Sigma，USA, #P8412)-硫酸(H2S04，4N)。9. 2.方法9. 2. 1.原理本测定法基于在微量培养板上的夹心ELISA原理，其中使用L21016兔多克隆抗 体(Bio-Rad)用于在固相上进行捕获，其表位是BNP(l-32)的序列SfKM^ (SEQ ID NO: 54)并且通过被动吸附而固定(参见实施例8)，并且使用两种单克隆抗体(针对表位 FnGRKMDR17(SEQ ID NO 8)的20G7单克隆抗体和靶向BNP (1_32)的C-末端部分的50B7单 克隆抗体(HyTest，Finland))的组合用于进行检测。然而，以变化的浓度使用20G7抗体， 而同时以0. 5 u g/ml的恒定浓度使用50B7单克隆抗体。在变化的浓度的20G7抗体的情况下，研究20G7和50B7抗体的表位互补性。这一 形式允许评估这两种单克隆抗体的协同性，以便改善BNP(l-32)检测。9. 2. 2 实验方案向每个其中吸附了 L21016多克隆抗体的微量培养板孔中添加100 ill 5ng/ml BNP (1-32)溶液，并于37°C温育两小时。用0. PBS-T洗涤微量培养板三次，然后在其上 分配100 u 1含有50B7抗体和一种20G7抗体稀释物的混合物，并于37°C温育两小时。在 用0. 1 % PBS-T进行三次洗涤后，依照100 u 1/孔，使过氧化物酶-兔抗小鼠IgG抗体缀合 物(用含有0. 牛奶(半脱脂的)的0. PBS-T稀释至1/3，000)于37°C温育1小时。 最后，在用0. 1 % PBS-T进行3次洗涤后，依照100 u L/孔，放置H202+0PD溶液。将微量培养板于室温下在黑暗中放置20分钟。通过每孔中添加50 yL硫酸(H2S04，4N)来终止酶促 反应，随后测量每个孔中在490nm处的0D。9.2.3.结果表4显示了使用20G7和50B7单克隆抗体来进行的BNP的分析测定法的结果，其 表示为490nm处的光密度。表4-所述两种单克隆抗体对于检测BNP (1-32)的协同性 注意到，在这两种抗体之间存在有协同作用。换言之，注意到，这两种抗体的效应 是叠加的不存在20G7时，信号(0D)局限为1. 296，而加入的20G7越多，所产生的信号(0D) 增加得越多。通过使用根据本发明的靶向表位FnGRKMDR17(SEQ ID NO 8)(位于BNP(1_32)的环 内)的20G7单克隆抗体，和靶向BNP(l-32)的C-末端区域的50B7单克隆抗体，显著改善 了 BNP(l-32)的检测。这证明了在检测中所使用的这两种单克隆抗体的累积或协作贡献。在20G7单克隆抗体和识别位于BNP(1_32)序列的其他位置(主要是N_末端位 置、C-末端位置)处的表位的其他抗体之间也可以设想到这种类型的互补性。所使用的抗 体的数目也可大于二，只要不遇到位阻问题。实施例10 使用20G7单克隆抗体的proBNP (1-108)测定法10. 1.材料-BNP(l-32)合成肽(Sigma-Aldrich，USA, #B_5900)-proBNP (1-108)(在大肠杆菌中产生的重组蛋白质，HyTest，Finland)-Maxisorp 96-孔平底微量培养板(Nunc, Denmark)，其用识别 proBNP (1-108)铰 链序列表位RAra76S77P(SEQ ID NO 55)的单克隆抗体(铰链76抗体，例如，来自Bio-Rad) (Giuliani 等人，Clin. Chem. ,52 :6，1054-1061，2006)进行预先准备-与过氧化物酶相偶联的20G7单克隆抗体(Bio-Rad)-与过氧化物酶相偶联的24C5单克隆抗体(HyTest，Finland)-与过氧化物酶相偶联的26E2单克隆抗体(HyTest，Finland)-PBS (磷酸盐缓冲盐水)缓冲液，pH7. 4，Gibco 片剂，ref 18912-014 (Invitrogen)- Tween 20 (Sigma-Aldrich, USA, #P1379)。
10. 2.方法
10. 2. 1. proBNP (1-108)的分析测定法的原理起初，在0. 1 % PBS-T缓冲液中由重组的ProBNP (1-108)制备proBNP (1-108)的 20至10，000pg/ml的标准范围。所述测定法基于在微量培养板上的夹心ELISA原理，其中使用单克隆抗体(铰链 76抗体，例如，来自Bio-Rad)用于在固相上进行捕获，其识别proBNP(1-108)的铰链序列 表位RAPR76S77P (SEQ ID NO :55)，并且以每孔100 μ 1 0. 5 μ g/ml溶液通过被动吸附而固定。使用100 μ 1单克隆抗体溶液(20G7、24C5或26E2抗体)作为检测抗体，所述单克 隆抗体溶液为以0. 