专利名称:一种评估pc12细胞的神经元样分化程度的装置的制作方法
技术领域：
本实用新型属于评估细胞分化程度领域，尤其是一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，是基于PC12细胞在神经生长因子(NGF)持续诱导分化作用下表现出不断变化的表面微形貌及电生理特征，采用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术(HPICM)以及与其结合的膜片钳技术，通过鉴定其相应的结构和功能特征参数来评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置。
背景技术：
PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，与神经元细胞在发生学上均来源于神经脊，经神经生长因子(NGF)诱导分化后在结构、功能上与类交感神经元细胞有很多相似之处，又相对易于培养，实践中普遍将PC12细胞用作研究神经元的细胞模型，因此，准确鉴定 PC12细胞的神经元样分化程度对于建立良好的神经元研究模型具有基础性的重要意义。
NGF诱导PC12细胞分化过程主要体现在三个方面的变化胞体微形貌的变化、神经突起的生长和电兴奋性的改变，而且这三方面的变化在神经细胞分化过程中又起到基础性作用。众所周知，在神经细胞分化过程中，离子通道对于细胞膜形貌变化和神经突起的生长起到关键性作用，其中钾离子对于神经突起的生长更为重要。另外，神经元电兴奋性取决于电压敏感性Na+、K+通道的表达和功能的发挥，其兴奋性发育的关键是河豚毒素(TTX)敏感型Na+通道，而NGF可上调PC12细胞中上述Na+、K+通道的表达。
目前，常用的评估PC12细胞神经元样分化程度的方法主要有两种一、在普通光学显微镜下观察细胞胞体的变化和神经突起的生长状态，普遍认为胞体变大，神经突起数量增多、长度增加、相互交错，进而形成类神经网络结构，是PC12细胞达到高度分化的标志；但这种评估更多的借助于经验的积累，缺乏定量判断依据。二、利用膜片钳技术获得 PC12细胞表面Na+、K+通道的信息，大量试验证实神经元样PC12细胞的细胞膜上有功能性电压门控K+通道和TTX敏感型Na+通道，而且，PC12细胞经NGF作用时间越长，细胞分化程度越高，其TTX敏感型Na+电流越大。但是，只有70-80%的神经元样PC12细胞符合这种规律。因此，将两种手段结合起来，对NGF诱导分化作用下的PC12细胞胞体微形貌的变化、神经突起的生长状态和电兴奋性的改变进行定性定量的综合分析可以更加准确地评估PC12 细胞的神经元样分化程度。
然而，利用普通光学显微镜观察细胞微形貌的变化和神经突起的生长状态受到光学衍射极限的限制，其分辨率有限。为了保证既能观察到活体细胞又不会损伤柔软的细胞表面以免影响后续的膜片钳实验，扫描探针显微镜(SPM)技术是很好的选择，其中，非接触式扫描离子电导显微镜(SICM)无疑比接触式的原子力显微镜(AFM)更具有优势。然而，对于连续负反馈控制模式下的SICM而言，很难对垂直高度变化比较剧烈的神经元样PC12细胞进行高分辨率地扫描成像。
实用新型
本实用新型的目的在于提供一种评估PC12细胞神经元样分化程度的装置，它能够解决现有技术的不足，在室温条件下结合运用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术 (HPICM)与膜片钳技术，对NGF诱导分化作用下活体PC12细胞的胞体微形貌变化、神经突起生长状态和电兴奋性改变进行鉴定，从结构和功能两方面综合评估PC12细胞的神经元样分化程度。
本实用新型的技术方案一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于它是由在生理液态培养条件下非接触式、高分辨率对活体生物样品表面微结构进行探测的探针跳跃模式扫描离子电导显微镜HPICM，以及从功能上对NGF诱导分化的PC12细胞电兴奋性进行评估的膜片钳系统两个部分构成的装置；所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/ AgCl电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、HPICM扫描控制系统、Z向 HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台、膜片钳放大器、数模/模数转换器及计算机控制系统； 