专利名称：：一种血清自身抗体用于食管鳞癌诊断的方法
技术领域：
：本发明发现和验证了一种新的食管鳞癌(ESCC)肿瘤标志物一血清CDC25B自身抗体，并建立了反向ELISA技术检测血清CDC25B自身抗体的方法，用于食管鳞癌的诊断。
背景技术：
：食管鳞癌(ESCC)是食管癌中最常见的类型，是我国第四大引起死亡的肿瘤。早期诊断是提升癌症治愈率的关键"但由于早期临床症状不明显，且缺乏好的早期诊断指标和筛查技术，一般确诊时食管鳞癌都为晚期。目前，依据肿瘤早期，肿瘤细胞产生的极微量抗原(目前还未有好的技术能够检测到)，但可被机体免疫系统识别，产生特异的肿瘤抗原抗体，因此检测此抗体(通过免疫系统的放大作用，很容易检测到)可间接反应肿瘤抗原存在。许多研究也表明肿瘤患者针对肿瘤抗原产生的自身抗体是肿瘤早期诊断的最好的指标，早期诊断的灵敏度和特异性均要优于目前临床上使用的肿瘤细胞产生的肿瘤标志物。在食管鳞癌患者血清中已经发现p53，cytokeratins，myomegalin，TRIM21等蛋白自身抗体，其中对血清中P53抗体的研究较深，发现其可以作为食管癌早期诊断和预后指标。最近，通过血清学蛋白质组技术在ESCC患者血清中筛选出peroxiredoxinVI自身抗体，此抗体在ESCC中的检出率为50%，可作为食管癌早期诊断指标。目前，基于肿瘤抗原引发的体液免疫反应寻找肿瘤标志物有多种方法，血清学蛋白质组是一种有效和可靠的技术，其优势在于确定的肿瘤蛋白抗原为自然状态下的肿瘤组织或肿瘤细胞的肿瘤抗原。
发明内容本发明应用血清学蛋白组技术筛选食管磷癌患者血清中肿瘤抗原自身抗体。首先，用2-DPAGE电泳分离ESCC组织中的蛋白，转移到PVDF膜上，然后用病人血清和健康人血清做为一抗，westernblot检测肿瘤蛋白反应点，挑选只与肿瘤病人血清反应而不与正常人血清反应的蛋白点，质谱鉴定其氨基酸序列。利用此技术，从食管磷癌患者血清中首次筛选出CDC25B自身抗体，并验证其特异性。并证实CDC25B自身抗体可作为食管磷癌诊断的肿瘤标志物。最后建立了简便的反向ELISA技术检测血清CDC25B自身抗体的方法。具体实施方式(实验中所用组织及血清来源于中山大学肿瘤医院)1.发现和验证了一种新的食管鳞癌(ESCC)肿瘤标志物一血清CDC25B自身抗体1).筛选针对食管癌鳞组织肿瘤蛋白抗原产生的自身抗体采用蛋白质组技术用患者自身血清(含肿瘤抗原的抗体)筛选食管鳞癌组织(ESCC)中的肿瘤抗原。首先，2D电泳平行分离15份肿瘤组织蛋白，一份银染(图1力和^久一份电转移至PVDF膜上，分别与自身血清与PVDF膜上蛋白反应(图1C，一个患者血清)，同时15份正常人血清作为阴性对照(图1D，一个正常人血清)。在15份食管鳞癌患者血清中7份标本中在同一位置出现一个强反应的点，而15份对照血清中没有一个在此位置出现蛋白反应点。该蛋白点的分子量估计为64.0kDa，PI为6.0(图.10。7例血清阳性患者包含食管鳞癌I期2例，1I期3例，m期2例，说明该抗体可在食管鳞癌早期出现。2).鉴定与食管鳞癌血清反应的蛋白为CDC25B抗原从银染的胶上切下该点，胰酶消化后，MALDI-TOF质谱分析，鉴定其为CDC25B蛋白(NCBIaccessionno.P30305)，分子量64.89kDa，PI为6.0(图.2)。进一步肿瘤组织蛋白二维电泳后，使用CDC25B多克隆抗体进行westernblotting验证，图3A显示该蛋白点与病人血清和多抗反应，证实其为CDC25B蛋白抗原。图3B为7个食管鳞癌抗体阳性病人的血清从1:100到1:1600稀释，Westernblot测定血清中CDC25B抗体滴度，滴度最高的达1:1600(l例)，4例滴度为1:800，l例滴度为1:400，l例滴度为1:200。3)CDC25B在ESCC组织和肿瘤细胞系中的高表达我们先验证CDC25B是否在食管鳞癌细胞株和组织中表达。