5 μ g/ml的浓度在0. 1 % PBS-T缓冲液(含有0. 1 %半脱脂牛奶)中的 溶液，并且所述单克隆抗体与过氧化物酶相偶联。除了该技术点之外，所述实验方案与实施例8中的ELISA实验方案相同。因此，将 20G7的检测特征与24C5和26E2单克隆抗体的检测特征相比较。表5显示了 proBNP (1-108)的分析测定法的结果，其表示为光密度(OD)，并且是在 标准浓度的proBNP(l-108)存在下通过使用所述抗体而获得的。10. 3.结果表5-使用不同抗体的proBNP(1-108)的分析测定法 值得高度注意的是，本发明的20G7抗体不仅检测出BNP(1_32)，而且还检测出 proBNP (1-108)。此外，一样地，在该情况下，这两种HyTest抗体的表现与20G7抗体相当不 同。这证实了 20G7抗体在BNP(1-32)和proBNP(1-108)测定法中的显著益处。图6图解说明了用20G7单克隆抗体而获得的proBNP的20至10，000pg/ml的 线性标准范围(r2 = 0.99，图6)，与此同时，来自HyTest的所述两种商业抗体在检测 proBNP (1-108)方面不是非常有效或根本无效，即使在高的proBNP (1-108)浓度的情况下 (表 5)。
实施例11 使用发明人获得的其他单克降抗体来讲行的proBNP (1-108)和 BNP(l-32)测定法表6显示了按照实施例8和10中的两个ELISA实验方案，使用11A8和17F10单 克隆抗体所产生的结果。当分别使用靶向iSPKMV5区域的兔多克隆抗体(L21016)或铰链76抗体用 于捕获时，在检测中所使用的这些经标记的单克隆抗体高度地能够检测BNP(l-32)和 proBNP(1-108)。表6显示了 proBNP (1-108)和BNP(1_32)的分析测定法的结果，其表示为光密度， 并且是分别在标准浓度的proBNP(1-108)和BNP(l-32)存在下通过所述抗体而获得的。表6-使用不同单克隆抗体的proBNP (1-108)和BNP(1_32)的分析测定法 值得高度注意的是，本发明的17F10和11A8抗体不仅检测出BNP (1-32)，而且还检 测出 proBNP (1-108)。实施例12 在患有充血性心力衰竭的受试者和正常受试者中的BNP(1_32)测定法 和 proBNP (1-108)测定法12. 1.样品-源自商业来源(ProMedex，NY,USA)的来自患有充血性心力衰竭的受试者的55 份EDTA血浆，这些受试者属于NYHA(纽约心脏协会)I至III类之一并且签署了自愿同意 表格。所研究的群体如下10位NYHA I类患者，21位NYHA II类患者，和24位NYHA III-来自正常受试者(健康志愿者，ProMedex,NY, USA)的48份EDTA血浆。12.2.用于BNP(l-32)和proBNP(1-108)测定法的材料和方法
所使用的材料和方法与上面在8.2中关于BNP(l-32)所描述的，以及与上面在 10. 2中关于proBNP (1-108)所描述的相同。12. 3.结果12.3.1.在充血件心力衰竭患者中BNP (1-32)和proBNP (1-108)测定法的结果发现借助于在8. 2中公开的BNP(1_32)测定法从充血性心力衰竭患者的血浆获得 的BNP(l-32)值与根据本发明的proBNP(1-108)测定法的那些值相关(r2 = 0. 935，图7)。更详细地，当根据其NYHA类别对患者进行研究时，相关性得到保持(对于NYHA I、 II 和 III 类分别为 r2 = 0. 997，r2 = 0. 903，r2 = 0. 832，分别为图 8A、B 禾口 C)。因此，用20G 7抗体的这些结果再次证实了 BNP(1_32)或者proBNP (1-108)测定 法作为充血性心力衰竭的标志物的有用性。使用经标记的形式的24C5和26E2抗体(HyTest)重复了这些实验，但是没有观察 到相关性。12. 3. 2.健康警试者中BNP(l-32)和proBNP (1-108)测定法的结果发现借助于proBNP(l-108)测定法(其中使用在固相中的铰链76单克隆抗体和 用于检测的20G7抗体-过氧化物酶缀合物)从健康受试者的血浆获得的proBNP(l-108) 值与在检测中使用20G7抗体的BNP(l-32)测定法的那些值高度相关(r2 = 0. 702)(图9)。总之，因此非常清楚，根据本发明的20G7抗体完全适合于在患有充血性心力衰竭 的患者中的BNP(l-32)和proBNP (1-108)测定法，其中通过在患有充血性心力衰竭的患者 中检测到相比于健康受试者而言更高的量的BNP(l-32)和proBNP (1-108)(表7)。表7 实施例13 在患有肾衰竭的患者中的BNP(l-32)和proBNP (1-108)测定法13. 