所述充满电解液的玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中； 所述充满电解液的玻璃微探针装于Z向HPICM扫描探头上；所述置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极分别与膜片钳放大器和HPICM扫描控制系统连接；所述参比Ag/ AgCl电极与膜片钳放大器连接；所述数模/模数转换器分别于与膜片钳放大器和计算机控制系统连接；所述Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台分别与HPICM扫描控制系统连接；所述HPICM扫描控制系统与计算机控制系统连接。
所述玻璃微探针均由硼硅酸盐微电极玻璃毛细管经程控水平激光微电极拉制仪拉制而成，其中用于探针跳跃模式扫描离子电导显微镜的玻璃微探针要求尖端内壁直径 50nm,电阻 150ΜΩ ；用于膜片钳的玻璃微探针要求电阻3 6ΜΩ。
所述HPICM扫描控制系统、Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台采用英国 Ionscope公司的ICnano SICM扫描离子电导显微镜系统；所述ICnano SICM扫描离子电导显微镜系统自带的图像处理软件SICM Image Viewer装于计算机控制系统中。
所述膜片钳放大器采用商用美国Axon膜片钳Multiclamp 700B放大器。
所述数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的Digidata 1440A数模 /模数转换器。
所述计算机控制系统中安装有膜片钳系统的数据采集软件；所述膜片钳系统的数据采集软件采用Clampex 10. 2数据采集及Origin 8. O分析软件。
所述观测细胞表面微结构时，细胞所处的细胞培养液为L15培养基，玻璃微探针内充灌的电解液亦为L15培养基；记录离子通道电流时，细胞所处的细胞培养液是PC12细胞外液，玻璃微探针内充灌的电解液是PC12细胞内液。
本实用新型的工作过程⑴得到适合于利用HPICM技术观测PC12细胞微形貌的玻璃微探针将由硼硅酸盐玻璃毛细管拉制的玻璃微探针内充灌L15培养基，并装于Z向 HPICM扫描探头上，玻璃微探针内置有Ag/AgCl电极；玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极浸于PC12细胞的细胞培养液L15培养基中；通过膜片钳技术测量玻璃微探针的电阻，选用阻值 150ΜΩ的微探针用于后续扫描；(2)利用HPICM技术对NGF诱导分化不同时间点的活体神经元样PC12细胞表面形貌进行扫描成像通过HPICM扫描软件设定扫描参数， 以HPICM扫描控制系统监控流入玻璃微探针电流的微小变化，控制玻璃微探针的跳跃状态，记录下在各个成像点流入微探针的电流减小到设定值时微探针的位置，即为活体神经
4元样PC12细胞的表面三维拓扑结构；细胞的环境浴液和玻璃微探针的内液均为L15培养基；(3)利用HPICM系统自带的图像处理软件SICM Image Viewer扫描成像进行分析，得到各个PC12细胞胞体体积(Volume)、细胞膜表面粗糙度(RMS)、细胞膜表面积(Ssurf)，然后统计分析NGF诱导分化不同时间的PC12细胞的这些形貌数据，得到NGF诱导分化不同时间的PC12细胞胞体体积、细胞膜表面粗糙度、细胞膜表面积的差异性；这种差异性可作为从结构方面评估PC12细胞神经元样分化的参考依据；(4)得到适合于利用膜片钳技术进行全细胞记录的玻璃微探针充灌有PC12细胞内液的玻璃微探针装于Z向HPICM扫描探头上， 玻璃微探针内内置有Ag/AgCl电极；玻璃微探针的尖端、参比Ag/AgCl电极和活体神经元样PC12细胞都浸于PC12细胞外液中；也通过膜片钳技术来测量此玻璃微探针的电阻，选用阻值3 6ΜΩ用于后续离子通道电流的记录；(5)利用膜片钳技术在生理条件下记录活体神经元样PC12细胞的离子通道电流玻璃微探针针尖进入PC12细胞外液后先补偿玻璃微探针的电阻和电容，然后利用HPICM扫描控制系统将玻璃微探针准确定位于细胞胞体上的实验位置，关闭HPICM扫描控制系统，手动控制玻璃微探针以竖直方向缓慢接近细胞胞体， 在接近过程中利用膜片钳系统的数据采集软件Clampex 10. 2持续监测电阻的变化，通过调整玻璃微探针的位置和微探针内的压力使电阻达到GQ即形成高阻抗封接；通过膜片钳记录软件中ZAP功能或人工吮吸将玻璃微探针钳制的膜片打破，形成全细胞记录模式；补偿串联电阻后，通过Clampex 10. 2中预设的记录方法(protocol)，即可记录到生理条件下 PC12细胞的离子通道电流；(6)利用PC12细胞的离子通道电流计算出其对应的内向电流和电流密度，统计分析NGF诱导分化不同时间的PC12细胞的离子通道电流、内向电流和电流密度，得到随着NGF诱导分化时间的延长PC12细胞细胞膜离子通道电流、内向电流和电流密度的变化趋势，以及不同时间点的差异性；这种变化趋势和差异性可作为从功能方面评估PC12细胞神经元样分化的参考依据。