通过westernblotting和免疫组化研究3个食管鳞癌细胞系和肿瘤组织中CDC25B的表达，结果显示在Eca-109,TE-1,和TE-10这3个细胞系中CDC25B都高表达，并且Eca-109中的表达水平最高，在肿瘤组织中CDC25B也有高表达，正常对照组织未见CDC25B的表达(图.4力)。15个肿瘤组织与癌旁组织的匹配标本中的表达见图.，CDC25B在14/15例的肿瘤组织中高表达，癌旁组织不表达，或表达极低。血清中CDC25B抗体阳性的病人肿瘤组织中CDC25B的表达(T)与癌旁组织(N)比较(T/N)3.1-11.2，而血清中CDC25B抗体阴性的病人CDC25B(T/N)为0.8-5.4。免疫组化也证实CDC25B在食管鳞癌组织高表达。图5力j显示在正常分层食管鳞状上皮不表达CDC25B。同时，血清CDC25B抗体阴性的病人，CDC25B着色主要在细胞核，胞浆染色弱或看不见(图.5C-Z)。而血清中CDC25B-抗体阳性的病人，其肿瘤细胞的胞质和胞核中CDC25B染色强阳性(图.5E-月.这些结果与其他文献中CDC25B在ESCC中过表达的结果是相符的，并且说明产生CDC25B抗体的病人CDC25B在肿瘤组织中的表达水平显著升高。4)血清中CDC25B抗体可做为食管鳞癌的肿瘤标志物应用CDC25B抗体反相捕获的Eca-109中的CDC25B蛋白作为包被抗原，间接ELISA测定102例正常对照血清、124例经病理确定的ESCC患者血清和150例其他消化道肿瘤患者血清中的CDC25B抗体。102例健康对照组，平均吸光度0D为0.12±0.07;抗体阳性定义为OD值大于或等于健康对照组的均值+3SD之和，即域值设定0D为0.33。124例ESCC病人中，45份(36.29%)CDC25B抗体阳性;结肠癌8.0%(4/50)阳性，胃癌12.0%(6/50)阳性，肝癌6.0%(3/50)阳性，102份健康对照组无一例阳性，说明CDC25B可作为食管鳞癌诊断的肿瘤标志物(表1)。表lcdc25b自身抗体在ESCC和其他类型的消化系统癌症的阳性表达对比<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2.建立反向ELISA技术检测血清CDC25B自身抗体的方法用CDC25B单抗(购于SANTA公司)包被ELISA板，加入食管鳞癌细胞株Eca-109(此细胞株高表达CDC25B)裂解后上清蛋白液，CDC25B抗体捕获肿瘤细胞中的CDC25B抗原，作为包被抗原，洗去未结合的杂蛋白，BSA封闭后，加入待检血清，血清中的CDC25B抗体可与CDC25B抗原结合，洗去杂质，加入HRP标记的抗人IgG，形成CDC25B-抗CDC25B抗体-HRP-抗人IgG复合物，洗涤后，加入TMB显色，酶标仪检测。具体方法如下(1)细胞培养食管癌细胞株Eca-109(购于ATCC公司)，RPMI1640培养基含10%新生胎牛血清，5%C02，37°C培养。培养至107细胞。(2)CDC25B抗原制备收集107Eca-109细胞，用生理盐水离心洗涤3次，去上清，加入300W的裂解缓冲液(2%NP40,4%CHAPS,1%DTT，蛋白酶抑制剂PMSF)，冰上作用30分钟，再反复吹打20—30次，12000rpm，4'C离心20分钟，收集上清液。Bradford法蛋白定量。(3)反向ELISA技术检测血清CDC25B自身抗体1)用0.01MpH9.0碳酸盐包被缓冲液将CDC25B抗体稀释至1ug/100u1。在每个ELISA板的反应孔中加100ul,4'C过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗(1XTBS-T，配制方法见表2，下同)3次，每次3分钟。