1.样品源自法国蒙彼利埃Lapeyronie医院的33位已签署了自愿同意表格的肾衰竭患者 的EDTA血浆。13. 2.用于BNP(l-32)和proBNP(1-108)测定法的材料和方法所使用的材料和方法与上面在8. 2中关于BNP(1_32)所描述的和在10. 2中关于 proBNP (1-108)所描述的相同。13. 3.结果发现借助于proBNP(l-108)测定法(其中使用在固相中的铰链76抗体和用于检 测的20G7抗体-过氧化物酶缀合物)从肾衰竭患者的血浆获得的proBNP(l-108)值与使 用根据本发明的20G7抗体的BNP(l-32)测定法的那些值强烈相关(r2 = 0. 899)(图10)。 根据本发明的20G7抗体高度适合于肾衰竭患者中的BNP(l-32)和proBNP (1-108)测定法。
实施例14 在缺血性中风患者中的proBNP (1-108)测定法14. 1.患者样品
-测试了来自在中风发作3小时内被急诊部接纳的缺血性中风患者的32份含柠檬 酸盐的血浆样品。通过国立卫生研究所中风量表(National Institutes of Health Stroke Scale, NIHSS)来评估中风严重度。_测试了来自看起来健康的供血者的42份含柠檬酸盐的血浆样品，所述看起来健 康的供血者根据性别和年龄与中风群体的患者相匹配。将所有含柠檬酸盐的样品贮存于-80°C。在分析之前，将样品解冻，并且于4°C以 3000g离心15分钟。14. 2.材料和方法所有的样品都使用BioPleXTM2200proBNP测定法(Bio-Rad)进行测试。14. 2. 1.该技术的原理BioPlex 2200结合了多重磁性珠和流式细胞术技术以提供在完全自动化随机存 取平台上的多分析物检测。用两种荧光团(分类染料，CLl和CL2)对磁性颗粒(8μπι直径， 羰基_修饰的表面)进行染色，所述两种荧光团在不同的波长处发射并且在635nm处显著 吸收。因其高的摩尔消光系数、量子产率、对光漂白的抗性、没有自猝灭和稳定性而选择了 报道分子荧光团，β _藻红蛋白(PE)。检测器同时测量在三个波长处的光所述两种分类染 料和所述报道分子染料。14. 2. 2. BioPlexa2200proBNP 测定法原理BioPlex 2200proBNP测定法是两步夹心荧光免疫测定法。在第一步中，BioPlex 2200系统将50 μ L患者样品、用抗-proBNP (1-108)单克隆抗体(识别表位RAPR76S77P (SEQ ID NO 58)的铰链76单克隆抗体，Bio-Rad)包被的经染色的磁性珠和测定法缓冲液合并 入反应容器中。然后，在11分钟的温育和洗涤循环后，添加与藻红蛋白(PE)相缀合的抗人 BNP单克隆抗体20G7，并温育2分钟。在去除过量的缀合物后，使该珠混合物经过检测仪， 所述检测仪通过PE的荧光而鉴定出经染色的珠以及被捕获在珠上的抗原的量。在使用一 组六种不同的校准剂进行校准后，将三个水平的质量控制和患者样品的结果表示为pg/mL。还用每种样品测试了两种质量控制珠以提高整个系统的完整性。14. 3.结果表8和图11中显示了关于对照和缺血性中风群体的BioPlex 2200proBNP值的分 布。缺血性中风组中proBNP(1-108)的水平相比于对照组而言显著更高(Mann-Whitney，ρ < 0. 0001)。所述结果证明，proBNP (1-108)对于缺血性中风的早期诊断来说也是有用的血 浆生物标志物。表8-在缺血性中风和对照的含柠檬酸盐的血浆样品中BioPlex 2200proBNP浓
度(最小值，Ist四分位值，中值，3rd四分位值和最大值) 发明人清楚地证明，使用本发明中所描述的单克隆抗体20G7 Wpr0BNP(I-IOS)夹 心测定法可以测量中风患者中的proBNP(l-108)浓度。实施例15 在急性冠状动脉病症患者中的proBNP (1-108)测定法15. 1.样品-源自商业来源(ProMedex，NY,USA)的27位急性冠状动脉病症患者(其肌钙蛋 白I血浆平均值达到12. 5 士6. 9ng/ml)的EDTA血浆-来自48位健康受试者(健康志愿者，ProMedex,NY, USA)的EDTA血浆15. 2.材料和方法用于BNP (1-32)测定法的材料和方法与上面在8. 2中所描述的，以及在10. 2中关 于proBNP (1-108)所描述的相同。15. 3.结果发现借助于上述proBNP(1-108)测定法从被急诊科接纳并被诊断为急性冠状 动脉病症的患者的血浆获得的ProBNP(I-IOS)值与通过使用根据本发明的20G7抗体的 BNP (1-32)测定法而获得的那些值强烈相关(r2 = 0. 956)(图12)。