本实用新型的优越性1、利用HPICM技术与膜片钳技术相结合的手段可操作性强，能更加准确的从结构和功能两方面来定性定量的综合分析评估PC12细胞的神经元样分化程度；2、探针跳跃模式扫描离子电导显微镜HPICM用于在活体细胞上观测PC12细胞经 NGF诱导分化不同时间后胞体表面微形貌的变化和神经突起的生长状态；膜片钳系统用于记录经NGF诱导分化后PC12细胞离子通道电流的变化；3、探针跳跃模式扫描离子电导显微镜(HPICM)技术是由扫描离子电导显微镜(SICM)技术改进而来，它不仅秉承了 SICM的可直接在液态生理培养条件下非接触式、高分辨率地探测活体生物样品表面三维微观结构的优点，而且克服了传统SICM连续负反馈控制扫描模式的不足，实现了对高度急剧变化且表面形态复杂的活体生物样品的纳米尺度高分辨率扫描成像；这就为在生理条件下、非接触式、高分辨率观察神经元样PC12细胞提供了更理想的技术手段，同时，由于HPICM良好的开放性使得它可以与膜片钳技术相结合，能够对NGF诱导分化作用下PC12细胞胞体微形貌的变化、神经突起的生长状态和电兴奋性的改变进行综合分析，从而使得在活体细胞上从结构和功能两方面共同探讨PC12细胞的神经元样分化程度成为可能。
附图为本实用新型所涉结合运用探针跳跃模式扫描离子电导显微镜技术(HPICM) 与膜片钳技术评估PC12细胞神经元样分化程度的装置结构示意图。
具体实施方式
实施例一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置(见附图)，其特征在于它是由在生理液态培养条件下非接触式、高分辨率对活体生物样品表面微结构进行探测的探针跳跃模式扫描离子电导显微镜HPICM，以及从功能上对NGF诱导分化的PC12细胞电兴奋性进行评估的膜片钳系统两个部分构成的装置；所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl 电极、参比Ag/AgCl电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、HPICM扫描控制系统、Z向HPICM 扫描探头、XY向HPICM扫描台、膜片钳放大器、数模/模数转换器及计算机控制系统；所述充满电解液的玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所述充满电解液的玻璃微探针装于Z向HPICM扫描探头上；所述置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极分别与膜片钳放大器和HPICM扫描控制系统连接；所述参比Ag/AgCl电极与膜片钳放大器连接；所述数模/模数转换器分别于与膜片钳放大器和计算机控制系统连接；所述Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台分别与HPICM扫描控制系统连接；所述 HPICM扫描控制系统与计算机控制系统连接。
所述玻璃微探针均由硼硅酸盐微电极玻璃毛细管经程控水平激光微电极拉制仪拉制而成，其中用于探针跳跃模式扫描离子电导显微镜的玻璃微探针要求尖端内壁直径 50nm,电阻 150ΜΩ ；用于膜片钳的玻璃微探针要求电阻3 6ΜΩ。
所述HPICM扫描控制系统、Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台采用英国 Ionscope公司的ICnano SICM扫描离子电导显微镜系统；所述ICnano SICM扫描离子电导显微镜系统自带的图像处理软件SICM Image Viewer装于计算机控制系统中。
所述膜片钳放大器采用商用美国Axon膜片钳Multiclamp 700B放大器。
所述数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的Digidata 1440A数模 /模数转换器。
所述计算机控制系统中安装有膜片钳系统的数据采集软件；所述膜片钳系统的数据采集软件采用Clampex 10. 2数据采集及Origin 8. O分析软件。