2).每孔加10014食管磷细胞株Eca-109裂解后上清蛋白液(20Pg/孔，100|4/孔)，4。C过夜孵育。3).在每个反应孔中加5%BSA(粉剂购于SIGMA公司)200W，并用封口膜封闭ELISA板，4°C，过夜。4).用洗涤缓冲液洗4次，每次3分钟。5).ELISA板每孔加入l:100稀释的样品血清100W(阳性对照为CDC25B抗体，阴性对照为westernblot验证CDC25B抗体阴性的正常人血清)，室温孵育2小时，洗涤缓冲液洗4次，每次3分钟。6).ELISA板加入羊抗人IgG-HRP(购于SANTA公司)(1:5000)，孔，室温孵育45分钟，用洗涤缓冲液洗5次，每次3分钟。7).加底物液显色于各反应孔中加入TMB底物A、B液(购于中杉金桥公司)各50ul，37。C避光，1015分钟。8).终止反应于各反应孔中加入2M硫酸50ul。9).酶标仪(BIO-TEX公司ELX800)450nm测OD值。表2洗涤缓冲液的配制:10XTBS(pH7,6>腿TBS,7.5)化2L.1L歸g银4g2.4.2g320g湖g幼g36%HC1调虽pH7.6吸Ol,ml;IXPBS200ml;吐温-22ml《或2&S4吐温10ml》(临时加入)，濯勾*图1.蛋白质组技术用食管鳞癌组织蛋白筛选食管鳞癌患者血清中的肿瘤抗原抗体其中A.2D胶肿瘤组织蛋白银染B.2D胶肿瘤组织蛋白银染局部放大C.2D电泳后电转移至PVDF，一个患者血清的westernblot检测D.2D电泳后电转移至PVDF，一个正常人血清的westernblot检测图2.MALDI-T0F质谱分析食管鳞癌血清反应的蛋白为CDC25B蛋白图3A.a.局部银染。b.食管癌血清westernblot,c.CDC25B抗体westernblot图3B.7例食管鳞癌抗体阳性病人的血清中CDC25B抗体滴度图4A.westernblotting检测3种食管鳞癌细胞系中CDC25B的表达图4B.15个肿瘤组织与癌旁组织的匹配标本中CDC25B的表达图5.免疫组化CDC25B在食管鳞癌组织高表达(A，C，E为200X;B,D,F为400X)其中A和B.正常对照组织未见CDC25B的表达C和D.血清CDC25B抗体阴性的病人，CDC25B着色主要在细胞核，胞浆染色弱或看不见E和F.血清中CDC25B-抗体阳性的病人，其肿瘤细胞的胞质和胞核中CDC25B染色强阳性。权利要求1.血清CDC25B自身抗体作为食管鳞癌诊断标志物。2.反向ELISA检测血清CDC25B自身抗体的方法，按照以下步骤进行用CDC25B单抗包被ELISA板，加入食管鳞癌细胞株Eca-109裂解后上清蛋白液，CDC25B抗体捕获肿瘤细胞中的CDC25B抗原，作为包被抗原，洗去未结合的杂蛋白，BSA封闭后，加入待检血清，血清中的CDC25B抗体可与CDC25B抗原结合，洗去杂质，加入HRP标记的抗人IgG,形成CDC25B-抗CDC25B抗体-HRP-抗人IgG复合物，洗涤后，加入TMB显色，酶标仪检测。全文摘要本发明公开了一种血清自身抗体用于食管鳞癌诊断的方法，应用血清学蛋白组技术筛选食管鳞癌患者血清中肿瘤抗原自身抗体。首先，用2-DPAGE电泳分离ESCC组织中的蛋白，转移到PVDF膜上，然后用病人血清和健康人血清作为一抗，westernblot检测肿瘤蛋白反应点，挑选只与肿瘤病人血清反应而不与正常人血清反应的蛋白点，质谱鉴定其氨基酸序列。利用此技术，从食管鳞癌患者血清中首次筛选出CDC25B自身抗体，并验证其特异性。并证实CDC25B自身抗体可作为食管鳞癌诊断的肿瘤标志物。文档编号G01N33/574GK101435822SQ20081021891公开日2009年5月20日申请日期2008年11月5日优先权日2008年11月5日发明者刘万里,宋立兵,曾木圣申请人:广州市搏克生物技术有限公司