急性冠状动脉病症患者 的 BNP (1-32)和 proBNP (1-108)水平(对于 proBNP (1-108)和 BNP (1-32)分别为 668士619 和1，518 士 l，533pg/ml，并且根据本发明进行测定)高于健康受试者(对于proBNP (1-108) 和BNP (1-32)分别为37士32和227士 172pg/ml，并且根据本发明进行测定)。因此，非常清楚，使用根据本发明的20G7抗体(与过氧化物酶相偶联)的夹心测 定法允许测量与BNP(1-32)的水平成比例的proBNP(1-108)浓度。这些结果再次证明了测 定作为标志物(特别是作为急性冠状动脉病症的标志物)的proBNP (1-108)和BNP(1_32) 的有用性。实施例16 使用20G7单克隆抗体来测定糖基化形式的proBNP (1-108)16. 1.材料-proBNP(l-108)(对于非糖基化的形式，为在大肠杆菌中产生的重组蛋白质； 和对于糖基化的形式，为从经程序重编的HEK293细胞中产生的重组蛋白质，HyTest， Finland)-Maxisorp 96-孔平底微量培养板(Nunc, Denmark)-PBS (磷酸盐缓冲盐水)缓冲液，pH7. 4，Gibco 片剂，ref 18912-014 (Invitrogen)
- Tween 20(Sigma-Aldrich，USA, #P1379)-铰链76单克隆抗体，其识别proBNP(1-108)的铰链序列表位RAPR76S77P (SEQ ID NO 55) (Giuliani 等人，Clin. Chem. ,52 :6，1054-1061，2006)-与过氧化物酶相偶联的20G7单克隆抗体(Bio-Rad)16. 2.方法16. 2. 1.糖基化的proBNP的分析测定法的原理在0. 1 % PBS-T缓冲液中制备糖基化的proBNP(1-108)的20至10，000pg/ml的 标准范围。以相同方式在0. PBS-T缓冲液中制备非糖基化的proBNP(l-108)的20至 10, 000pg/ml的标准范围。所述测定法基于在微量培养板上的夹心ELISA原理，其中使用单克隆抗体(铰 链76抗体，来自Bio-Rad)用于在固相上进行捕获，其识别proBNP(1-108)的表位序列 RAPR76S77P (SEQ ID NO 55)，并且以每孔100 yl 0. 5 u g/ml溶液通过被动吸附而固定。使用100 yl与过氧化物酶相偶联的根据本发明的20G7单克隆抗体溶液作为 检测试剂，所述单克隆抗体溶液为以0. 5 y g/ml的浓度在含有1 %牛奶(半脱脂的)的 0. PBS-T中的溶液。该实验方案的其余部分与实施例10中的ELISA相同。因此，对于 proBNP(1-108)的两种形式(糖基化的和非糖基化的)，比较了 20G7抗体的检测特征。16. 3 . 结墨表9和图13中显示的结果相应于糖基化的proBNP (1-108)和非糖基化的 proBNP (1-108)测定法，所述测定法借助于使用固定的铰链76抗体和用于检测的20G7抗体 的免疫测定法。表9-来自每种所测试的proBNP (1-108)形式的测定法的在490nm处的光密度值 通过使用20G7，可以检测非糖基化形式以及糖基化形式的proBNP(1_108)。非糖 基化的proBNP的信号/背景比相比于其糖基化形式而言略大(在20pg/ml时获得的信号 /背景比分别为3和1.8)。实施例17 以其糖基化形式的proBNP (1-108)的免疫反应性以及对于使用铰链76 抗体的proBNP (1-108)测定法的意义17. 1.材料-ProteOn XPR36分析仪(表面等离子共振SPR技术，Bio-Rad, USA)-糖基化和非糖基化形式的proBNP(1-108)(重组蛋白质，HyTest，Finland) (13至 200nM)-抗Fc 片段抗体(Sigma，USA)-铰链76单克隆抗体(Bio-Rad)，其识别表位RAPR76S77P(SEQ IDN0 55)，并且以在 0. 1% PBS-T中的30 ii g/ml的浓度进行使用-PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)，pH7. 417. 2.方法17. 2. 1.原理使用ProteOn XPR36分析仪(其原理基于表面等离子共振技术(SPR))来确定 20G7单克隆抗体与糖基化和非糖基化的proBNP(1-108)形式的相互作用的动力学和亲和 力。发明人遵循了制造商的说明书。通过使用抗Fc片段抗体将单克隆抗体固定在生物传 感器(固体表面)上，同时使糖基化或非糖基化的可溶性抗原proBNP(l-108)在室温下以 恒定的流速以渐增的浓度(13至200nM)在生物传感器的表面上进行循环。检测到SH 信 号时所处的角度与隐失波在其中进行传播的介质的折光指数成正比。折光指数的变化表示 为共振单位(RU，其中1000个共振单位相应于lng固定的蛋白质/mm2表面区域)。抗原和 单克隆抗体之间的相互作用和亲和力的定量通过下列方式来进行评估通过使用设备软件 (Bio-Rad)进行总体数据处理来计算缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)。以mol/1 表示的平衡解离常数(KD = kd/ka)反映了糖基化或非糖基化的proBNP(1-108)抗原对于 所述单克隆抗体的亲和力。17. 2. 2.结果表10显示了抗铰链抗体(具有表位RAPR76S77P(SEQ ID NO :55)的铰链76抗体， Bio-Rad)与糖基化和非糖基化的proBNP (1-108)之间的相互作用的特征。虽然抗铰链抗体 与非糖基化的proBNP(1-108)之间的亲和常数(1.73X10_1(I)大于抗铰链抗体与糖基化的 proBNP (1-108)之间的亲和常数(2. 35X 10_8)，但是靶向proBNP (1-108)的铰链区的该抗体 均以高亲和力识别糖基化和非糖基化的形式。表10-铰链76抗体对于糖基化和非糖基化的proBNP (1-108)的反应性 实施例18 双表位和三表位校准剂18. 1.根据本发明的所有双表位或三表位校准剂的结构可以是线性的或支化的， 条件是保持了所引入的表位的免疫反应性。可用于产生这些校准剂的合成方案是在肽有机化学领域中为本领域技术人员所 熟知的那些(在该情形下，参见实施例1中的“肽的合成”)。对于表位E2和E3，根据本发明的线性肽序列可以以非限制性的方式选自下列序 列SEQIDNO56:PRSPKMVQG
SEQIDNO57:APRSPKMV
SEQIDNO58:SGLGCKLV
SEQIDNO59:SPKMVQGSG
SEQIDNO60:YTLRAPRSPKMVG018.2.根据本发明的合成的表位的实例发明人合成了下列校准剂18. 2. 1.双表位校准剂CaliproBNPl :Ac-YTLRAPRSPKMV-Ahx-SFGRKMDRISS-CONH2CaliproBNP2 :Ac-YTLRAPRSPKMV-Ahx-CFGRKMDRISSSSGLGCK-CONH,CaliProBN P3 :Ac-YTLRAPRSPKMVQG-Ahx_FGRKMDR-CONH2这三种双表位校准剂可用于校准proBNP (1-108)测定法(如上面在10. 2中所描 述的)，所述测定法例如基于在固相上固定识别RAPRSP(SEQ ID NO 55)的铰链76单克隆 抗体(Giuliani等人，同上)，以及在检测中使用20G7单克隆抗体-过氧化物酶。CaliproBNP4 :Ac-FGRKMDR-Ahx_SGLGC * KVLRRH-C00HCaliproBNP4b :Ac-FGRKMDR-Ahx_SGLGC * KVLR-C0NH2这两种双表位校准剂可用于校准BNP(l-32)测定法，所述测定法例如基于在 固相上固定针对BNP(l-32)的C-末端部分的单克隆抗体，例如单克隆抗体50B7或 50E1 (HyTest, Finland)，以及在检测中使用20G7单克隆抗体-过氧化物酶。CaliproBNP5 :Ac-SPKMVQGSG-Ahx_FGRKMDR-CONH2该双表位校准剂可用于校准BNP(l-32)测定法(如上面在8. 2中所描述的)，所述 测定法例如基于在固相上固定多克隆抗体L21016(Bio-Rad)，以及在检测中使用20G7单克 隆抗体-过氧化物酶。在上面所描述的校准剂序列中，Ahx基团的结构式是NH-(CH2)5-C0。式-NH-(CH2)5-C0-的连接基团源自众所周知的偶联剂，氨基己酸(AHX)，其使得能够将两个肽序列共价偶联在一起。C* = C(Acm)=用乙酰胺基甲基(保护基团，本领域技术人员所熟知的)封闭的半 胱氨酸。18. 2. 2.三表位校准剂CaliproBNP6 :Ac-YTLRAPRSPKMV-Ahx-FGRKMDR-Ahx_SGLGC * KVLRRH-C00HCAliproBNP6b :Ac-YTLRAPRSPKMV-Ahx-FGRKMDR-Ahx_SGLGC * KVLR-C0NH2这两种三表位校准剂可用于校准proBNP (1-108)和BNP(1_32)测定法，所述测 定法例如使用诸如下列的抗体识别序列RAPRSP(SEQ IDN0 55)的铰链76单克隆抗体 (Giuliani等人，同上)，以及本发明的20G7单克隆抗体和具有针对BNP(1_32)的C-末端 部分的表位的抗体。18. 3.材料和方法为描绘这些校准剂的有用性，校准和稳定性的结果以两种不同的形式进行展示， BioPlex 测定法和ELISA测定法。-借助于实施例14中所描述的BioPlex 2200proBNP测定法来测试CaliproBNPl 和CaliproBNP3化合物这些proBNP (1-108)双表位。-借助于实施例8. 2中所描述的测定法来测试Cal iproBNP5化合物这种 BNP(l-32)双表位，和借助于实施例10. 2中所描述的测定法来测试CaliproBNP6化合物这
种三表位。18.4.实验方案以在0. 1M琥珀酸盐缓冲液(pH7. 6)中稀释的不同浓度来测试不同的化合物，所 述琥珀酸盐缓冲液含有5% BSA、2mM CaCl2、10%抗蛋白酶混合物(Sigma参考号P2714)、 0. 1% Proclin、0. 095% NaN3 和 0. 苯甲酸钠。在同样的0. 1M琥珀酸盐缓冲液(pH7. 6)中，将校准剂CaliproBNPl稀释为1 y g/ mL、0. 2 u g/mL、0. 1 u g/mL 禾口 0. 02 u g/mL,将校准剂 CaliproBNP3 稀释为 1. 6u g/mL、 0. 8u g/mL、0. 3 u g/mL、0. 06 u g/mL，将校准剂 CaliproBNP5 和 CaliproBNP6 稀释为 100ng/ ml 至 0.01ng/ml。以如下方式，相比于合成的 BNP (1-32) (Sigma-Aldrich，Etats-Unis，#B-5900)和 重组的proBNP (1-108) (HyTest Ref. 8PR08)，在加速的条件(室温)下研究了所述化合物的
稳定性在上面描述的0. 1M琥珀酸盐缓冲液(pH7. 6)中稀释重组的proBNP (1-108)、合成 的BNP(l-32)和校准剂肽。将每种溶液分成10管并置于室温(20°C 士5°C)。然后，将一管 每种溶液于JO、J+7、J+14、J+21进行冷冻。在J+21，解冻不同的溶液，并借助于实施例14 中所描述的BioPlexTM2200proBNP测定法或者实施例8. 2和10. 2中所描述的免疫测定法来 进行测定。在ELISA 测定法中，测试了 范围从 25ng/mL 至 0. 04ng/mL 的 proBNP (1-108)、 BNP (1-32)和 CaliproBNP60 对于 CaliBNP4 和 CaliBNP5,所测试的范围为从 2ng/mL 至 0.004ng/mLo在BioPleXTM2200proBNP测定法中，分析了两种浓度的下列物质的稳定 性:proBNP(1-108),10ng/mL 禾口 Ing/mL ；CaliproBNPl,2u g/mL 禾口 0.125u g/mL ；和Cal iproBNP3,1 μ g/mL和0. 3 μ g/mL。在ELISA形式中，分析了三种浓度的下列物质 proBNP(1-108)禾口 BNP(1-32)，1. 56ng/mL、0. 78ng/ml 禾口 0. 39ng/mL ；禾口 CaliproBNP5， 62. 5pg/mL、31ng/mL 禾口 15. 6ng/mL。18.5.结果18. 5. 1.在 BioPlex 2200proB NP 测定法中的校准剂 CaliproBNPl 和 CaliproBNP3在不同浓度的范围内的CaliproBNPl和CaliproBNP3化合物的测定法的结果分别 展示在图14和15中。在BioPlex 2200proBNP 测定法中，CaliproBNPl 和 CaliproBNP3 化合物使得能够 随着化合物浓度而产生增加的信号。因此，这些化合物一旦对于proBNP (1-108)分子进行 标准化，便可用作proBNP(1-108)测定法的校准剂。表11中展示了在不同浓度的范围内的重组的proBNP(l-108)以及化合物 CaliproBNPl和CaliproBNP3的加速的稳定性测试的结果。表11 *稳定性的接受标准为了使在JO后第X天时的稳定性可接受，“J0+X时的信号/ JO时的信号”这一比率必须等于1. 00 士0. 2。** 室温20°C 士5°C。***0. IM琥珀酸盐缓冲液(pH7. 6)，其含有5% BSA、2mM CaCl2、10%抗蛋白酶混合物 (Sigma 参考号 Ρ2714)、0· 1% Proclin.O. 095% NaN3 和 0. 苯甲酸钠。双表位校准剂CaliproBNPl和CaliproBNP3清楚地显示出比重组的 proBNP (1-108)更高的稳定性。18.5.2.在基于使用20G7抗体的免疫测定法中的校准剂Cal iproBNP5和 CaliproBNP6在不同浓度的范围内的CaliproBNP5和CaliproBNP6化合物的测试的结果分别展 示在图16和17中。在BNP (1-32)和proBNP (1-108)测定法中，双表位化合物CaliproBNP5和三表位 化合物CaliproBNP6使得能够随着化合物浓度而产生信号增加。因此，这些化合物可用作proBNP(1-108)和BNP(l-32)测定法的校准剂。表12中展示了在不同浓度的范围内的重组的proBNP(1-108)、BNP(1_32)和化合 物CaliproBNP5的加速的稳定性测试的结果。表 12 *稳定性的接受标准为了使在J0后第X天时的稳定性可接受，“J0+X时的信号/ J0时的信号”这一比率必须等于1. 00 士0. 2。** 室温20°C 士5°C。***0. 1M琥珀酸盐缓冲液(pH7. 6)，其含有5% BSA、2mM CaCl2、10%抗蛋白酶混合物 (Sigma 参考号 P2714)、0. 1% Proclin、0. 095% NaN3 和 0. 苯甲酸钠。再次地，双表位校准剂CaliproBNP5展示出比重组的proBNP (1-108)和BNP (1-32) 更高的稳定性。序列一览表
权利要求
携带人BNP(1-32)表位的多肽，其具有式(I)a1-R1-X1-FGRKMDR-X2-R2-a2(I)其中-a1可以为H或者表示选自下列的官能团或化学基团硫醇、醇、氨氧基、伯胺或仲胺官能团，氨基羧基基团，生物素基基团和乙酰基基团；-a2可以表示OH、NH2官能团或烷氧基基团；-X1不存在或存在，并且当存在时，其选自C和GC；-X2不存在或存在，并且当存在时，其选自I和IS；-R1和R2，可以是相同或不同的，存在或不存在的，并且其表示任何氨基酸或者2至15个氨基酸的肽链，条件是式(I)的所述多肽不包括含有序列GCFGRKMDRIS的超过11个氨基酸的人BNP(1-32)的任何部分。
2.根据权利要求1的多肽，所述多肽选自^-SGCFGRKMDR-^(SEQID NO 33)、a「GCFGRKMDRI-a2(SEQ ID NO :34)、a「CFGRKMDRIS-a2 (SEQ ID NO 35)禾口 arFGRKMDRISS-a2 (SEQ ID NO :36)，其中a,和a2如在权利要求1中所定义的。
3.根据权利要求1的多肽，其具有式(II) ai-FGRKMDR-a2(II) 其中ai和a2如在权利要求1中所定义的。
4.根据权利要求1至3中任一项的多肽的用途，所述用途为用于制备针对人 BNP(l-32)或人proBNP (1-108)以及包含序列TORKMDR的其各自片段的配体。
5.根据权利要求4的用途，所述用途为用于制备抗体。
6.根据权利要求1至3中任一项的多肽的用途，所述用途为用于制备分泌针对人 BNP (1-32)或人proBNP (1-108)以及包含序列TORKMDR的其各自片段的单克隆抗体的杂交瘤。
7.用于制备杂交瘤的方法，所述杂交瘤分泌针对人BNP(1-32)或人proBNP (1-108)以 及包含序列TORKMDR的其各自片段的单克隆抗体，其中-从用根据权利要求1至3中任一项的多肽进行免疫的动物中获取分泌免疫球蛋白的 淋巴细胞的样品；-将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞相融合； 从而获得杂交瘤。
8.通过在权利要求7中所定义的方法可获得的杂交瘤。
9.于2007 年 4 月 13 日以登录号 CNCM 1-3746 保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux,75 724 Paris Cedexl5, France)的杂交瘤。
10.对于序列TORKMDR的表位来说特异的配体。
11.根据权利要求10的配体，其选自识别该表位的抗体或所述抗体的片段、适体、和通 过噬菌体展示可获得的特异性地识别该表位的多肽。
12.根据权利要求10或11的配体，其由下列构成特异性地识别序列TORKMDR的表位 的抗体，或者特异性地识别该表位的所述抗体的片段。
13.根据权利要求12的配体，其中所述抗体是单克隆抗体。
14.根据权利要求13的配体，其中所述单克隆抗体是由根据权利要求8或9的杂交瘤 产生的。
15.根据权利要求10至14中任一项的配体，其由单克隆抗体构成，所述单克隆抗体 由于 2007 年 4 月 13 日以登录号 CNCM 1-3746 保藏于 CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur,25, rue du Docteur Roux,75 724 Paris Cedexl5, France)的杂交瘤产生。
16.根据权利要求10至14中任一项的配体，其拥有在权利要求15中所定义的配体的 至少一个互补决定区(⑶R)。
17.根据权利要求10至16中任一项的配体的用途，所述用途为用于在生物学样品中检 测人BNP(l-32)或人proBNP (1-108)以及包含序列TORKMDR的其各自片段。
18.用于在生物学样品中检测人BNP(l-32)或者包含序列TORKMDR的人 proBNP(1-108)的衍生物的方法，所述方法包括1)在允许形成抗原_配体复合物的条件下，使所述生物学样品与至少一种在权利要求 10至16中任一项之中所定义的配体相接触，和2)检测任何可能已形成的复合物。
19.根据权利要求18的方法，所述方法包括至少一个另外的步骤，所述另外的步骤为 使所述生物学样品与至少一种另外的配体相接触，所述另外的配体对于人BNP(l-32)、人 proBNP (1-108)或其各自片段来说是特异的，并且具有与在权利要求10至16中任一项之中 所定义的配体的特异性不同的特异性。
20.根据权利要求19的方法，其中所述另外的配体是抗体。
21.对于个体中至少一种心脏和/或血管病理学状态进行诊断、预后、风险分级或治疗 追踪的方法，所述方法包括下列步骤1)在允许形成抗原-配体复合物的条件下，使来自所述个体的生物学样品与至少一种 在权利要求10至16中任一项之中所定义的配体相接触，2)检测任何可能已形成的复合物，和3)基于步骤2中的检测的结果，确定所述个体中所述病理学状态的诊断、预后、形成风 险或治疗追踪。
22.根据权利要求21的方法，所述方法包括至少一个另外的步骤，所述另外的步骤为 使所述生物学样品与至少一种另外的配体相接触，所述另外的配体对于人BNP(l-32)、人 proBNP(1-108)或其各自片段来说是特异的，并且具有与在权利要求10至16中任一项之中 所定义的配体的特异性不同的特异性。
23.根据权利要求22的方法，其中所述另外的配体是抗体。
24.根据权利要求21至23中任一项的方法，其中所述病理学状态选自-充血性心力衰竭，-急性冠状动脉综合征，-脑血管意外，-肾衰竭，-呼吸困难，-高血压，“动脉粥样化斑块破裂， “早产新生儿中的动脉导管未闭，和/或 -糖尿病。
25.具有下述通式(III)的多表位校准剂 t1-E1-L1-E2[-Lk_1-Ek]n-t2(HI) 其中-n是在0和8之间的整数；-k是在3和n+2之间的整数，当n > 0时；-Ei、E2和Ek彼此不同，一个表示RfXi-reRKMDR-X^I^肽序列，其中X!、X2、队和R2如在 权利要求1中所定义的，并且其他表示选自人proBNP(l-108)的序列的3至15个氨基酸的 序列；表示氢原子、乙酰基基团、1至10个氨基酸的肽序列、1至10个N- a乙酰化的氨基 酸的肽序列、生物素基或生物胞素基基团、带有生物素基或生物胞素基基团的1至10个氨 基酸的肽序列、或者线性的氨基烷基(CfCj羰基链；-t2表示羟基基团、氨基基团、1至10个氨基酸的肽序列、带有末端氨基基团的1至10 个氨基酸的肽序列、或者线性或支化的氨基烷基(q-cj羰基链； -L和Lk，可以是相同或不同的，并且其表示肽链的连接基团。
26.根据权利要求25的多表位校准剂，其相应于下述通式(IV) t1-E1-L1-E2-t2(V)其中E” E2、L” 和t2如在权利要求25中所定义的。
27.根据权利要求25或26的多表位校准剂，其中k和L2表示 -NH- (CH2)5-C0-。
28.根据权利要求27的多表位校准剂，其选自由下列式定义的多表位校准剂 Ac-YTLRAPRSPKMV-Li-SFGRKMDRISS-N^ ； Ac-YTLRAPRSPKMV-Li-CFGRKMDRISSSSGLGCK-N^ ； Ac-YTLRAPRSPKMVQG-Li-FGRKMDR-N^ ； Ac-FGRKMDR-LfSGLGCfKVLRRH-OH ； Ac-FGRKMDR-Li-SGLGC^VLR-N^ ； Ac-SPKMVQGSG-Li-FGRKMDR-N^ ； Ac-YTLRAPRSPKMV-LfFGRKMDR-LfSGLGCfKVLRRH-OH ；禾口 Ac-YTLRAPRSPKMV-LfFGRKMDR-I^-SGLGCfKVLR-M^ ；其中Ac表示乙酰基基团，和C*表示用乙酰胺基甲基封闭的半胱氨酸。
29.用于检测人BNP(1-32)或人proBNP (1-108)以及包含序列TORKMDR的其各自片段 的试剂盒，所述试剂盒至少包含-在权利要求10至16中任一项之中所定义的配体；和 -在权利要求25至28中任一项之中所定义的多表位校准剂。
全文摘要
本发明涉及根据式(I)(a1-R1-X1-FGRKMDR-X2-R2-a2)的携带人BNP(1-32)表位的多肽，以及对于该FGRKMDR表位来说特异的配体。
文档编号G01N33/68GK101878225SQ200880105598
公开日2010年11月3日 申请日期2008年8月1日 优先权日2007年8月3日
发明者F·里尼尔, I·朱利亚尼, S·维拉德-索西尼 申请人:比奥-拉德巴斯德公司;国家科研中心