所述观测细胞表面微结构时，细胞所处的细胞培养液为L15培养基，玻璃微探针内充灌的电解液亦为L15培养基；记录离子通道电流时，细胞所处的细胞培养液是PC12细胞外液，玻璃微探针内充灌的电解液是PC12细胞内液。
以上对本实用新型的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本实用新型的较佳实施例，不能被认为用于限定本实用新型的实施范围。凡依本实用新型申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本实用新型专利的涵盖范围之内。
权利要求
1.一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于它是由在生理液态培养条件下非接触式、高分辨率对活体生物样品表面微结构进行探测的探针跳跃模式扫描离子电导显微镜HPICM，以及从功能上对NGF诱导分化的PC12细胞电兴奋性进行评估的膜片钳系统两个部分构成的装置；所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置包括充满电解液的玻璃微探针、置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极、参比Ag/AgCl 电极、内含细胞与细胞培养液的培养皿、HPICM扫描控制系统、Z向HPICM扫描探头、XY向 HPICM扫描台、膜片钳放大器、数模/模数转换器及计算机控制系统；所述充满电解液的玻璃微探针的尖端和参比Ag/AgCl电极均置于培养皿的细胞培养液中；所述充满电解液的玻璃微探针装于Z向HPICM扫描探头上；所述置于玻璃微探针内浸于电解液中的Ag/AgCl电极分别与膜片钳放大器和HPICM扫描控制系统连接；所述参比Ag/AgCl电极与膜片钳放大器连接；所述数模/模数转换器分别与膜片钳放大器和计算机控制系统连接；所述Z向 HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台分别与HPICM扫描控制系统连接；所述HPICM扫描控制系统与计算机控制系统连接。
2.根据权利要求
1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述玻璃微探针均由硼硅酸盐微电极玻璃毛细管经程控水平激光微电极拉制仪拉制而成， 其中用于探针跳跃模式扫描离子电导显微镜的玻璃微探针要求尖端内壁直径50nm，电阻 150ΜΩ ；用于膜片钳的玻璃微探针要求电阻3 6ΜΩ。
3.根据权利要求
1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述HPICM扫描控制系统、Z向HPICM扫描探头、XY向HPICM扫描台采用英国Ionscope公司的ICnano SICM扫描离子电导显微镜系统。
4.根据权利要求
1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述膜片钳放大器采用商用美国Axon膜片钳Multiclamp 700B放大器。
5.根据权利要求
1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述数模/模数转换器采用美国Molecular Device公司的Digidata 1440A数模/模数转换ο
6.根据权利要求
1所述一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于所述观测细胞表面微结构时，细胞所处的细胞培养液为L15培养基，玻璃微探针内充灌的电解液亦为L15培养基；记录离子通道电流时，细胞所处的细胞培养液是PC12细胞外液，玻璃微探针内充灌的电解液是PCl2细胞内液。
专利摘要
一种评估PC12细胞的神经元样分化程度的装置，其特征在于它是由在生理液态培养条件下非接触式、高分辨率对活体生物样品表面微结构进行探测的探针跳跃模式扫描离子电导显微镜HPICM，以及从功能上对NGF诱导分化的PC12细胞电兴奋性进行评估的膜片钳系统两个部分构成的装置。优越性利用HPICM技术与膜片钳技术相结合的手段可操作性强，能更加准确的从结构和功能两方面来定性定量的综合分析评估PC12细胞的神经元样分化程度。
文档编号G01Q60/44GKCN202256386SQ201120215251
公开日2012年5月30日 申请日期2011年6月23日
发明者刘晓, 张彦军 申请人:国家纳米技术与工程研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan